Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Zaman atlamalı konfokal görüntüleme embriyo gelişimini karakterize etmek için yararlı olan bir güçlü bir tekniktir. Burada, yöntemini açıklar ve iskeletsel vahşi tür morfolojilerinden yanı sıra, PDGFRA, smad5 ve smo mutant embriyolar karakterize eder.

Abstract

Zaman atlamalı görüntüleme morfolojilerinden işleminin doğrudan gözlemlenmesine olanak sağlayan bir teknik veya şeklin kuşaktır. Nedeniyle optik netlik ve genetik manipülasyon amenability için, Zebra balığı embriyosu yaşayan embriyoların morfolojilerinden zaman atlamalı analizi gerçekleştirmek için hangi ile popüler bir model organizma olmuştur. Canlı bir Zebrafish embriyo Konfokal görüntüleme ilgi konusu bir doku sürekli bir transgenin ya da enjekte boya gibi, bir flüoresan işaretleyici ile etiketlenir gerektirir. Bu süreç embriyo anestezi uygulandı ve sağlıklı gelişim normal olarak devam eder ki bu şekilde yerinde tutulur talep etmektedir. Görüntüleme için Parametreler üç boyutlu büyüme için hesap ve geliştirme enstantaneler elde ederken, bireysel hücrelerin çözme talepleri dengelemek için ayarlanmış olması gerekir. Bizim sonuçlar floresan etiketli Zebra balığı embriyolarının in vivo görüntüleme uzun vadeli gerçekleştirmek ve çeşitli doku davranışlarını tespit etmek için yeteneğini göstermekkraniofasyal anormallikleri neden kranial nöral krest. Anestezi ve montaj kaynaklanan gelişimsel gecikmeler minimal ve embriyolar bu süreçte zarar görmez. Zaman atlamalı görüntüsü embriyo gelişiminde daha sonra noktalarında sıvı ortam döndü ve daha sonra görüntülü ya da sabitlenebilir. Transgenik zebrafish hatları ve iyi karakterize kaderi haritalama ve transplantasyon teknikleri, görüntüleme artan bir bolluk ile istenilen doku mümkündür. Gibi, in vivo görüntüleme time-lapse mutant ve mikroenjeksiyon embriyo analizleri dahil olmak üzere Zebra balığı genetik yöntemleri ile güçlü birleştirir.

Introduction

Kraniyofasiyal morfonogenezi birden fazla hücre tipleri arasında koordineli etkileşimi gerektiren karmaşık, çok aşamalı bir süreçtir. Kraniofasiyal iskeletin çoğunluğu nöral krest hücrelerinden türetilen, birçoğu yutak kemerleri ¹ adlandırılan geçici yapılar içine dorsal nöral tüp geçirmek gerekir. Birçok dokuda olduğu gibi, kraniofasiyal iskeletin morfonogenezi spesifik gelişimsel zaman noktalarında embriyoların statik görüntüleri anlaşılabilir daha karmaşıktır. Zaman alıcı gerçekleştirmek olmasına rağmen, in vivo time-lapse mikroskopi gelişmekte olan bir embriyonun hücre ve dokularda sürekli bir görünüm sağlar. Bir time-lapse serisinde her görüntü diğerlerine bağlamı ödünç, ve bir fenomen oluşur neden çözmekten ziyade o anda neler olduğunu çözmekten doğru bir araştırmacı hareket olur.

Vivo görüntüleme böylece deneysel yaklaşımlar için güçlü bir açıklayıcı araçtırmorfogenetiğine kılavuz yollar yapısızlaştırmak. Zebra balığı Br.rerio omurgalı embriyonik gelişim popüler bir genetik modelidir, ve özellikle de morfojenezinin in vivo görüntüleme için uygundur. Modern, transgenesis ve genomik değişiklik için uygun yöntemler hızla Zebrafish araştırmacılar için mevcut araçların sayısını ilerlemektedir. Bu araçlar, genetik manipülasyon ve mikroskopi için önceden güçlü bir yöntem geliştirir. Hemen hemen arzu edilen herhangi bir genetik bağlamda hemen hemen herhangi bir doku içinde vivo görüntüleme fantezi daha gerçeğe yakın.

Faringeal kemerlerin morfogenetik hareketleri nöral ve komşu epitel, ektoderm hem endoderm arasındaki etkileşimleri sinyal tarafından yönlendirilir. Kraniofasiyal iskelet elemanları morfojenezini sürmek için gerekli olan epitel tarafından ifade edilen çok sayıda sinyal molekülleri vardır. Bu sinyal molekülleri arasında, Sonic Hedgehog (Sus) önem fveya Kraniyofasiyal kalkınma ^2-8. Shh'si oral ektodermden ve farenks endoderm ^2,6,9,10 ikisi tarafından ifade edilir. Endoderm Shh ekspresyonu kemerler ^{10, 10} kemerlerin içinde nöral krestin modelleme ve kraniofasiyal iskeletin ¹¹ büyüme morfojenik hareketlerini düzenler.

