Zaman atlamalı konfokal görüntüleme embriyo gelişimini karakterize etmek için yararlı olan bir güçlü bir tekniktir. Burada, yöntemini açıklar ve iskeletsel vahşi tür morfolojilerinden yanı sıra, PDGFRA, smad5 ve smo mutant embriyolar karakterize eder.
Zaman atlamalı görüntüleme morfolojilerinden işleminin doğrudan gözlemlenmesine olanak sağlayan bir teknik veya şeklin kuşaktır. Nedeniyle optik netlik ve genetik manipülasyon amenability için, Zebra balığı embriyosu yaşayan embriyoların morfolojilerinden zaman atlamalı analizi gerçekleştirmek için hangi ile popüler bir model organizma olmuştur. Canlı bir Zebrafish embriyo Konfokal görüntüleme ilgi konusu bir doku sürekli bir transgenin ya da enjekte boya gibi, bir flüoresan işaretleyici ile etiketlenir gerektirir. Bu süreç embriyo anestezi uygulandı ve sağlıklı gelişim normal olarak devam eder ki bu şekilde yerinde tutulur talep etmektedir. Görüntüleme için Parametreler üç boyutlu büyüme için hesap ve geliştirme enstantaneler elde ederken, bireysel hücrelerin çözme talepleri dengelemek için ayarlanmış olması gerekir. Bizim sonuçlar floresan etiketli Zebra balığı embriyolarının in vivo görüntüleme uzun vadeli gerçekleştirmek ve çeşitli doku davranışlarını tespit etmek için yeteneğini göstermekkraniofasyal anormallikleri neden kranial nöral krest. Anestezi ve montaj kaynaklanan gelişimsel gecikmeler minimal ve embriyolar bu süreçte zarar görmez. Zaman atlamalı görüntüsü embriyo gelişiminde daha sonra noktalarında sıvı ortam döndü ve daha sonra görüntülü ya da sabitlenebilir. Transgenik zebrafish hatları ve iyi karakterize kaderi haritalama ve transplantasyon teknikleri, görüntüleme artan bir bolluk ile istenilen doku mümkündür. Gibi, in vivo görüntüleme time-lapse mutant ve mikroenjeksiyon embriyo analizleri dahil olmak üzere Zebra balığı genetik yöntemleri ile güçlü birleştirir.
Kraniyofasiyal morfonogenezi birden fazla hücre tipleri arasında koordineli etkileşimi gerektiren karmaşık, çok aşamalı bir süreçtir. Kraniofasiyal iskeletin çoğunluğu nöral krest hücrelerinden türetilen, birçoğu yutak kemerleri 1 adlandırılan geçici yapılar içine dorsal nöral tüp geçirmek gerekir. Birçok dokuda olduğu gibi, kraniofasiyal iskeletin morfonogenezi spesifik gelişimsel zaman noktalarında embriyoların statik görüntüleri anlaşılabilir daha karmaşıktır. Zaman alıcı gerçekleştirmek olmasına rağmen, in vivo time-lapse mikroskopi gelişmekte olan bir embriyonun hücre ve dokularda sürekli bir görünüm sağlar. Bir time-lapse serisinde her görüntü diğerlerine bağlamı ödünç, ve bir fenomen oluşur neden çözmekten ziyade o anda neler olduğunu çözmekten doğru bir araştırmacı hareket olur.
Vivo görüntüleme böylece deneysel yaklaşımlar için güçlü bir açıklayıcı araçtırmorfogenetiğine kılavuz yollar yapısızlaştırmak. Zebra balığı Br.rerio omurgalı embriyonik gelişim popüler bir genetik modelidir, ve özellikle de morfojenezinin in vivo görüntüleme için uygundur. Modern, transgenesis ve genomik değişiklik için uygun yöntemler hızla Zebrafish araştırmacılar için mevcut araçların sayısını ilerlemektedir. Bu araçlar, genetik manipülasyon ve mikroskopi için önceden güçlü bir yöntem geliştirir. Hemen hemen arzu edilen herhangi bir genetik bağlamda hemen hemen herhangi bir doku içinde vivo görüntüleme fantezi daha gerçeğe yakın.
