Yöntem makalesi

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme C. elegans Embriyo

DOI:

10.3791/51188

⸱

12 Mart 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Caenorhabditis elegans, gelişmekte olan embriyo bölünen hücreleri görüntüye floresan mikroskobu kullanımını tarif eder. Özellikle, bu protokol epidermal hücrelerin altında bulunan ve epidermal morfogenezisi önemli olabilir neuroblasts, bölünmesi nasıl görüntü üzerinde duruluyor. Doku oluşumu metazoan gelişimi için çok önemlidir ve komşu dokuların dış işaretlere dayanmaktadır. C. elegans mikroskobu ile çalışmak için kendi dokuları kolay hale nedeniyle şeffaflık ve basit organizasyon in vivo doku morfogenetiğine incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Ventral muhafaza embriyonun ventral yüzey epitel hücrelerinin tek bir tabaka ile kaplanmıştır süreçtir. Bu olay örten epitel hücrelerinin göçüne aracılık kimyasal rehberlik ipuçları sağlamak temel neuroblasts, kolaylaştırılabilir düşünülmektedir. Bununla birlikte, son derece nöro-proliferatif ve aynı zamanda hareket edebilirventral epidermal hücreler için mekanik bir alt-tabaka olarak. Bu deney protokolü kullanılarak yapılan çalışmalar, doku oluşumu sırasında arası iletişimin önemini ortaya çıkarmak olabilir, ve gelişmekte olan dokular içinde hücre bölünmesi ile ilgili genlerin rollerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasıl görüntü hücre bölünmesi için erken C. anlatan protokoller var olsa elegans embriyo, bu protokol nasıl görüntü hücre bölünmesi orta Embriyogenez sırasında bir doku içinde açıklanır. Gelişimi sırasında organizmaların görüntülenmesinde önemli zorluklardan biri fototoksisite onların duyarlılık olmuştur. Ancak, dönen bir disk konfokal mikroskoplar veya süpürüldü alan mikroskoplar artan erişilebilirlik daha yaygın görüntüleme uygulamaları izin verdi. Her iki sistem de organizmalar maruz kaldığı UV sınırlandırarak, katı hal lazerleri ve dağınık ışık kullanır. Ancak, Widefield standları hala yüksek duyarlılık (örn. EMCCD), diyafram denetimi ve ışık kontrolü (örneğin, LED'ler veya ayarlanabilir cıva ampul) ile kameralar ile donatılmış olan, özellikle in vivo görüntüleme için kullanılabilir. Bu protokol, C, gelişmekte olan görüntü hücre bölünmesi için bir konfokal tabanlı bir sistem veya bir widefield sistemi ya nasıl kullanılacağını açıklar elegans </ Em> embriyolar. Örnek olarak, biz nasıl resim neuroblast hücre bölünmesini açıklayınız. Nöro-blastlar örten epidermal hücrelere, kimyasal ya da mekanik ipuçları sağlayarak epidermal morfolojilerinden kolaylaştırmak ve dokuların oluşumunda arası iletişimin önemi mükemmel bir örnek sağlayabilir.

Caenorhabditis elegans şeffaflığıyla ve basit doku organizasyonu 1 nedeniyle mikroskopi tabanlı çalışmalar için ideal bir model organizmadır. Ayrıca, C. elegans genetik yöntemler ve RNAi için uygun olan, ve genlerin çoğu insan homologlarını beri, bu doku oluşumu için 2-5 korunmuş mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir. C. In Embriyo> 300 hücreleri olduğunda elegans, epidermis oluşumu, orta embriyojenez sırasında oluşur. Epidermal morfogenez embriyo büzülür epidermal hücrelerin bir tabaka içine ve embr dönüştürmek için uzanan bir süre boyunca birkaç büyük aşamadan oluşurBir solucan 6'nın uzun oval bir şekil formundan yo. Ventral epidermal hücreler embriyonun ventral yüzeyi (Şekil 1) kapsayacak şekilde ventral orta hat doğru geçiş yaparken, ventral muhafaza, bu morfogenetik olaylardan birini açıklamaktadır. İlk olarak, anterior bulunan öncü hücrelerin iki çift kontralateral komşularıyla 6 ile ventral onlar uygun orta hat ve sigorta doğru göç. Bu, ventral cep 6-7 oluşturma şekiller gibi kama oluşturan merkezi bir arka cep hücrelerinin taşınması takip eder. Cebi kapatır mekanizması iyi anlaşılmamıştır. Bir olasılık, bir supracellular aktin miyozin kasılma yapısı 8 yara iyileştirici benzer, moda gibi bir çanta dize birlikte cep hücreleri bağlar olduğunu. İlginç bir şekilde, cep hücrelerin bazı göç epidermi altında bulunan temel neuroblasts 9 (nöronal ön-maddeleri arasında, belirli alt-aracılık eders, Şekil 1 B).

