Method Article

BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu

DOI:

10.3791/51170

⸱

March 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1BioSentinel Inc., Madison, WI

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BoTest Matrix botulinum nörotoksin (BoNT) algılama deneyleri hızla arındırmak ve numune matrisleri bir dizi BoNT'yi ölçmek. Burada, katı ve sıvı matrislerden BoNT tayini ve ölçümü için bir protokol mevcut ve BOTOX, domates ve süt ile deneyi göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğru tespiti ve karmaşık matrisler botulinum nörotoksininden (BoNT) ölçümü ilaç, çevresel ve gıda örnek test için gereklidir. Doğru gücü test BoNT-bazlı ilaç ürün üretim ve hasta güvenliği için gerekli ise, gıda maddelerinin hızlı BoNT'den testi salgını adli tıp, hasta tanı ve gıda güvenliği test sırasında gereklidir. BoNT testi için yaygın olarak kullanılan fare biyodeney son derece hassas ama hızlı ve rutin BoNT'den test için gerekli hassasiyet ve üretim yoksun. Ayrıca, hayvanların bioassay kullanımı BoNT'den test için fare biyodeney yerine ABD ve yurtdışında uyuşturucu ürün düzenleyici otoriteler ve hayvan hakları savunucuları tarafından aramalar sonuçlandı. Birçok in vitro tahliller yerine basit tamponlar içinde saflaştırılmış BoNT ile iyi çalışır geliştirilmiştir, ama en çok karmaşık matrisler test edilmesi için geçerli olduğu gösterilmiştir edilmemiştir. Burada, tespit edilmesi için bir protokolBoTest Matrix tahliller kullanılarak kompleks matrislerde BoNT sunulmuştur. Deney üç bölümden oluşur: ilk bölümü test için numune hazırlanmasını gerektirir, ikinci bölümü matris BoNT'yi arındırmak için bir anti-BoNT antikor kaplı paramanyetik boncuklar kullanarak bir immunopresipitasyon adımdır, ve üçüncü bölümü izole BoNT en proteolitik rakamlarla Bir florogenik raportör kullanılarak faaliyet. Protokol, sıvı ve katı hem matrisler kullanılarak 96 oyuklu plakalarda yüksek verimli testler için yazılı ve 4-26 saat arasında, toplam deney katı numune türü, toksin yükü ve arzu edilen duyarlılığına bağlı olarak manuel preparatın yaklaşık 2 saat gerektirir. Veriler, fosfat tamponlu tuzlu su, bir ilaç ürünü, kültür yüzer,% 2 süt, taze domates ile BoNT / A test için sunulan ve deney başarısı için kritik bir parametre içeren bir tartışma vardır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Botulinum nörotoksinler (BoNTs) 1-3 ng tahmin damar insan öldürücü dozları ile bilinen en ölümcül maddelerdir / 1,2 kg arasındadır. BoNT yedi serotip yapısal olarak benzer, her bir hücre, bir çinko endopeptidaz 3-5 kodlayan sitosol ve bir hafif zincir içine alımı ve translokasyon bağlanması için sorumlu bir ağır zincir alanı kapsayan, biri, G olarak etiketlenmiş. BoNT'nin nefis toksisite kısmen, sonuçları, nöromüsküler kavşağı 6 motor nöronların içine kendi özgül bağlanma ve giriş. Bir kez nöron içinde, hafif zincir endopeptidaz spesifik olarak ayrıştıran, çözünür N-etilmaleimit duyarlı faktör bağlanma protein reseptörü (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Deneyi Reaktiflerin hazırlanması

  1. Çözülme 200x ditiyotreitol (DTT), 10x Matrix Bağlama tamponu (10x bağlanma tamponu Bundan sonra), 10x nötralizasyon tamponu (pH yiyecek veya dengesiz örnekleri için) ve 15 dakika boyunca BoTest 10x reaksiyon tamponu, oda sıcaklığında (10x reaksiyon tamponu Bundan sonra) (RT) kadar veya tamamen çözülmüş. Bu protokolde kullanılan tamponlar ve reaktiflerin bir listesi için Tablo 1'e bakınız. Bu protokol için gerekli malzeme ve ekipman listesi için Tablo 2'ye bakınız.
  2. Karıştırmak için 5 saniye için çözülmüş tamponlar vorteks. 10x Binding tampon bulutlu bir görünüme sahip o....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokol adımları özetleyen bir diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir. Analiz numunesi tipine ve istenen tahlil duyarlılığına bağlı olarak tamamlamak için 4-26 saat arasında gerektirir, fakat sadece ~ 2 saat süre eller üzerinde. Deney, 96 oyuklu plakalarda ve test yapılmaktadır tipine bağlı olduğu, plaka başına standartlar dahil olmak üzere 20 kadar numune, üçlü test sağlar.

Şekil 3, BoNT kullanılarak temsili deney sonuçları göstermektedir / A holoto.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol BoNT'yi / karmaşık matrisler bir kompleks, holotoksin veya Clostridium kültür süpernatant ölçülmesi için prosedürler açıklanmaktadır. Deney hassasiyeti serotipleri ve tahliller arasında değişir, ancak ilgili Matrix deneyleri 56,60 diğer BoNT serotipleri (örneğin, BoNT / B, E, ve F) test sırasında protokol, ancak, aynıdır. Bu protokol olası numune her türü için hesap değil ve bazı modifikasyonlar belirli örnek kompozisyon ve arzu edilen uygulamaya bağlı olarak gerekli olabilir.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin ve WC Tucker BioSentinel Inc BioSentinel çalışanları veya sahipleri şu anda üretir ve bu raporda sunulan reaktiflerin bazı ticari gelmiştir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar değerli tartışmalar ve tavsiye için H. Olivaresi ve D. Ruge teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma, bir NSF SBIR ödülü (BioSentinel Inc IIP-1127245) ve Savunma Bakanlığı sözleşme (BioSentinel Inc W81XWH-07-2-0045) tarafından kısmen desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BoTest Matrix A Botulinum Nörotoksin Tespit KitiBioSentinelA1015BoNT/B ve F için Tespit kitleri de mevcuttur.
Varioskan Flash floresan mikroplaka okuyucuThermo Fisher Scientific5250040434 nm uyarma ve 470 nm ve 526 nm emisyon kapasitesine sahip çoğu monokromatör veya filtre tabanlı ünite kullanılabilir.
96 kuyulu Manyetik Boncuk Ayırma PlakasıV& P ScientificVP771HDiğer manyetik plakalar da kullanılabilir, ancak plaka, boncukları kuyunun kenarına ayıracak şekilde tasarlanmalıdır.
Manyetik Boncuk Uyumlu Plaka YıkayıcıBioTekELx405 VSRMİsteğe bağlı, sadece otomatik plaka yıkama için gereklidir. Diğer manyetik boncuk uyumlu plaka rondelaları da kullanılabilir, ancak kullanımdan önce test edilmelidir.
Mikrosantrifüjİsteğe bağlı, yalnızca santrifüjleme gerektiren numuneler için gereklidir.
MixMate plaka karıştırıcıEppendorf22674200
Orbital ÇalkalayıcıOda sıcaklığında veya 25 ° C'de kullanılır; C Sıcaklık kontrolü mevcutsa,
EDTA içermeyen Proteaz İnhibitör TabletleriRoche4693132001Yalnızca gıda veya çevre testleri için gereklidir. Proteaz inhibitörleri EDTA içermemelidir.
BoNT/AMetabiyolojiklerİsteğe bağlı, yalnızca standardizasyon ve miktar tayini için gereklidir
Siyah, Düz Tabanlı 96 Kuyulu PlakalarNUNC237105Plakaları işlem görmemelidir
96 Kuyulu Plaka Sızdırmazlık BandıThermo Fisher Scientific15036

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Botulinum NeurotoxinBoTest Matrix AssaysImmunoprecipitationMagnetic BeadsFluorogenic ReporterSample PreparationProteolytic ActivityComplex MatricesHigh Throughput96 Well Plates

Related Articles