Faringeal kemerlerin morfogenetik hareketleri nöral ve komşu epitel, ektoderm hem endoderm arasındaki etkileşimleri sinyal tarafından yönlendirilir. Kraniofasiyal iskelet elemanları morfojenezini sürmek için gerekli olan epitel tarafından ifade edilen çok sayıda sinyal molekülleri vardır. Bu sinyal molekülleri arasında, Sonic Hedgehog (Sus) önem fveya Kraniyofasiyal kalkınma 2-8. Shh'si oral ektodermden ve farenks endoderm 2,6,9,10 ikisi tarafından ifade edilir. Endoderm Shh ekspresyonu kemerler 10, 10 kemerlerin içinde nöral krestin modelleme ve kraniofasiyal iskeletin 11 büyüme morfojenik hareketlerini düzenler.
Bmp sinyali de kraniofasiyal gelişimi 12 için kritik önem taşımaktadır ve yutak kemerlerin morfogenetiğine değiştirebilir. Bmp sinyalizasyon yutak kemerlerin 13,14 içinde kret dorsal / ventral desenlendirme düzenler. Zebrafish smad5 bozulması şiddetli damak kusurları ve orta hatta 15 de uygun sigorta Meckel kıkırdaklarının bir hata neden olur. Buna ek olarak, mutantlan 2., 3., ve orta hattı 15 da kaynaşık bazen 4. yutak kemer elemanları ile ventral kıkırdak elemanları azalma ve füzyon, ekran. Bu füzyonları BMP güçlü bir sinyal, bu yutak elemanların morfojenezini yönlendirir olduğunu göstermektedir.
PDGF sinyalizasyon Kraniyofasiyal gelişimi için gerekli olan, ancak faringeal kemer morfogenezindeki bilinmeyen rolleri vardır. Fare ve zebra balığı PDGFRA mutantlar Hem derin midfasiyal yarıklaşmanın 16-18 var. En azından Zebrafish bu midfasiyal Clefting uygun nöral krest hücrelerinin göç 16 bir başarısızlık nedeniyle. Nöral krest hücreleri yutak kemerler girdikten sonra PDGFRA ifade ediyor. Ayrıca, PDGF ligandlar yüz epitellerinden ifade edilir ve yutak kemerler 16,19,20 içinde, böylece PDGF sinyal de göç aşağıdaki yutak kemerli morfolojilerinden bir rol oynayabilir. Ancak, PDGFRA mutantlar faringeal kemerler yapılmamıştır morfogenezindeki analizleri.
Burada, biz pharyngul konfokal mikroskopi göstermekBir aşamalı transgenik zebra balığı ve bu süre içinde yutak kemerlerin morfogenetiğine açıklar. Biz daha BMP, PDGF ve Shh'si sinyalizasyon yolları bozmaya mutasyonların etkilenen doku davranışlar göstermek.
1.. Hayvancılık ve Mutant Aleller
2. Çözümleri ve uygular hazırlanması
Not: Tüm çözümler ve uygular önceden yapılan ve ileride kullanılmak üzere saklanabilir.
3. Eşodaklı Mikroskopi için Montaj Zebra balığı Embriyolar (Bakınız Şekil 1)
4. Transgenik Zebra balığı Embriyolar Time-lapse Eşodaklı Görüntüleme
(Bu protokol Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop bize için optimize edilmiştirZEN görüntüleme yazılımı ing, ve diğer sistemler ile kullanım için modifiye edilebilir.)