Önceki çalışmalar nöro. VAB-1 (efrin reseptörü) ve VAB-2 (efrin ligand) yüksek neuroblasts olarak ifade edilmiştir ve birbirinden anterior ve posterior neuroblasts sıralama kolaylaştırmak edilir ventral epidermal hücre göçü ve ventral muhafaza düzenleyen gösterdi, ve VAB-1 veya VAB-2 neden ventral muhafaza mutasyonlar 10-13 fenotip. Bununla birlikte, promotör kurtarma deneyler VAB-1, aynı zamanda neuroblasts salgıladığı diğer rehberlik ipuçlarının için üstte ventral epidermal hücreleri ve reseptör olarak gerekli olduğunu göstermiştir ventral epidermal hücrelerinde 9 olarak ifade edilmiştir. Bu reseptörlerin herhangi mutasyonlar ventral muhafaza fenotiplerini neden olsa da kusurları nedeniyle neuroblast konumlandırma veya bağlı rehberlik yanıt ventral epidermal hücrelerin başarısızlık 14 istekalar Sorunlara ortaya çıkması durumunda, bu açık değildir. Nöroblastlar wi bölümü değiştirilmesirehberlik ipuçları salgılama yeteneğini etkileyen thout neuroblasts rolü ve epidermal morfolojilerinden sırasında mekanik girdi sağlama yeteneği ışık tutabilir. Son zamanlarda, bir hücre bölünmesi geni, ani-1 (anillin) yüksek neuroblasts (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir ve tükenme neuroblast bölme kusurlarına neden olduğu bulunmuştur. İlginçtir, bu embriyolar ventral muhafaza fenotipleri (Fotopoulos, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) gösterilecek.

Anillin hücre bölünmesi için gerekli olan ve özellikle de, bir ana hücre fiziksel olarak iki yavru hücrelere bölündüğü işlemi tarif sitokinez, içindir. Sitokinler sıkıca düzgün kardeş kromatid ayrılması ile birlikte olduğundan emin olmak için mekan ve zaman olarak kontrol edilmesi gereken bir aktomizin kontraktil halka oluşumu ile tahrik edilir. Metazoan sitokinez ana düzenleyicisi RhoA (C. elegans RHO-1), bir küçük bir GTPaz olduğunuonun GTP-bağlı formda yönerge. GEF Ect2/ECT-2 RhoA-GTP kontraktil halka oluşturur ve girişini 15 aracılık eden alt baş efektörlerinin ile etkileşime sonra, RhoA etkinleştirir. Anillin C-terminalinde ile ve N-terminal ile aktin ve miyozin için RhoA bağlanan bir çok alan bir proteindir. Anillin memeli veya Drosophila S2 hücreleri 16 kontraktil halkanın konumunu stabilize etmek için gereklidir. Anillin tükenmesi yanal salınımlar geçmesi kasılma yüzük olur, ve sitokinez sonunda çok çekirdekli hücreler 17-19 oluşturulması başarısız. İlginç bir şekilde, her ne kadar C. elegans ani-1 it sitokinez için gerekli değildir, erken embriyo aktomizin kasılmasını koordine eder. Yukarıda açıklandığı gibi Ancak, ani-1 orta Embriyogenesis (Fotopoulos, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) sırasında neuroblast sitokinez için gereklidir. Sitokinez başarısızlık neuroblasts sayısını ve konumunu değiştirecek ve loc etkileyebilecekKimyasal rehberlik ipuçlarının tirme ya da doku mekanik özelliklerini değiştirebilir. Her iki model de ventral muhafaza için neuroblasts otonom olmayan rolünü, ve embriyonik gelişim sırasında doku doku iletişimin önemini vurgulamak.

Bu deneysel protokol anlatıyor görüntü hücre bölünmesi sırasında C. elegans floresan mikroskopi kullanılarak orta embriyogenezis. Hücre bölünmesi mekanizmalar üzerinde çalışmaya Deneylerin çoğu hücre sınırlı sayıda (örneğin C. tek hücreli embriyo, Xenopus veya echinoderm elegans ile kültür tabaklarında (örn.. HeLa veya S2 hücreleri) tek hücre ya da erken embriyolar gerçekleştirilmiştir embriyo). Ancak, bu bölünme uçağın zamanlaması ve yerleştirme etkileyebilecek dış ipuçları olduğu gibi, aynı zamanda dokuların içinde hücre bölünmesi çalışma için önemlidir. Ayrıca, hücreler komşu doku gelişimini etkilemek için kimyasal veya mekanik ipuçları verebilirs, ve hücreler arası iletişim gelişimi sırasında meydana dokuların nasıl yardımcı anlamak önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Solucan Suşlan bakımı ve RNAi Sahne için plakaların hazırlanması

  1. Nematod Büyüme Medya Tabaklar
    1. Tabaklar
      1. Solucan suşları korumak ve genetik haçlar gerçekleştirmek için nematodu Büyüme Medya (NGM) tabak hazırlayın. Bir 2 L bir şişe içinde, damıtılmış suyun 1 L 3 g NaCl, 17 g ve 2.5 g Agar baktopepton birleştirin ve bir metal karıştırma çubuğu ilave edin.
      2. Agar çözülür ve ortam sterilize etmek için şişeyi otoklav. Daha sonra bir karıştırma plakası üzerinde şişe yerleştirin ve karıştırılırken ortam soğumaya bırakın.
      3. Ortam soğutuldu ve yine (45-50 ° C) dokunun biraz sıcak sonra, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 5 mg / ml kolesterol solüsyonu ve 25 ml 1 M eklemek potasyum fosfat tampon maddesi (PPB, reaktif / materyallerin tabloda tarifi; filtre stok çözelti sterilize) ve hemen 60 mm x 15 mm (kültür kaplarına ortamı dökün, üst ya da 13 ml / plaka bulaşıkları ~ 3/4 doldurmak USI) otomatik bir dağıtıcı ng. Not: bazı suşları tetrasiklin uzun süreli bakım bakteriyel RNAse III geninin etkisiz hale TN10 transpozonunun izin vermek için, levhaların (12.5 ug / ml) ilave edilebilir için.
      4. Ortam gece oda sıcaklığında katılaşmaya edelim. Not: Levhalar biyolojik başlığı içinde ya da kirlenmeye daha az eğilimli olan laboratuar bir alanda muhafaza edilmelidir. Ayrıca, mantar kontaminasyonu sınırlamak için (kağıt mendil ile örn. temiz) kapaklarındaki inşa herhangi bir yoğunlaşma kaldırmak. Tetrasiklin da plakalarına ilave edilir, bu antibiyotik ışığa duyarlı olduğu gibi, daha sonra, alüminyum folyo ile kapatın.
      5. Ertesi gün, E bir süspansiyonu ile kuru NGM plakaları tohum coli; hafifçe girdaplanmış edilmiştir (OP50 gerginlik Bölüm 1.1.2 bakınız). Çiftleşme için plakaları yapmak için, (a küçük bir daire oluşturmak için) her plakanın merkezine OP50 ~ 50 ul ekle. Solucan suşları korumak için plakaları yapmak için, OP50 100-200 ul (~ için her NGM plaka tohumit) plakanın daha büyük bir alanı kaplar emin olun.
      6. Numaralı seribaşı plakalar kuru O / N, oda sıcaklığında olsun.
      7. Ertesi gün, ters kurutuldu, NGM plakaları edecek ve 4 ° C'de plastik saklama kapları bunları yığın Not: Tabaklar 3-4 hafta ~ kadar kullanılabilir. Tetrasiklin ihtiva eden plakalar, karanlıkta tutulmalıdır.
    2. Gıda
      1. E. kullanın coli OP50 [Caenorhabditis Genetiği Merkezi (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] adlı C için bir besin kaynağı olarak . elegans Not: OP50 -80 ° C (% 50 h / h gliserol, oran 1:1) gliserol stokları olarak saklanabilir.
      2. , NGM plakalar için OP50 yapmak gliserol stokunun küçük bir kısım kullanılarak bir çizgi plaka yapmak için (, steril bir pipet kullanın <10 ul). Bir LB agar plakası (reaktif / materyallerin tablosunda reçete) üzerine bakteri yayın ve ~ 16 saat boyunca 37 ° C'de bırakın. Not: kirlenme ile ilgili sorunlar varsa, streptomisin dirençli OP50 kullanılabilir, birnd streptomisin LB agar plakaları (50 ug / ml) ilave edilebilir.
      3. Ertesi gün, tek bir koloni almak ve 500 ml'lik bir şişe içinde bir sıvı LB ortamı (reaktif / materyallerin tablosunda reçete) 100 ml inoküle.
      4. Kültür çalkalanarak 37 ° C'de O / N büyümesine izin.
      5. Ertesi gün, NGM plakaları tohumlama için bakteriyel süspansiyon kullanmak. Not: OP50 50 ml konik bir tüp içinde alikotlandı ve ~ 4-6 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
  2. RNAi
    Besleme RNA aracılı paraziti için ana yollarından biridir (RNAi, belirli bir gen ürününü demonte) C. elegans. C. elegans çift cinsiyetli E. beslenebilir indüksiyondan sonra dsRNA eksprese eden bir vektör ile transforme edilmiş besleme coli suşu HT115. Bu, dsRNA (ya da fragmanları), genellikle özel gen hedefin önemli demonte sonuçlanan gonad iletilir.
    1. RNAi Tabaklar
      1. Yukarıda tarif edildiği gibi NGM tabak hazırlayın (Bölüm 1.1.1) bakınız, aynı zamanda, 1 M IPTG (izopropiltiyo-beta-D-galaktosit 1 ml ekleyin;) dsRNA ekspresyonunu indükleme ve 50 mg / ml ampisilin (Amp 500 ul; dsRNA eksprese eden vektörler vardır Amp dirençli sıcak ortam (45-50 ° C).)
      2. Plakalar kuruduktan sonra, E: ~ 50-100 ul ile tohum coli HT115 (Bölüm 1.2.2 bakınız). Not: tohumsuz plakalar ~ 4-5 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
      3. Tohumlanan plakaları oda sıcaklığında bir gece boyunca kurumasına izin verin.
      4. Ertesi gün, ters kurutuldu, RNAi plakaları edecek ve 15-20 ° C'de plastik bir depolama kabı içinde depolamak Not: Tohumlu plakaları ~ kadar 2-3 hafta boyunca RNAi verimliliğini korumak.
    2. RNAi Gıda
      1. E. kullanın (CGC itibaren, Bölüm 1.1.2 bakınız) coli HT115 ilgi konusu bir gen için cDNA içeren vektör besleme L4440, veya L4440 ile transforme. Not: genomu içinde açık okuma çerçevelerinin çoğunluğu hedef kütüphaneler Beslemezaten yapılmış ve L4440 olarak klonlar HT115 dönüştü (mevcut olmuştur; örneğin ani -1 20-21 Y49E10.19 bir parçasını içeren;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / sayfalar / rnai.html). Not: HT115 -80 ° C (% 50 h / h gliserol, oran 1:1) ile gliserol stoklan halinde tutulabilir.
      2. Ilgi konusu bir geni hedef alan yeni bir yapı oluşturmak için, IPTG ile indüklenebilir olan yan T7 promoterler arasında, L4440 vektör haritası ve klon cDNA bkz.
      3. Dönüşüm için standart bir protokol (örneğin kimyasal yetkili bakteri yapmak ve ısı şok dönüşümü gerçekleştirmek) kullanarak L4440 yapı ile HT115 Transform.
      4. (Bölüm 1.1.2 bakınız) OP50 için tarif edildiği gibi, bir LB agar plakası üzerinde gliserol stoku, fakat plakadan çizgi bakteriler de ampisilin, 50 ug / ml içermelidir. Not: Önceden varolan L4440 yapısı kullanıyorsanız, Bölüm 1.2.2.2-1.2.2.3 atlayın.
      5. Tek bir koloni seçin ve 5 ml aşılamak5, 50 mg / ml stok (LB Amp) için ampisilin ul ve çalkalanarak 37 ° C'de yerleştirin ihtiva eden LB ortam.
      6. ~ 16 saat sonra, O / N kültürün 50 ul taze LB Amp ortam 5 ml aşılamak ve 37 ° C'de çalkalama ile 7-8 saat boyunca kültürünün yetiştirilmesi
      7. 4,000-8,000 xg'de 1 dakika boyunca bakteri santrifüj, süpernatant atmak ve taze LB Amp medya 500 ul pelletini.
      8. Yukarıda açıklandığı gibi (Bölüm 1.2.1) RNAi plakaları tohum için bu bakteri solüsyonu kullanın. Not: HT115 hemen kullanılmalıdır ve saklanmamalıdır.