Bmp sinyali de kraniofasiyal gelişimi ¹² için kritik önem taşımaktadır ve yutak kemerlerin morfogenetiğine değiştirebilir. Bmp sinyalizasyon yutak kemerlerin ^13,14 içinde kret dorsal / ventral desenlendirme düzenler. Zebrafish smad5 bozulması şiddetli damak kusurları ve orta hatta ¹⁵ de uygun sigorta Meckel kıkırdaklarının bir hata neden olur. Buna ek olarak, mutantlan ^{2., 3.,} ve orta hattı ¹⁵ da kaynaşık bazen ^4. yutak kemer elemanları ile ventral kıkırdak elemanları azalma ve füzyon, ekran. Bu füzyonları BMP güçlü bir sinyal, bu yutak elemanların morfojenezini yönlendirir olduğunu göstermektedir.

PDGF sinyalizasyon Kraniyofasiyal gelişimi için gerekli olan, ancak faringeal kemer morfogenezindeki bilinmeyen rolleri vardır. Fare ve zebra balığı PDGFRA mutantlar Hem derin midfasiyal yarıklaşmanın ^16-18 var. En azından Zebrafish bu midfasiyal Clefting uygun nöral krest hücrelerinin göç ¹⁶ bir başarısızlık nedeniyle. Nöral krest hücreleri yutak kemerler girdikten sonra PDGFRA ifade ediyor. Ayrıca, PDGF ligandlar yüz epitellerinden ifade edilir ve yutak kemerler ^16,19,20 içinde, böylece PDGF sinyal de göç aşağıdaki yutak kemerli morfolojilerinden bir rol oynayabilir. Ancak, PDGFRA mutantlar faringeal kemerler yapılmamıştır morfogenezindeki analizleri.

Burada, biz pharyngul konfokal mikroskopi göstermekBir aşamalı transgenik zebra balığı ve bu süre içinde yutak kemerlerin morfogenetiğine açıklar. Biz daha BMP, PDGF ve Shh'si sinyalizasyon yolları bozmaya mutasyonların etkilenen doku davranışlar göstermek.

Protocol

1.. Hayvancılık ve Mutant Aleller

1. ²¹ anlatıldığı gibi zebrafish yükseltmek ve üremek.
2. Bu çalışmada kullanılan Zebrafish mutant alel, ^{16 b1059} smad5 ^{b1100 22} ve smo ^{b577 23} PDGFRA edildi. Bu Zebrafish suşları için kaynaklar Zirc içerir.

2. Çözümleri ve uygular hazırlanması

Not: Tüm çözümler ve uygular önceden yapılan ve ileride kullanılmak üzere saklanabilir.

1. Daha önce ²¹ açıklandığı gibi embriyo medya (EM) olun.
2. 4 g / L MS-222 (Tricaine) olun. 450 ml steril su içinde 4 g disodyum fosfat (Na ₂ HPO ₄₎ çözülür. Çözeltiye 2 g MS-222 ekleyin. 7,0-7,2 pH değerini ayarlayın. 500 ml'lik toplam hacme kadar steril su ekleyin.
3. İsteğe bağlı: 4 g / L karanfil yağı olun. 50 ml konik bir tüp içinde 0.2 g saf karanfil yağı tartılır. 50 ml'lik bir toplam hacme EM ekleyin. 4 ° C'de saklayın
4. % 3 methylcellulo olunse. Çıban EM + 0.1 M HEPES'in 50 ml getirmek. Ateşten alın. Çözelti homojen olana kadar 1,5 g metil selüloz ilave edin. 4 ° C'de saklayın
5. % 0.2 agaroz olun. 50 ml EM, 0.1 g agarozun ekleyin. Mikrodalga veya ocak üzerinde kaynatın EM getirin ve agaroz çözülmüş olduğunu doğrulayın. 4 ° C'de mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza içinde 500 ul hacim içine kısım Not: Gerektiğinde Birimleri ayarlanabilir.
6. Kılcal deliciler olun. Bir 0.9 mm İD, kılcal boru içine süper yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Hattının yaklaşık 3-4 mm borunun ucunun ötesine uzanır, öyle ki, kılcal boru içine £ 6 Test monofilament olta bir 4-5 cm uzunlukta yerleştirin.
7. Numune başına iki köprülü lamelleri olun. Orta serbest bırakarak 24 x 60-1 kapak cam her ucuna Süper yapıştırıcı 22 x 22-1 cam kapak. Eski bir günden daha az embriyo için single (sonunda başına 1 küçük cam kapak) yapmak, 03:59 d embriyolar için (sonunda başına birbirlerinin üstüne 2 küçük kapak bardak) iki katınaembriyoların beş gün ya da eski eski AYS, ya da üçe (sonunda başına birbirlerinin üstüne 3 küçük kapak bardak).
8. Yüksek vakum yağ ile bir 10 ml şırınga doldurun. Not: Vakum gres uzun süre üzerinde örneklerin dehidratasyonu önlemek için bir dolgu olarak hizmet veren ve daha uçucu sızdırmazlık malzemeleri ile karşılaştırıldığında toksisite için düşük bir potansiyele sahiptir.