Time-lapse konfokal mikroskopi gelişim analizi için güçlü bir araçtır. Burada, biz nöral krest hücreleri etiketler bir transgenik kullanarak önemli bir sinyal yollar için mutant olan zebrabalıkları faringeal kemer morfogenetiğine okuyan metotun göstermektedir. Doku seviyesine ek olarak zaman atlamalı analizler de hücresel ölçekte 28 analizleri için geçerlidir, analiz eder. Bir çok yaygın olarak kullanılan bir yöntem, aynı zamanda zebra balığı morpholinos mikroenjeksiyonu, mRNA ya da transjenik yapıları yanı sıra, embriyolar arasında nakli dahil olmak üzere, zaman atlamalı mikroskopi deneyleri içine dahil edilebilir. Birden çok gelişmekte olan dokulara analizi sadece floresan etiket dokulara yeteneği ile ve karışma olmaksızın farklı florofor istenilen sayıda tespit etmek için eş odaklı mikroskop kabiliyeti ile sınırlıdır. Zebra balığı embriyolarının bir kavrama gelen görüntülü olabilir bireylerin sayısı ciddi kısıtlı, ancak gelişmiş tekniklerAynı süre içinde birkaç embriyo otomatik görüntüleme sağlar. Kolayca erken zaman noktalarında tespit olmayan bir mutant zaman atlamalı analizi gerçekleştirmek isteyen Bu özellikle yararlıdır.
Time-lapse konfokal görüntüleri ölçümlerini yaparken, bazı gelişimsel gecikme süreci neden olduğunu dikkate almak önemlidir. Gelişim gecikmeler de mutant embriyolar nadir değildir, bu nedenle kontrol kardeş görüntüleme mutant / manipüle embriyolar gibi yabani-tip kontrol her ikisi için de gereklidir. Hatta bir kez evreleme için kontrollü, floresan etiketli yapıların karşılaştırmalı ölçümü zordur. Floresans yoğunluğu bireyler arasında ve aynı yapının ayrı parçalar arasında son derece değişken olabilir. Böylece, nondiscrete kantitatif ölçümler bir derecede öznellik var ve biz birden tek tutarlılığı sağlamak için ölçümler gerçekleştirmenizi öneririz. Müfettişler ayrıca embriyo yönlendirilmesi disiplinli olmalıdırkarşılaştırmalı ölçümü için sürekli, bunu başarısızlık olarak yok olabilir morfolojik farklılıklar görünüme neden olur. Numune embriyoların hareketleri düpedüz bir deney berbat edebilirsiniz ve biz mikro dalgada agaroz kalınlaştırmak için izin alındıktan sonra anestezi ekleyerek embriyolar ağrılarını etkinliğini azaltır bulabilirsiniz.
Zor elde etmek olsa da, zaman atlamalı mikroskopi veriler nitel morfogenetiğine karşılaştırarak statik görüntülerin üzerinde belirgin avantajları vardır. Statik görüntüler sık sık belirli bir zaman noktasında yapıların kolay ölçümü, ama izin giden veya bu aşamadan sonra doku davranışların hiçbir belirti verecektir. Morfolojilerinden olarak iki veya daha fazla ayrı dokuların etkileşimlerin incelenmesinde Bu tür bilgiler önemlidir. Morfojenezinin en iyi genel karakterizasyonu elde etmek amacıyla, en iyisi, her yöntemin avantajları kullanmak için hem zaman gerçekleştirilmemesi ve statik analizlerini gerçekleştirmek için faydalıdır. Zaman lapsed Analyses, dinamik hücre ve doku davranışları statik analizlerde, embriyoların çok sayıda değişkenlik iyi anlaşılmasını sağlamak için incelenebilir, analiz ve edilebilir. In vivo verileri gerçek zamanlı morfonogenezi araştırmacılar arasında altın standart haline gibi diğer tekniklerin Zebrafish transgenik hatları ve ilerleme artan sayıda, sıradan çoklu dokuların zaman atlamalı konfokal mikroskopi yapacaktır.
The authors have nothing to disclose.
6 lb Test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
Agarose I | Amresco | 0710 | |
Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Microscope cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
Microscope cover glass, 24 x 60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |