Yöntem makalesi

İndirimli Itraconazole Konsantrasyon ve Süreleri Tedavisi Başarılı mısınız

11.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51166

⸱

14 Mart 2014

1School of Public Health, Tropical Medicine and Rehabilitation Sciences, James Cook University

Bu makalede

Özet

Amfibiler Batrachochytrium dendrobatidis enfeksiyon, azaltılmış konsantrasyonu (% 0.0025) ve genel olarak kullanılan daha itrakonazol daha kısa süre (altı gün boyunca beş dakika banyolar) kullanılarak ortadan kaldırılabilir. Daha az mortalite ve daha az olumsuz yan etkileri bu modifiye tedavi protokolü kullanılarak gözlenmiştir.

Özet

Amfibiler herhangi bir omurgalı sınıfının büyük düşüş yaşandığı ve bu düşüşler önde gelen nedeni hastalık chytridiomycosis neden olan bir mantar patojen, Batrachochytrium dendrobatidis (BD), olduğunu. Esir güvence kolonileri tehdit amfibi türlerinin için dünya çapında önemli olan ve nesli kritik tehlike olanlar için tek can simidi olabilir. Hastalıksız koloni bakımı esir yöneticileri bir önceliktir, tüm türler için ve yaşam evreleri arasında henüz güvenli ve etkili tedaviler tespit edilmemiştir. Yaygın olarak kullanılan bir dozaj, bazı bireyler ve türler için zararlı olabilir, ancak en yaygın olarak kullanılan kemoterapötik tedavi, itrakonazol olduğu. Biz itrakonazol daha düşük ve daha güvenli ama etkili doz Bd enfeksiyonları tedavi bulunamadı olmadığını değerlendirmek için klinik tedavi deneme gerçekleştirildi. Bulduğumuz bu 0.01-0.0025 'den% tedavi konsantrasyonu giderek düşürülür ve 11 ila tedavi süresini azaltarak5 dk hamam -6 gün, kurbağalar daha az yan etkileri ve daha az tedavi ile ilişkili mortalite ile Bd enfeksiyon tedavi edilebilir.

Giriş

Amfibiler şu anda tüm omurgalı takson 1 biyoçeşitliliğin büyük düşüş yaşıyoruz. . Chytridiomycosis, chytrid fungal patojen Batrachochytrium dendrobatidis (BD) neden olduğu bir deri hastalığıdır, Bd biyoçeşitlilik kaybına neden rekor kötü patojen olan bu dramatik düşüşler 2 önemli nedenlerinden biridir: amfibiyenlere 600 tür üzerinde bozar ve var 200 kadar türü kritik tehlike altında veya 2,3 soyu tükenmiş olan 300'den fazla türün düşüşler neden oldu. Amfibi chytrid mantar özgü ev sahibi değil ve ciddi hastalığa neden ilerleme Bd enfeksiyon için izin konağın hangi nitelikleri belli değildir. Chytridiomycosis elektrolit kaybı ve kalp yetmezliği ile sonuçlanan 4, deride iyon kanallarını bozarak ölüme neden olur. Aynı zamanda, (herhangi bir Bd zoosporlar ihtiva) Bd yüzer tetarlar bir bağışıklık tepkisi 5 Leadin neden olurg araştırmacılar Bd ürün 6 toksik üretir inanıyorum.

Birçok türün hızla azalmaktadır Çünkü, esir güvence koloniler ve ıslah programlarında önemli koruma önlemleri ve bazı türler için tek can simidi olabilir. Kurulması ve hastalıksız koloni bakımı amfibi yönetimi tesisleri için bir sorundur. Bd enfeksiyonların tedavisi için mevcut kemoterapötik yöntemler, etkili olmasına rağmen, tedavi edilen hayvanlar için zararlı olabilir ve tek bir tedavi yöntemi türleri ve amfibi 7 yaş sınıflar arasında başarılı olmuştur.