3. Eşodaklı Mikroskopi için Montaj Zebra balığı Embriyolar (Bakınız Şekil 1)

1. Anestezik ortamı hazırlayın. Tamamen sıvı kadar 20 saniye aralıklarla mikrodalga% 0.2 agaroz bir kısım eritin. % 0.2 agaroz içinde 195 ul% 0.2 'lik agaroz içine ya da 4 g / L karanfil yağı 5 ul 192 ul içine MS-222 8 ul karıştırın. 42 ° C ısıtma bloğu koruyun. Not: MS-222 Uzun pozlama embriyonik zebrabalıkları ²⁴ yapar karanfil yağı daha güçlü gelişimsel gecikmelere neden olur.
2. Gerekirse: El çıkmamış Transgenik embriyolar hemen önce analiz için analiz edilecek dechorionate. Forseps kullanarak, yavaşça teembriyo serbest kadar açık koryon ar.
3. Zebra balığı embriyolar uyutmak. MS-222 embriyo medya ml 24 kadar bir 4 g / L stoklar 1 ml ilave edilir. Seçenek olarak ise, balık su ²⁴ 24 ml 4 g / L karanfil yağı 390 ul ekleyin. Not: Karanfil yağı eylemler yavaş yavaş bu yüzden zaman atlamalı mikroskopi önce en az 15-20 dk bu adımı gerçekleştirin.
4. Yukarı doğru bakan bir köprülü lamel merkezi alanı etrafında vakum gres bir boncuk yerleştirin. Yavaş yavaş ve köprü ve lamel kenarının içine bitişiğindedir düzgün, sürekli bir boncuk hale şırınga üzerinden vakum yağ itin.
5. Ahşap bir aplikatör kullanılarak köprülü lamel ortasında% 4 metilselüloz içinde bir daire yayıldı.
6. Yansıması için, embriyo transfer edin. Embriyo anestezi olduğunda bir cam pipet içine kadar çizin. Embriyo pipet içindeki sıvının dibine çöker izin vermek için dikey olarak pipet tutun. Agaroz çözüm içine pipet hareket ettirin ve embriyo damla izinAgaroz içine. Sıvı sınırdışı etmeyin.
7. Numune yerleştirin. Pipet içine bazı agaroz çözüm ve embriyo çizin. Metilselüloz üstüne agaroz bir solüsyon damla embriyo boşaltınız. Metilselüloz üzerine aşağı embriyoyu itin ve görüntüleme için arzu edildiği gibi embriyo yönlendirmek için bir kılcal poker kullanın.
8. Numune Seal.
   1. Aşağıya bakacak şekilde monte birinin üstüne bir köprülü lamel yerleştirin. Köprüler iki lamelleri doğrudan temas ve agaroz açılan mühürler yapmak kadar sandviç lamelleri her iki tarafına da baskı uygulayın. Embriyo düzgün odaklı olduğunu doğrulayın.
   2. Vakum gres boncuk çatlaklar ve boşlukları düzeltmek için cam boyunca ahşap bir aplikatör ovun. Kenarlardan fazla yağı silin.

4. Transgenik Zebra balığı Embriyolar Time-lapse Eşodaklı Görüntüleme

(Bu protokol Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop bize için optimize edilmiştirZEN görüntüleme yazılımı ing, ve diğer sistemler ile kullanım için modifiye edilebilir.)

1. Ekipman etkinleştirin. Konfokal mikroskop ve herhangi bir harici lazer cihazları açın. Konfokal mikroskop bağlı bilgisayarı açın. Açık konfokal görüntüleme yazılımı ve görüntü alma denetimlerini etkinleştirmek için "Start Sistemi" seçeneğini seçin.
2. Isıtmalı sahne hazırlayın. Konfokal mikroskop evreleme platformu indirin ve pozisyon dışında objektif lensleri taşımak. Elektronik ısıtılmış aşaması ile varsayılan sahne değiştirin. Isıtılmış aşaması için kontrol açın ve 29.5 ° C için sıcaklığını ayarlamak
3. Görüş alanında örnek yerleştirin. Sahnede monte örneği yerleştirin. Pozisyona 20X objektif lens taşımak ve hazırlama platformu yükseltmek. Görünür ışık yayıcı etkinleştirin ve göz mercekleri ile bakmak. Görüş alanında embriyonun baş merkezi.
4. Deneme ayarlarını tanımlayın.
   1. Seçerek floresan kanalları etkinleştirmektespit ve gereken floresan dalga boyu her kanal için renk arama tabloları (LUT) seçin. Gerekirse, gerekli lazerler (RFP örneğin 561 nm) açmak için yazılım manuel kontrolleri kullanın. Her floresan kanal için 10,0 lazer yoğunluğu ve 600-700 arasındaki photomultiplier gerilim (HV veya kazanç) ayarlayın. 4 averajlama ve 16 bit bit derinliğini ayarlayın.
   2. Z-yığını ve zaman serisi modülleri etkinleştirin. 5 mm veya daha küçük Z-çözümü için iğne deliği ayarlayın ve önerilen optimum mesafeye Z-aralığını ayarlayın.
      Not: Genellikle, 5 um Z çözünürlüklü her Z-yığın görüntü için yeterince hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar, aynı zamanda bir tek hücrelerin çözülmesi sırasında, belirli bir zaman noktasında embriyo "anlık". Ortalamasını düşürülmesi de imajlar süreyi azaltır.
   3. Görüntüler arasında istenilen zaman aralığını (genellikle 10-20 dk) ve deney toplam uzunluğunu tanımlayın.
5. Pozisyonel Setbilgi.
   1. Canlı moduna kamerayı açın. Odağı ayarlayın ve gerekirse floresan görmek için lazer yoğunluğunu artırır. Istenirse, daha geniş bir görünüm için 0.6 dijital zoom ayarlayın.
   2. Ilgilendiren tüm yapıları görünür şekilde sahne yerleştirin ve öne akıbet dorsal ve için görüş alanında oda var. Floresan üst ve alt sınırlara embriyo ile Odak. Ilk ve son Z-yığın dilim konumlarını bu sınırların ötesinde en az 100 mikron veya daha fazlasını ayarlayın.
6. Floresan yoğunluğu optimize.
   1. Göstergesi aralığı için ekran LUT'a ayarlayın. Floresan yapılar artık beyaz görünmelidir ve görüş alanının geri kalanı (algılama yok) mavi veya siyah olması gerekir.
   2. Sadece doymuş yerin altındaki bir seviyeye HV / kazancını artırmak (kırmızı) piksel görünür. Gerekirse, böylece arka planda bir çoğunluğu (mavi) algılanmaz offset adjust. Not: Daha küçük iğne deliği çapı ve artan lazer yoğunluğu görüntü def geliştirmek hemInition, ancak lazer yoğunluk canlı dokuları korumak için düşük tutulmalıdır. Artan HV / kazanç ve iğne deliği çapı (<5 um), genellikle yüksek lazer yoğunluk tercih edilir.
   3. Yeterince geniş 4'e setleri, ortalama bir zamanında görüntüleri toplamak için iğne deliği çapı tutun. Z-aralığı, her iğne deliği çapı için önerilen en uygun mesafe ayarlanmalıdır. Farklı ayarlarla kısa taramalar (ortalama = 1) gerçekleştirin ve istenilen çözünürlük elde minimum lazer yoğunluğu kullanın.
7. Istenen zaman süresi için deney çalıştırın. Daha sonra, ısıtılmış aşamasından embriyo kaldırmak ve yavaş yavaş lamelleri ayırın. 30 mm Petri kabındaki EM lamel ve embriyo daldırın. Cam bir pipet kullanarak hafifçe lamel kapalı embriyo yıkayın ve Petri kabı lamel kaldırmak. Geliştirmeye devam etmek bir 28.5 ° C inkübatör içine embriyo yerleştirin.
8. Büyüme karşılaştırın. Deneyin sonunda, bireysel Zs almakBenzer Deneyin başlangıcında numune için aşamalı, fakat agaroz monte edilmiş kardeş embriyo tack görsel bir 28.5 ° C kuluçka makinesi içinde EM yetiştirilmiştir.
9. Gerektiği gibi, yutak kemerler ölçün. Ölçümler bazı konfokal yazılımı suit yapılabilir. Burada bulunan Ölçümler tek tek kare. Lsm dosyaları içe ve Z-yansıtarak Fiji25 kullanılarak yapıldı.