2. Solucan Suşlan yetiştirilmesi

C'yi koruyun standart protokole 1'e göre NGM plakalar üzerinde CGC sipariş elegans suşları. Bu protokol için kullanılan soylar şunlardır: C, elegans var Bristol, vahşi tip (CGC N2 suşu ID); unc-119 (tm4063); wgIs102 [jambon-1 :: TY1 :: EGFP :: 3xFLAG + unc-119 (+)] (CGC OP102 suşu ID); unc-119 (ED3); ltIs44pAA173 [pasta-1p-mCherry :: PH (PLC1delta1) + unc-11 9 (+)] (CGC OD70 suşu ID); ajm-1 (ok160); jcEx44 [ajm-1 :: GFP + rol-6 (su1006)] (CGC SU159 suşu ID); unc-119 (ED3) ; xnIs96 [pJN455 (hmr-1p :: hmr-1 :: GFP :: unc-54 3'UTR'dir + unc-119 (+)] (CGC FT250 suşu ID).

  1. ~ 3 taze NGM plaka doğru fenotip göstermeyen genç yetişkin çift cinsiyetli seçin. Not: N2 (var. Bristol, vahşi tip), 15-25 ° C arasında muhafaza edilebilir, ancak daha yüksek sıcaklıklarda daha hızlı bir yoğunluğa ulaşır. Solucan yoğunluğu yüksek olduğunda, New stokları yapılmalıdır.
  2. Floresan proteinleri optimal ifadesi için 20-25 ° C'de tüm floresan suşları (örneğin GFP ve / veya MCherry ifade solucanlar) tutun. Solucan yoğunluğu yüksek ve gıda düşük olduğunda New stokları yapılmalıdır.
  3. Solucanlar almak için, kullanmakçekilmiş ucuna (~ 3-5 cm uzunluğunda) de bağlı bir platin tel ile çekilmiş bir cam pipet yapılmış seçin. Pürüzsüz bir kenarı ile tel düzleştirmek. Hermafroditlerde up 'kepçe' için cımbızı kullanın ve yeni plakalar üzerine aktarabilirsiniz. Soylarının çapraz kontaminasyonu engellemek için kullanımı arasında tel bir alev.

