Method Article

Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler

DOI:

10.3791/51161

⸱

January 29th, 2014

 ,  , 
1Department of Immunopathology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory Academic Medical Center, University of Amsterdam, 2Department of Hematology, Academic Medical Center, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kırmızı kan hücrelerine karşı antikorlar tarafından neden olunan kompleman aktivasyon ölçmek için iki tahlil tarif eder. Mevcut deneylerde üzerinde en büyük avantajı, nicel ve kolay yorumlamak doğasıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) karşı antikorlar, karaciğer (ekstravasküler hemoliz) ya da damar içi eritrositlerde lizise neden olarak tamamlayıcı reseptörleri ile hızlandırılmış bir boşlukla sonuçlanan kompleman aktivasyonu yol açabilir. Damar içi lizise neden - özellikle - kompleman aktivasyonu neden alloantikorları (oto-bağışıklık hemolitik anemi, AIHA görüldüğü gibi) (örn. ABO) veya RBC antijenlere karşı antikorlar, potansiyel olarak zararlı olan ve ölümcül olabilir 1. Şu anda, eritrositlerde nedeniyle on (otomatik)-antikorları için kompleman aktivasyonu RBC üzerinde veya RBC parçalama 1-4 yansıtan bir nonquantitative hemolitik deneyi ile tamamlayıcı çökelmesini yansıtan Coombs testi kullanılarak in vitro tayin edilmiştir. Ancak, kompleman inhibitörleri etkinliğini değerlendirmek için, nicel teknikleri olması zorunludur. Burada iki gibi teknikler tarif eder. İlk olarak, hasta serumunda antikorlar indüklenir kırmızı kan hücreleri üzerinde C3 ve C4 birikmesini tespit etmek için bir deney öncesi olduğusunulmuş. Bunun için, FACS analizi, floresan etiketli anti-C3 ya da anti-C4 antikorları ile birlikte kullanılır. Bundan sonra, bir miktar hemolitik tahlili tarif edilmektedir. Hasta serumu ile indüklenen Bu deneyde, tamamlayıcı aracılı hemoliz serbest hemoglobin spektrofotometrik tespit yapma kullanımı ölçülür. Bu tahlillerin ikisi de antikorun neden olduğu kompleman aktivasyon çalışmalar sağlayarak yeniden üretilebilen ve kantitatif bulunmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) karşı antikorlar, alıcı eritrositlerde üzerinde mevcut olmayan bir antijeni eksprese eritrositlerde transfüzyonu ile indüklenebilir. Bu allo-antikorlar aşağıdaki transfüzyon 5 üzerinde aktivasyonu tamamlamak nedeniyle ciddi akut hemolitik transfüzyon reaksiyonlara neden olabilir. Oto-immün hemolitik anemi (AIHA), hastalar kendi RBCs karşı oto-antikorlar var. Bu durum, dalak ve / veya karaciğer 6,7 tamamlayıcı reseptörleri yoluyla komplemanı aktive edebilmek oto-antikorların durumda fagositoz on-Fcy reseptörleri ile eritrosit bağlı IgG etkileşimi yolu ile hücrelerin hızlandırılmış açıklık yol açar. Intravasküler hem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Bromelain ile tedavi edilen kırmızı kan hücrelerinin hazırlanması

  1. Yıkayın 0-yazdığınız kırmızı kan hücreleri 1x PBS (2-5 dakika boyunca 664 x g santrifüj) ile 3x.
  2. 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.5 bromelain çözeltisi iki hacim ile dolu eritrositlerde 1 hacim inkübe
  3. Hücreler 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
  4. Hücreler en az bir hafta için 1x PBS içinde 4 ° C'de% 3 çözelti halinde saklanabilir.

2. FACS RBCs C3 ve C4 Birikme Analizi

  1. 56 ° C'de 30 dakika boyunca ısıtılarak örnek hasta serumu gerekli miktarda (ya da diğer anti-RBC antikoru kaynağı) Isı-inaktif
  2. (5 mM Veron....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2A RBCs için temsili bir dağılım grafiği göstermektedir. FSC-A arsa (P1) - Tek RBCs için uygun yolluk de FSC-W görülebilir. RBCs genellikle% 95 civarında bu P1 kapısı (tek hücre) içinde kalan, ancak hasta serumunda yüksek oranda kullanıldığında anti-RBC IgM hasta serumunda mevcut olduğunu, özellikle bu,% 70-80 düşüş olabilir.

C4 birikimi ile ilgili AIHA hasta serumunun etkisi için Örnek sonuçlar Şekil 2B'de ve Şekil 2C'de C3 birikimi g.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda bahsedilen deneyler, tekrarlanabilir ve sağlamdır. Bunlar, uygulaması kolay olan ve (a-96 oyuklu bir plaka içerisinde) aynı anda birçok örnekleri ile gerçekleştirmek mümkündür. Dolayısıyla, bu yaklaşım aynı zamanda bir ELISA robot sistemi, örneğin, tam otomatik bir sistem için uygun olacaktır. Şu anda kullanılan tekniklerin aksine, bu deneyler, nicel ve bu tamamlayıcı önleyicileri etkisinin çalışmaya örneğin yardımcı olacaktır. Ayrıca, yorumlama anda kullanılan deneyleri üzerinde bir gelişme o.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZ ve DW VIROPHARMA sınırsız bir hibe alırsınız.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSFresenius Kabi 
BSASigmaB-4287 
BarbitalFagron0261Bu kimyasal ilaç yönetmeliğine tabidir.
Sodyum BarbitalFagron0263Bu kimyasal ilaç yönetmeliğine tabidir.
JelatinMerck1.0470.0500 
Sodyum klorürMerck1.06404.1000 
Magnezyum KlorürMerck1.05833.0250 
Kalsiyum klorürMerck1.0238.0500 
Dylight 488 amin reaktif boyaPierce46402 
Dylight 650 amin reaktif boyaPierce62265 
&alfa; C5 (Eculizumab)Alexion İlaç 
FACS (Canto)BDUygun lazerlere sahip herhangi bir FACS kullanılabilir.
Spektrofotometre (örn. Multiskan spektrumu) Thermo Labsystems1500-193Doğru dalga boyu aralığına sahip herhangi bir spektrofotometre
BD FACSDiva yazılımı v 6.1.2BD643629Herhangi bir uyumlu FACS analiz yazılımı kullanılabilir
Bromelain SanquinK1121 
kullanılabilir

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Complement ActivationAntibody DepositionFlow CytometryHemolytic AssayRed Blood CellsC3 C4 DetectionQuantitative AnalysisSpectrophotometric DetectionPatient SerumAnti C5 Antibody

Related Articles