Representative Results

Discussion

Time-lapse konfokal mikroskopi gelişim analizi için güçlü bir araçtır. Burada, biz nöral krest hücreleri etiketler bir transgenik kullanarak önemli bir sinyal yollar için mutant olan zebrabalıkları faringeal kemer morfogenetiğine okuyan metotun göstermektedir. Doku seviyesine ek olarak zaman atlamalı analizler de hücresel ölçekte ²⁸ analizleri için geçerlidir, analiz eder. Bir çok yaygın olarak kullanılan bir yöntem, aynı zamanda zebra balığı morpholinos mikroenjeksiyonu, mRNA ya da transjenik yapıları yanı sıra, embriyolar arasında nakli dahil olmak üzere, zaman atlamalı mikroskopi deneyleri içine dahil edilebilir. Birden çok gelişmekte olan dokulara analizi sadece floresan etiket dokulara yeteneği ile ve karışma olmaksızın farklı florofor istenilen sayıda tespit etmek için eş odaklı mikroskop kabiliyeti ile sınırlıdır. Zebra balığı embriyolarının bir kavrama gelen görüntülü olabilir bireylerin sayısı ciddi kısıtlı, ancak gelişmiş tekniklerAynı süre içinde birkaç embriyo otomatik görüntüleme sağlar. Kolayca erken zaman noktalarında tespit olmayan bir mutant zaman atlamalı analizi gerçekleştirmek isteyen Bu özellikle yararlıdır.

Time-lapse konfokal görüntüleri ölçümlerini yaparken, bazı gelişimsel gecikme süreci neden olduğunu dikkate almak önemlidir. Gelişim gecikmeler de mutant embriyolar nadir değildir, bu nedenle kontrol kardeş görüntüleme mutant / manipüle embriyolar gibi yabani-tip kontrol her ikisi için de gereklidir. Hatta bir kez evreleme için kontrollü, floresan etiketli yapıların karşılaştırmalı ölçümü zordur. Floresans yoğunluğu bireyler arasında ve aynı yapının ayrı parçalar arasında son derece değişken olabilir. Böylece, nondiscrete kantitatif ölçümler bir derecede öznellik var ve biz birden tek tutarlılığı sağlamak için ölçümler gerçekleştirmenizi öneririz. Müfettişler ayrıca embriyo yönlendirilmesi disiplinli olmalıdırkarşılaştırmalı ölçümü için sürekli, bunu başarısızlık olarak yok olabilir morfolojik farklılıklar görünüme neden olur. Numune embriyoların hareketleri düpedüz bir deney berbat edebilirsiniz ve biz mikro dalgada agaroz kalınlaştırmak için izin alındıktan sonra anestezi ekleyerek embriyolar ağrılarını etkinliğini azaltır bulabilirsiniz.

Zor elde etmek olsa da, zaman atlamalı mikroskopi veriler nitel morfogenetiğine karşılaştırarak statik görüntülerin üzerinde belirgin avantajları vardır. Statik görüntüler sık ​​sık belirli bir zaman noktasında yapıların kolay ölçümü, ama izin giden veya bu aşamadan sonra doku davranışların hiçbir belirti verecektir. Morfolojilerinden olarak iki veya daha fazla ayrı dokuların etkileşimlerin incelenmesinde Bu tür bilgiler önemlidir. Morfojenezinin en iyi genel karakterizasyonu elde etmek amacıyla, en iyisi, her yöntemin avantajları kullanmak için hem zaman gerçekleştirilmemesi ve statik analizlerini gerçekleştirmek için faydalıdır. Zaman lapsed Analyses, dinamik hücre ve doku davranışları statik analizlerde, embriyoların çok sayıda değişkenlik iyi anlaşılmasını sağlamak için incelenebilir, analiz ve edilebilir. In vivo verileri gerçek zamanlı morfonogenezi araştırmacılar arasında altın standart haline gibi diğer tekniklerin Zebrafish transgenik hatları ve ilerleme artan sayıda, sıradan çoklu dokuların zaman atlamalı konfokal mikroskopi yapacaktır.

Materials

6 lb Test monofilament line	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID	FHC	30-31-0
Clove oil	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser scanning microscope	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Potassium chloride	Fisher Scientific	M-11321
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Sodium chloride	Fisher Scientific	M-11624
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.