3. RNAi

  1. RNAi Sahne
    1. İlk olarak, 30-60 dakika ~ için bir dereceye giremeyen NGM plaka üzerinde yer ~ 8 L4 çift cinsiyetli solucanlar OP50 bakteriler kaldırmak için.
    2. Daha sonra, ilgili gen için dsRNA eksprese eden bir plazmid taşıyan L4440 HT115 ile tohumlanmış bir NGM Amp IPTG plakası üzerine yerleştirin çift cinsiyetli 8 (. Örneğin, ani-1, 1.2) ~ 24 saat karıştırıldı. Not: ilgi konusu genin, veya arzu edilen fenotipi (ki Nakavt gücüne bağlı olabilir) bağlı olarak, solucan, 24 saat sonra, taze, RNAi üzerine çift cinsiyetli yer (zaman daha kısa veya daha uzun süreler için RNAi tabakalarına bırakılabilir plakalar).
    3. Bir neg içinative kontrolü, bir RNAi plaka üzerinde yer solucanlar boş L4440 vektörü taşıyan HT115 ile ekildi. Not: Bu embriyonlar, herhangi bir fenotipi olması gerekir.
    4. Bir pozitif kontrol için, iyi karakterize fenotiplerle bir geni hedefleyen dsRNA'yı ifade eden RNAi plaka üzerine solucanlar yerleştirin. Not: 24 saat ve çift cinsiyetli 48 saat sonra steril olduktan sonra rho-1 (Y51H4A.3) için, embriyolar% 100 ölümcüldür.
  2. RNAi Etkinlik
    RNAi Nakavt seviyeleri, bazı dokular diğerlerinden daha dirençli olabilir, özellikle, çünkü test edilmelidir. Erken orta embriyojenez sırasında, çoğu dokuların RNAi duyarlı olan, ancak geç embriyo ya da larva, nöronlar, RNAi dayanıklıdır. Farklı suşları RNAi duyarlılığı (örneğin rrf-3) geliştirmek için, ya da (nöral promoter unc-119 ile bir transjenin ifade edilen ile kombinasyon halinde, örneğin 1-sid) dokuya-özgü RNAi üretmek için kullanılabilir.
    1. Western Blotting
      C kullanılarak bağışıklık-boyamasıyla elegans proteinleri olabilir,Standart protokol 22 uygun olarak gerçekleştirildi.
      1. RNAi yapıldıktan sonra, bir mikrosantrifüj tüpü içinde çift cinsiyetli (embriyolar ile doldurulmuş) ~ 10 Hastaların gravida toplamak ~ 2 dakika süre ile, kaynatılarak 20-30 ul 1 x SDS-PAGE numune tampon ve eritmek için biyolojik kabiliyetiyle ekleyin. Benzer şekilde, kontrol numunesi için ayrı bir tüp içinde N2 solucanlar toplamak. Not: çift cinsiyetli sayısı, birincil antikorlar hassasiyetine bağlı olarak değişebilir.
      2. Örnek tampon maddesi içinde kontrol numunesi (örneğin, 3-100%) seyreltikleri oluşturun. RNAi kontrol ve numune yük ve standart bir protokol (% jel ilgilenilen proteinin boyutuna bağlı olarak değişecektir) göre SDS-PAGE ile çalıştırın.
      3. Bir zara jel aktarın ve standart bir protokole uygun olarak immunoblotting gerçekleştirin. Not: Kullanımı farklı birincil ve ikincil antikor seyreltilerini her antikor için önerilen.
      4. Geliştirin (örneğin kemilüminesansını kullanıyorsanız) veya tarama (örneğin floresan kullanıyorsanız) immunoblot ve inci karşılaştırıne RNAi şerit vs N2 şeritlerde bantların yoğunluğu ve Nakavt seviyesini belirlemek (örneğin, RNAi şerit yoğunluğunun% 12 kontrol şeridi ile eşleşen, bu protein,% 88 azalma olduğunu göstermektedir). Not:. Maddox ve arkadaşları 23, bkz ANI-1 Nakavt etkinliğini görmek için
    2. İmmünoboyama
      C. immün elegans Standart protokol 22 göre gerçekleştirilebilir.
      1. RNAi gerçekleştirdikten sonra, iki yöntemden birini kullanarak gebe çift cinsiyetli ve hasat embriyolar toplamak. Santrifüj (1.000-4.000 xg) ile mikrosantrifüj tüpleri ve pelet silikonlu 1,5 ml M9 tampon (reaktif / materyallerin tablosunda reçete) olarak yöntem, bir yer çift cinsiyetli biri için. Not: Aynı şekilde N2 gravid Hermafroditler toplamak.
      2. M9 çözüm çıkarın.
      3. 3 dakika boyunca bir mikrosantrifüj tüpüne ağartma çözeltisi 1 ml (1 M NaOH,% 5 ağartıcı) eklenerek embriyolar boşaltınız. Benzer şekilde, ağartıcı N2 diyekontrol slaytlar yapmak rmaphrodites.
      4. Vortex yavaşça, sonra hemen santrifüj (4,000-8,000 xg) vasıtasıyla embriyolar pelet ve ağartma çözüm kaldırmak. Not: solucanlar ağartıcı ile inkübe edilir, toplam süre 5 dakika geçmemelidir.
      5. Ve bir poli-L-lizin kaplı bir mikroskop lamı üzerine, bir cam Pasteur pipet kullanılarak embriyo transferi, embriyolar Tris Tamponlu Salin (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCI TBS) ile 3 kez yıkayın. Not: kaplamak için poli-L-lisin ile bir cam mikroskop slayt, ilk olarak slayt silin, daha sonra poli-L-lisin bir damla (~ 20-30 ul) ekleyin ve yüzeyi boyunca eşit bir şekilde yayılır ve kurumaya bırakın. En iyi sonuçlar, bir kat slaytlar iki kez için. Embriyolar (Bölüm 3.2.2.1-3.2.2.5) toplamak için alternatif bir yöntem, bir poli-L-lizin kaplı bir mikroskop lamı üzerine M9 bir damla koyun ve damla içine ~ 10 gebe çift cinsiyetli seçmek.
      6. Her bir mikroskop lamı üzerine lamel (embriyoların en içeren bir alana) yeri ve eklemesıvı nitrojen içinde kayar. Not: damla içine doğrudan yerleştirilen çift cinsiyetli için, çift cinsiyetli açık kırmak ve embriyolar sınırdışı lamel üzerine koymak baskı.
      7. Hemen sıvı nitrojen içinde dondurarak sonra lamelleri kapalı hafifçe vurarak embriyolar dondurularak-çatlak.
      8. Embriyoların düzeltmek için 20 dakika boyunca buz soğukluğunda metanol slaytlar yerleştirin. Not: bazı antijenler, bu gibi paraformaldehid gibi bir çapraz bağlama sabitleyici tercih edilebilir. DUERR 22 daki protokole bakınız.
      9. Rehidrate ve slaytlar yıkanarak embriyolar permeabilize Tris Tamponlu Tuzlu Tween-20 içeren 4x (TBST, 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.1 Tween-20) 10 dakika her biri için.
      10. Embriyoların çoğu içeren alanı çevresinde her slayt kuru ve sıvı engelleme kalem (örneğin PAP kalem) kullanarak embriyoların etrafında bir daire çizin.
      11. % 5 normal eşek serum (NDS; blok) ile TBST'nin ~ 100 ul ekleyin her slayt (daire alan) ve inkübeOda sıcaklığında 20 dakika. Not: 'ıslak odasına' (ıslak kağıt havlu içeren bir kapak ile, örneğin bir tabak) slaytlar yerleştirin.
      12. , Bloğunu her bir slayt (daire içine alan) (TBST içerisinde seyreltilmiş) birincil antikor ~ 50-100 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edilir. Not: antikora bağlı olarak, seyreltme ve inkübasyon süresi değişebilir. GFP tespit etmek için, bir 1/200 seyreltide bir anti-fare anti-GFP birincil antikor kullanımı. ANI-1 algılamak için, (nazik Amy Shaub Maddox, UNC Chapel Hill tarafından sağlanan) bir 1/1600 seyreltme bir anti-tavşan anti-ANI-1 primer antikoru kullanın. Daha uzun inkübasyon zamanları için, 4 ° C 'de yer slaytlar
      13. (Mümkünse, ileride kullanılmak üzere tutmak) primer antikorları çıkarın ve 5 dakika her biri için TBS ile slaytlar 3x yıkayın.
      14. Son yıkama çıkarın ve her bir slayt (daire içine alan) (TBST içerisinde seyreltilmiş) ikincil antikor ~ 50-100 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edilir. Not: antikora bağlı olarak, seyreltme değişebilir. GFP algılamak için, bir a kullanınBir 1/250 seyreltmede nti-fare Alexa Fluor 488 ikincil antikor. ANI-1 tespit etmek için, bir 1/250 seyreltmede anti-tavşan Alexa Fluor 568 ikincil antikor kullanımı.
      15. Sekonder antikorlar çıkarın ve yıkayın slaytlar 5 dakika her biri için TBS ile 3x. Not: DNA leke DAPI ~ 50-100 ul eklemek için, (4 ',6-diamidino-2-fenilindol, 1 mg / ml) 5 dakika süreyle TBST içinde 1/500 seyreltme ile.
      16. DAPI çıkarın ve her biri için 5 dakika TBS ile 2x slaytlar yıkayın. Not: DAPI boyama yapılmaz ise, bu ekstra yıkama adımı atlayın.
      17. 0.1 M Tris (pH 9) ile birlikte tek bir hızlı yıkama yapın, montaj medya 15 ul 37 ° C (% 4 n-propil-3.4.5 trihydroxybenzoate (propil galat), 50 mM Tris, pH ~ 9'a önceden ısıtılmış kaldırmak ve ekleme Her bir slayt (daire alan)% 50 gliserol).
      18. Aşırı sıvı fitil ve oje ile slaytlar mühür, (daire içine alan montaj medya üstüne) her slayt lamel ekleyin. Not: Slaytlar -20 ° C'de saklanabilir
      19. Üzerinde embriyolar gözlemlemekBir widefield floresan mikroskop veya lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak kayar. Önemlisi, kontrol (N2 veya non-RNAi) embriyolar kullanarak optimum piksel yoğunluğunun görüntüleri toplamak için ayarlarını. Ardından, aynı ayarları kullanarak RNAi embriyolardan görüntüleri toplamak. Kontrol vs için toplanan görüntülerin örnekleri ani-1 RNAi embriyolar Şekil 2B'de de gösterilmiştir.