Bd enfeksiyonu için tedaviler birkaç klinik denemeleri 7 gerçekleştirilmiştir. Tedavinin üç en sık kullanılan yöntemler, ısı terapisi, kloramfenikol ve itrakonazol vardır. Isı terapisi az yan etkileri, çoklu hayat aşamalarında kullanılabilir olması için görünen bir nonchemotherapeutic tedavi seçeneği olduğunu ve homo olduğunumüttefiki etkili. Bir tedavi denemede, Chatfield ve Richards-Zawacki 8 ile muamele edilen hayvanların% 96, 10 gün boyunca 30 ° C 'de muhafaza edildikten sonra enfeksiyonların temizlenir olduğunu buldu. Bu deneme% 100 başarılı olmasa da, başkalarının, kendi türleri için ısı terapisi değerlendirmek için bir temel sağlar. Isı tedavisi, birçok türün için etkili olmalarına rağmen, uzun bir süre boyunca yüksek sıcaklıklarda kalamaz birçok dağ türler için pratik değildir. Kloramfenikol, bir bakteri öldürücü, bir çok türde Bd tedavisinde başarılı bir şekilde kullanılmıştır, ve in vitro olarak mantar gelişimini inhibe edilmiştir. Bir antibakteriyel olarak, kloramfenikol, özellikle mantar zarar vermez, ancak ökaryotik hücrelerde apoptosisi 9 neden olduğu bilinmektedir. Bu eylem mekanizması tam olarak bilinmemektedir, ancak kloramfenikol tedavisi, hücre içi sporangia öldürme, deri apoptoza neden olduğu iddia edilmiştir. Herhangi bir klinik deneme, bu nedenle yapılmıştır ve olmasına rağmendoz ve tedavi süresi, değerlendirilmemiştir güncel tedavi protokolleri genellikle karasal amfibiler için bu tedavi pratik yapma, 2-4 hafta 10,11 için suya batmaya gerektirir. İnsan maruz aplastik anemi 12 nadir bir formu ile ilişkili olduğu için kloramfenikol de veteriner kullanımı için bazı ülkelerde sınırlı olmuştur.

İtrakonazol, bir azol antifungal, en yaygın olarak tutsak amfibiler Bd enfeksiyonunun tedavisi için kullanılmaktadır. En yaygın olarak kullanılan protokol beş dakika 11 gün boyunca günde bir% 0.01 itrakonazol çözeltisi içinde banyo hayvan. Bu protokol, amfibiler için etkili iken, amfibiler 11,13 klinik çalışmalarda dayanmamaktadır, memeli uygulama için kullanılan standart elde edilmiş ve. Bu protokol, özellikle genus Rana ve tetarlar ve son Metamorphs 11, bazı türlerde olumsuz yan etkilere neden olabilir.Tadpole tedavi itrakonazol çok daha düşük bir konsantrasyonda (% 0.0005) kullanılarak başarılı olmuştur, ama depigmentasyon 14 ile ilişkilendirilmiştir. Bu aynı konsantrasyon son Metamorphs üzerinde trialed ve enfeksiyonu 15 tedavi de başarısız olduğu bulunmuştur. Itrakonazol tedavisi ile olumsuz yan etkilerin riski olduğundan, bazı hekimler 11 gün boyunca bir yarım olağan konsantrasyon (% 0.005) kullanılan ve bu Bd ENFEKSĠYONLARI 16 kür başarılı bulduk.

Bu çalışma Bd enfeksiyonunu tedavi etmek için 15 itraconazol'den kullanarak bir klinik tedavi çalışmasının bir özetidir. Protokol itrakonazol ile Bd enfekte hayvanların tedavisinde güvenli ve etkili hem de en düşük doz ve tedavi süresini bulmak için bir girişimde açıklanır. Bu çalışmada kullanılan hayvanların körfez sahili toads son Metamorphs, Incilius nebulifer idi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik Onay: Bu çalışma ve yöntemleri Tulane Üniversitesi Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi (. Protokol no 0407) tarafından onaylanmıştır.

1.. Bd Enfeksiyon için test

  1. Bd için sürüntü
    1. Steril pamuklu çubukla sürüntü hayvanlar Ventrum beş kez, her uyluk, her tarafta, ve 45 darbeleri toplam her bacak üzerinde beş kez. Swab amfibi ciltte Bd için örnekleme noninvaziv bir yöntemdir.
    2. Yavaşça DNA'nın büyük miktar bez üzerinde toplanan sağlamak vuruşları sırasında ve arasında çubukla döndürün.
    3. -20 ° C'de 1.5 ml mikrotüplerde Mağazası bezlerden
  2. DNA Ekstraksiyon ve qPCR tahlil
    1. Hayvan dokusu için talimatlara uygun olarak, ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak bezlerden alınan genomik DNA ekstrakte edin.
    2. Boyle aşağıdaki kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) kullanılarak ekstre DNA analiz ve arkadaşları 17, aşağıdaki değişikliklerle birlikte yapılmıştır.:
    3. Çift deiyonize su ile DNA ekstraksiyon numuneleri 01:10 sulandırmak.
    4. PCR inhibisyonunu önlemek için, sığır serum albümini (BSA) içinde 0.7 ul ekleyin.
    5. PCR inhibisyonu sonucu etkilemeyen kalmadığından emin olmak için, her numune içinde bir dahili pozitif kontrol içerir.
    6. Pozitif ve negatif kontrol ve zoospore (enfeksiyon) yük tahmin etmek için seyreltme standartlar serisi ile örnekler.

2. Aşılama

  1. Kültür Bd
    1. (40 dakika boyunca 121 ° C) otoklava ve soğumaya bırakılmıştır, 1 L ters ozmoz veya deiyonize edilmiş su, 10 g tripton eklenerek tripton suyu hazırlayın. Bir kez 23 ° C'ye kadar soğutuldu, 1 ml penisilin-streptomisin ilave edin.
    2. 23 ° C'de yedi gün boyunca tripton suyu içinde (a Phyllomedusa maki ikinci Guabal, Panama izole J. Longcore ikinci JEL411) Bd suşu büyümek
  2. B aktarınRoth kültür Tripton ve agar plakaları için.
    1. Plakaları yapmak için, 1 L ters ozmoz veya deiyonize su ve otoklav (40 dakika boyunca 121 ° C) 10 g tripton ve 10 g agar ekleyin.
    2. Otoklava karışım dokunmak için yeterince serin, ama congeals önce, bir laminer akış kaputu, Petri kutularına tam 1/4-1/3 dökün kez.
    3. Agar tamamen pıhtılaşmış ve soğuduğunda, her plakaya 0.5 ml Bd suyu ekleyin ve plaka çevresinde yayılır. Kurumasını bekleyin.
    4. Plakalar Bd zoospores, Parafilm ile mühür plakaları ile aşılanır kez.
    5. Plakalar 5-7 gün boyunca 23 ° C'de inkübe izin verin. Aşılamadan önce canlılığı sağlamak için hareket zoospore edin.
  3. Zoospore aşılama çözümü için Sel plakalar
    1. Bd inkübasyon ve büyüme 5-7 gün sonra, dokunun yaş 5 ml su ile her bir plak sel ve zoospor, 10 dakika boyunca ortam girmesine izin verir.
    2. Zoospore suspe döküntaşınabilir bir kap içine nsion.
    3. Bir hemasitometre ile zoospore konsantrasyonu tahmin.
    4. Yaşlı musluk suyu ile 1 x 10 6 başına 3 ml 'lik bir konsantrasyona kadar seyreltin.
  4. Hayvanları aşılamak
    1. Tek tek 50 ml kaplarda, kendi Ventrum boyunca 3 ml aşılama karışımının dökülmesiyle her hayvanı aşılamak. İlave aşılama aşılama kabın tabanına damla izin verin.
    2. Her bir hayvan, enfeksiyonun sağlama alınması için 24 st için aşı kapta kalır.
    3. Aşılamadan 24 saat sonra, ayrı ayrı hayvanlar için dezenfekte terraryumlarda döndürür.
    4. Enfeksiyon iki hafta boyunca inşa etmek için izin verin. Çubukla ve qPCR sonuçları ile enfeksiyon onaylayın ve tedaviye başlar.
    5. BD-Negatif kontroller için 5 ml sel Bd içermeyen agar plakaları yukarıdaki gibi aynı yöntem kullanılarak musluk suyu ve mock aşılanması yaşlı hayvanlar.

3. Tedavi Rejimi

  1. Prepamuamele banyosu re
    1. 1 L Amphibian Ringer Çözeltisi (- en etkili tedavi konsantrasyonu% 0.0025 itrakonazol) 2.50 ml sulu itrakonazol (% 1 Sporanox Oral çözelti) eklenir.
      1. Amphibian Ringer Solüsyonu tarifi: 1 L ters osmoz veya iyonu giderilmiş su, 6.6 g sodyum klorür, 0.15 g potasyum klorür, 0.15 g kalsiyum klorür ve 0.2 g sodyum bikarbonat. Otoklav çözeltisi (40 dakika boyunca 121 ° C) ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
      2. % 0.01 itrakonazol muamele konsantrasyonu için, 1 L Amphibian Ringer solüsyonuna 10,00 ml sulu itrakonazol (% 1 Sporanox Oral çözelti) ekleyin
      3. % 0.005 itrakonazol tedavi konsantrasyonu için, 1 L Amphibian Ringer solüsyonuna 5.00 mL sulu itrakonazol (% 1 Sporanox: Oral solüsyon) ekleyin.
    2. Bd-pozitif ve Bd-negatif kontroller, hiç itrakonazol ile Amphibian Ringer Çözeltisi içine hayvanlar banyo.
  2. Tedavi
    1. Muamele çözeltisinin 35 ml'si ile dezenfekte 50 mi kaplarda tek tek amfibiler yerleştirin.
    2. Emin hayvanlar tamamen hafifçe kabı dönen beş dakika boyunca kaplıdır.
    3. Dezenfekte terraryumlarda hayvanları dönün. Altı gün boyunca tekrarlayın.
  3. Tedavi başarısını sağlamak
    1. Günlük tedavi Bd bulaşmasına Test hayvanları başlar.
    2. Enfeksiyon sağlamak için dört hafta boyunca haftada temizlenir Bd enfeksiyon için test hayvanları bir hafta tedavi tamamlandıktan sonra, ve bir kez.

Bir Biohazard olarak 4. Bd

  1. Bireysel terraria haftalık dezenfekte edin.
    1. % 10 çamaşır suyu solüsyonu banyosunda terraria ve tedavi kaplar batırın.
    2. Akan su ile iki kez, her ağartılmış kabı durulayın.
    3. Kaplar tekrar kullanmadan önce 24 saat kurumasını bekleyin.
  2. Çapraz bulaşmayı önlemek için hayvanları tutarken temiz nitril eldiven giyinBd patojenin. Her hayvan taşıma arasındaki eldiven değiştirmek.
  3. % 10 çamaşır suyu ile çözüm getirerek atmadan önce tüm sıvı atık dezenfekte edin.
  4. Potansiyel Atmadan önce bd'ye maruz kaldığı tüm katı atık otoklavlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tüm hayvanlar dört hafta sona tedavi sonrasında BD-negatif olsaydı Itrakonazol tedavi başarılı kabul edildi. Tedavi başlamadan önce, tedavisi bittiği, dört hafta sonra, Bd pozitif kontrol hayvanları 16,765.12 bir ortalama zoospore yük varken, aşılamadan iki hafta sonra, her Bd ile aşılanmış hayvanları, ((17,34 ±) 1,121.7 bir zoospore ortalama bir yük ile, enfekte edilmiştir ) 14643,08 ±.

Incilius nebulifer tedavisi (n = 15), altı gün boyunca beş dakika sür...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolü kullanarak biz güvenle ve etkili amfibialarda Bd için itrakonazol tedavisi tedavi dozunu ve süresini azaltmak için başardık. Düşük tedavi dozu ve süresi (altı gün boyunca 0.0025%) subklinik enfekte I. başarılı bir tedavi oldu nebulifer. Daha düşük bir doz ve tedavi süresi hem de etkinliği Amfibilerin bütün türlerin ve yaş sınıfları için kullanılacak hiçbir güvenli ve etkili tedaviler şu anda olduğu gibi, Bd enfeksiyon tedavileri için klinik tedavi denemeleri için ihtiyaç ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar, hiçbir rakip mali çıkarlarını bildirir.

Teşekkürler

Ben yardım için deneysel tasarım kavramsallaştırma ve malzeme ile yardımcı bir tedavi rejimi ve otopsi kurulması yardım A. Pessier analizleri, MWH Chatfield, MJ Robak, K. kılıfları ve D. Lenger yardım için CL Richards-Zawacki teşekkür etmek istiyorum laboratuar ve çekimler sırasında kendi alanı kullanımı için destek ve Taronga Hayvanat Bahçesi'nde M. McFadden ve P. Harlow. Proje kısmen LA Brannelly verilen Louisiana Çevre Eğitim Komisyonu hibe yoluyla ve Yaşam Teknolojileri tarafından Yaban Hayatı ve Balıkçılık Louisiana Bakanlığı tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.1 Sulu Itrakonazol, SporonoxJanssen Pharmaceutica Inc.
NaClFisher ScientificS640-500
KClFisher ScientificBP366-1
CaCl2Fisher ScientificBP510-100
NaHCO3Fisher ScientificBP328-500
Steril pamuklu çubuklarTıbbi ve Tel EkipmanlarıMW113
1.5 ml MikrotüplerSarstedt73.703.217
Qiagen DNEasy Kan ve Doku KitiQiagen69581
7500 Gerçek Zamanlı PCRUygulamalı Biyosistemler4351104
VIC IPCUygulamalı Biyosistemler4308323
BSAUygulamalı BiyosistemlerAM2618
AgarInvitrogen30391023
TriptonInvitrogenQ10029
Penisilin-streptomisinInvitrogen15070-063
Petri KabıSigma AldrichCLS430589

Kaynaklar

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
  4. Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
  5. Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
  6. McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
  7. Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
  8. Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
  9. Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
  10. Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
  11. Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).
  12. Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
  13. Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
  14. Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
  15. Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
  16. Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
  17. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
  18. Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
  19. Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
  20. Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

trakonazol TedavisiAmfibi EnfeksiyonuQPCR AnaliziDeri S r nt s TestiFungal PatojenTedavi S resiKonsantrasyon AzalmasKitridiomikoz TedavisiBiyotehlike nlemleri

İlgili makaleler