4. Canlı Görüntüleme ve Hasat Embriyolar için Slaytlar hazırlanması

  1. Canlı görüntüleme için agaroz pedlerin hazırlanması
    1. Onlara bant 1-2 şeritler ile diğer iki slaytlar, her arasında temiz, önceden ısıtılmış mikroskop slayt yerleştirin.
    2. , Bir cam Pasteur pipet kullanarak, slayt (ısıtılmış damıtılmış su içinde çözülmüş) v agaroz / ağ% 2 bir damla ekleyin.
    3. Çabuk agaroz damla düzleştirmek için bir dik şekilde ilk slayt üstüne ikinci, temiz bir mikroskop lamı yerleştirin. Not: komşu üzerine bant kaydırdıes pad için kalınlığı sağlar.
    4. Üst slayt çıkarmadan önce 1-2 dakika için agaroz ped kurumasını bekleyin. Altında agaroz pedi kırma önlemek için dikkatli üst kızağın kapalı kaydırın. Not: Bazen ped üst slayt aktarılır ve hala kullanılabilir olduğu sürece bozulmadan kalır.
    5. Bir kaç dakika içinde agaroz ped üzerine embriyolar transfer hazırlandıktan sonra (adım 4.2), aşağıda tarif edildiği gibi. Not: ped, opak bir görünüme sahip olmalıdır; açıktır kez, o kullanmak için çok kurudur.
  2. Hasat embriyolar
    1. Sulston ve diğ. 24 türetilmiş canlı görüntüleme için, embriyolar toplamak için, aşağıdaki yöntemi kullanarak
    2. NGM veya RNAi plakaları (açlıktan) yaklaşık 4-6 gravid yetişkin almak ve bir depresyon slayt üzerinde bir kuyu M9 tampon 20-30 ul koyun.
    3. (Ya da seçenek olarak, vulva yakın) spermateka her iki tarafında solucanlar kesmek için bir neşter kullanarak sterilizeçözeltisi içine embriyolar bırakın.
    4. Bir cam kılcal / pipet bağlı bir ağız parçası ile lastik hortum kullanmak küçük bir delik var ve ağız pipetleme embriyolar emme çekti. Seçenek olarak ise, bir Pasteur pipeti kauçuk ampul bağlı bir kılcal cam boru ile embriyolar toplar.
    5. Solucan enkaz ayırmak için, aynı zamanda M9 tampon içeren ikinci bir çukuruna emilen embriyolar aktarın.
    6. Daha sonra, emme taze hazırlanmış bir agaroz ped üzerine embriyolar (adım 4.1).
    7. Birlikte tek bir x, y düzleminde filme edilebilir embriyo sayısını artırmak için (bir diş çekme yapıştırılmış) bir kirpik kullanılarak yığın embriyolar. Not: Oksijen yoksunluğu önlemek için, birlikte en fazla 10 embriyolar yığın yoktur.
    8. Daha sonra, bir lamel ile slayt kapak ve kısmen önceden ısıtılmış sıvı valap ile mühür, görüntüleme sırasında embriyonun su kaybını önlemek için (vazelin, lanolin ve parafin eritilir ve 01:01:01 birleştirilmiş). Not: Ek M9 tampon can embriyolar görüntüleme için yeterli sıvı sahip olmasını sağlamak için yastık için ilave edilebilir. Valap yerine, vazelin kısmen lamelleri kapatılması için de kullanılabilir, ancak bu lamelleri kayma ve mikroskop hedefler üzerine alabilir neden daha az serttir.

5. Canlı Görüntüleme

  1. Neuroblasts görselleştirmek için, bir fluoresan proteine ​​bağlı bir neuroblast özgü bir proteini eksprese eden bir sonsuz yük elde edilir (örneğin, HAM-1: GFP, CGC OP102 suşu ID). , Hücre zarlarının algılamak farklı bir floresan protein bağlı lipidler tanıyan bir protein alanını ifade bir solucan suşu kullanmak için (örneğin MCherry:. PH, CGC OD70 suşu ID).
  2. Floresan hermafroditlerde Hasat embriyolar (Protokolü 4) (Protokoller 3 ve 4), ve yukarıda anlatıldığı gibi slaytları kontrolü veya ani-1 RNAi plakaları üzerinde tuttu.
  3. Epifloresans mikroskobu ile 4D görüntü embriyolar (x, y, z ve zaman atlamalı). Bir wi birini kullanındefield sistemi [GFP ve TexasRed için filtreler, 60X veya 100X, yüksek çözünürlüklü bir CCD (şarj bağlı cihaz) kamera için hedefleri kadar olan otomatik floresan mikroskop, yüksek sahne motorlu (örn.. Piezo Z) ve özel toplama yazılımı] veya bir Livescan alan süpürüldü konfokal mikroskop [100X, bir EMCCD (elektron çarpılması CCD) kamera için 488 nm ve 561 nm lazerler, hedefleri yukarı ile floresan mikroskop tarama otomatik, yüksek (örneğin Piezo Z) ve özel toplama yazılım aşamasına motorlu]. Not: widefield sistemi için, LED'ler ve bir EMCCD kamera kullanarak fototoksisite sınırlayacaktır. Ayrıca, döner disk konfokal mikroskop süpürüldü alan sistem yerine kullanılabilir.
  4. Her iki sistemde görüntü neuroblast hücre bölünmesi, x bulmak, y 10X veya 20X hedefleri kullanarak embriyo çerçeveleri, ve optimal x, embriyolar dorsal ardalanmasına geçiyor y çerçevesini seçin (adım önce ventral kasasına; Şekil 1A) ya da erken aşamalarındaventral muhafazanın (~ ilk hücre bölünmesi sonrası 350 dakika; Şekil 1A).
  5. Süpürüldü alan mikroskobu, 50 bir yarık ile% 40 güçte 488 nm ve 561 nm 100 mW lazer kullanır. Widefield sisteminde, düşük-orta ışık yoğunluğu (kontrol ise) ile GFP ve TexasRed filtreleri kullanın. Not: widefield sistemi için LED'ler, düşük fototoksisite ve tercih edilir.
  6. Her iki sistemde, 60X ya da 100X yağ daldırma kullanım amacı ve 10 dakikalık bir toplam 0.2 mikron her 2 dakika 20 Z-yığınlar toplar. Not: Her ne kadar HAM-1: GFP ve MCherry: PH sondalar nispeten yüksek seviyelerde ifade, her sonda için pozlama süreleri farklı mikroskoplar için optimize edilmiş olması gerekir. Not: geniş açılı bir sistem için, daha az Z-yığınları fototoksisite sınırlamak için tavsiye edilir ve daha uzun süreler boyunca görüntüleme için, daha az zaman noktalarını kullanın.
  7. Bir merc kullanıyorsanız (widefield sistemde UV ışığına embriyoların pozlama neden fototoksisite en aza indirmek içinUry ampul),% 30 açıklığı kapatmak ve () ayarlanabilir aydınlatma sistemini kullanarak ışık yoğunluğunu azaltmak. Not: kazanç sistemi kullanılarak gerekli değildir, ancak diğer uygun mikroskoplar piksel yoğunluğunun görüntüler elde etmek için kazanç kullanılmasını gerektirebilir farklı sayısal açıklık, daha düşük yoğunluklarda ve amaçları ile ışık kaynağı olabilir. Herhangi gözlenen fenotipleri artifaktüel fototoksisite nedeniyle değil emin olmak için bir kontrol embriyo kullanarak koşulları test.

6. Mikroskopi Verilerin Analizi

  1. TIFF gibi görüntüleri, ihracat dosyaları analiz etmek ve böyle bir Java tabanlı görüntü işleme programında (örneğin ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/) gibi özel yazılımlar kullanarak bir yığın olarak TIFF dosyalarını açmak için. Not: görüntüleri toplamak için kullanılan toplama yazılımı bağlı olarak, dosyalar orijinal haliyle muhafaza edilebilir ve ImageJ açıldı. Meta dosyaları ile tutulur gibi bu tercih edilir.
  2. Yığını ayırın'görüntüler' basıp zaman noktaları ve istediğiniz gibi Z-uçakları içine. Not: 20 Z-uçaklık bir yığın alınmış olmasına rağmen, neuroblasts birçok <1 ortalarında geç embriyonik dönemde kalın um ve sadece birkaç Z-uçakları ihtiyaç vardır.
  3. Her zaman noktası için seçilen Z uçakları yeniden düzeltin ve ayrı Z-yığın projeksiyonları yapmak. Daha sonra, her zaman için çıkıntılar bir zaman sekansına yapmak için bir araya etmektedir yığını.
  4. Her kanal için parlaklık / kontrast ve veya ayarlamalar yapın.
  5. Ardından, ilgi, mahsulün bir bölge seçmek (ve gerekirse döndürmek) bölgesi.
  6. 'Birleştirilmiş kanalların' fonksiyonunu kullanarak Birleştirilmiş görüntüler oluşturmak ve her bir kanal için farklı bir renk seçin. RGB birleştirilen görüntüleri dönüştürün.
  7. Daha net görüntüleri görselleştirmek için adımlar 6.3 veya 6.4 ('edit' başlığı altında kullanım 'invert' fonksiyonu) her kanal için gri tonlu görüntüleri ters çevirin.
  8. Vektör tabanlı yazılımı rakamlar yapmak için 8-bit TIFF gibi tüm son görüntüleri kaydetprogramları veya Quicktime dosyaları film yapmak gibidir.
  9. Pixel boyutu ölçümleri (örneğin, görüntüler ile bir ölçek çubuğu dahil) gerekli olup olmadığını, embriyonun boyutunu ölçmek için ImageJ, ya da diğer görüntü işleme yazılımı kullanın. Not: Farklı hedefleri kullanarak toplanan Görüntüler farklı piksel boyutlarına sahip olacak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneysel protokol nasıl C. görüntü hücre bölünmesi açıklanmaktadır elegans ortalarında Embriyogenez sırasında embriyolar. Özellikle, epidermal morfolojilerinden kolaylaştırabilir ki ne resim neuroblasts için tarif etmektedir. Epidermal morfogenez nedeniyle epidermal hücre şekli değişiklikleri, göç ve yapışma, aynı zamanda altında yatan neuroblasts (Şekil 1 B) kimyasal ya da mekanik ipuçları dayanır bir arada oluşur. Nöro-blastlar göç 10,14,25 düzenleyen ventral epidermal ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, orta embriyojenez sırasında görüntü hücre bölünmesi için mikroskopla çeşitli kullanımını tarif eder. Özellikle, bu protokol nasıl epidermal morfogenetiğine kolaylaştırabilir neuroblasts bölünme hücreleri görüntü vurguluyor. Hücre-hücre iletişimi metazoan gelişimi ve C. sırasında doku oluşumu için önemlidir elegans in vivo doku oluşumunu incelemek için mükemmel bir model. Güzel dokuların etkileşimi canlandıran bir olay epitel hücrelerinin bir tabakası içinde embriyo kapsayan, epidermal morf...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada'nın (NSERC) hibe Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenen olduğunu kabul etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgarBioShop Kanada A.Ş.#AGR001.1C. elegans NGM ve RNAi plakaları yapmak için
AgarBio Basic Inc.#9002-18-0Bakteri yapmak için LB agar plakaları
AgaroseBioShop Canada Inc.#AGA001.500
Anti-fare Alexa Fluor 488 antikorLife Technologies Corporation (Invitrogen)#A11029
Anti-fare anti-GFP antikoruRoche Uygulamalı Bilimler#11814460001
Anti-tavşan Alexa Fluor 568 antikorYaşam Teknolojileri Şirketi (Invitrogen)#A11011
AmpisilinBioShop Kanada A.Ş.#AMP201.5Tozu 4 ° C'de saklayın; C ve -20 ° C'de çözünmüş ampisilin; C
Baktopeton  (pepton-A)Biyo Temel A.Ş.
CaCl2 (kalsiyum klorür)BioShop Turkey Inc.#C302.1
Kolesterol BioShopKanada A.Ş.#CHL380.25Etanol DAPI içinde çözün
ve nbsp;Sigma-Aldrich#D9542Nükleik asitleri (DNA) boyamak için
kullanınGlycerolBioShop Canada Inc.#GLY001.1
IPTG (izopropiltio-β-galaktozit)Bio Basic Inc.# 367-93-1Tozu ve çözünmüş IPTG'yi -20 ° C'de saklayın; C
KH2PO4 (potasyum fosfat, monobazik)BioShop Canada Inc.#PPM666.1
K2HPO4 (potasyum fosfat, dibazik)BioShop Canada Inc.#PPD303.1
L4440  (besleme vektörü)Addgene# 1654-80 & °C'de gliserol stoğu olarak tutun; C
MgSO4    (magnezyum sülfat)BioShop Kanada A.Ş.#MAG511.500
NaCl (sodyum klorür)Bio Basic Inc.# 7647-14-5
Na2< / sub>HPO4< / sub> (sodyum fosfat, dibazik)Bio Basic Inc.# 7558-79-4
Normal Eşek Serumu (NDS)Wisent Bioproducts# 035-110
n-Propil-3,4,5-trihidroksibenzoat (propil gallat)Alfa Aesar#A10877
Poli-L-lizinSigma-Aldrich#P8920En iyi sonuçlar için kaplama mikroskobu üç kez kayar 
StreptomisinBioShop Kanada A.Ş.#STP101.50Tozu 4 ° C'de saklayın; C ve -20 ° C'de çözünmüş streptomisin; C
Tetrasiklin BioShopKanada A.Ş.#TET701.10Tozu 4 ° C'de saklayın; C ve -20 ° C'de çözünmüş tetrasiklin; C
Ara-20Bio Temel A.Ş.CAS # 9005-64-5
Tripton BioShopKanada Inc.#TRP402.500
Maya Özü BioBasic Inc.#8013-01-2
#G213

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  3. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  4. Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
  5. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
  7. Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
  8. Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
  9. Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
  10. Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
  11. Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
  12. Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
  13. Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
  14. Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
  15. Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
  16. Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
  17. Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
  18. Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
  19. Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
  20. Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  21. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  22. Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
  23. Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
  24. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
  25. Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
  26. Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
  27. Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
  28. Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
  29. Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
  30. Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
  31. Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Floresan MikroskobuGeni Alan MikroskobuKonfokal MikroskopRNA InterferansTransgenik Mark rlerVentral KapanmaEpidermal MorfogenezH cre B l nmesi

İlgili makaleler