Yöntem makalesi

PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe

15.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51193

⸱

22 Ocak 2014

 , 
1UMR 144, Institut Curie

Bu makalede

Özet

Bu el yazması tek yönlü germe kullanarak yapışık hücreler ve dokular üzerindeki kuvvetleri uygulamak ya da serbest bırakmak için bir teknik sunuyor.

Özet

Mekanik kuvvetler hücreleri üzerinde uygulanan ve / veya dokular, çok sayıda süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Bir polidimetilsiloksan görüntüleme ile uyumlu (PDMS) membran üzerine kaplanmıştır hücreleri uzatmak için bir cihaz geliştirdiler. Bu teknik, tekrarlanabilir ve çok yönlüdür. PDMS zar, belirli bir geometri için hücreler veya dokular sınırlandırmak amacıyla micropatterned edilebilir. İlk adım, bir derin UV tekniği ile PDMS membran üzerine micropatterns yazdırmaktır. PDMS zar daha sonra mekanik bir sedye üzerinde monte edilir. A odası boyunca uzanan kayma sağlamak için biyo-uyumlu yağı ile membran üzerine bağlıdır. Hücreler ekildi ve micropatterns birkaç saat boyunca yayılmasına izin verilir. Numune mikrometrik bir vida kullanımı ile birden çok kez gerilmiş gerek gerilmemiş edilebilir. Bu (% 30 civarında) tam ölçüde streç uygulamak için bir dakikadan az sürer. Burada sunulan tekniği için gerekli olan bir motorlu aygıt içermezhızlı bir şekilde ve / veya bilgisayar kontrollü gerilme tekrarlanan germe döngüsünden pplying, ancak bu uygulanabilir. Hücrelerin germe veya doku hücre kuvvetler, mekanik stres veya doku morfolojilerinden hücre yanıtı ile ilgili sorularınız için ilgi olabilir. Bu video sunumu görünüşte basit deney bu tür yaparken ortaya çıkabilecek tipik sorunları önlemek için nasıl gösterecektir.

Giriş

Yüksek organizmalarda bir doku oluşturan hücreler mekanik gerilimler ve dış ortamdan ya da çevreleyen hücrelerden 1,2 dan ya geliyor germe güçlerine tabidir. Hücreler uyum ve doku bütünlüğünü korumak için bu güçlere direnmek gerekir. Bu tür güçler de kalkınma 3,4 sırasında dokular morfogenezisi önemlidir. Kültürlü hücreler üzerinde mekanik kuvvet uygulayarak bir doku içinde neler olabileceğini taklit etmek bir yoldur, ancak hücre şekli ve hücre deformasyon 5,6 nicel ve bağımsız kontrolü ile. Bunun için, çeşitli teknikler kullanılabilir. Bir (bütün hücre veya bunun bir parçası), örneğin, AFM veya 7,8 türevleri ya da hücrelerin büyüdüğü alt tabakanın esneme kullanılarak hücreler üzerinde basın olabilir.

Bu yazıda anlatılan yöntem hücreleri ile kaplı bir uçak substratı germek için nasıl gösterir. Bu teknik, ilk olarak değerlendirmek için geliştirilmiştir kuvvetlerinin rolü m üzerine uygulananitotic memeli hücreleri 9. Mitotik hücreler geri çekme elyafların yoluyla alt-tabakaya bağlı kalmak ve membran germe da mitotik iğin dönmesini tahrik lifleri üzerine bir kuvvet uygulamıştır. Yapışkan birleştirme micropatterns ve germe kuvvetleri ilgi ve tek tek hücreler şeklinde bağımsız kontrol elde etmektir. Bu, tek eksenli germe uygulanır ise, mükemmel bir şekilde izotropik yuvarlak şekil, bir oval hücre uzatmak için, örneğin mümkündür. Hücreler micropatterns platted değilseniz, tek eksenli en hücreler germe ekseni ile hizalanan uzun bir eksene sahip olan, hücre uzaması sonucu germe. Bu, uzun eksen hizalama ve hücrelere uygulanan gerilme etkisinin etkisini ayırmak için daha sonra zordur.

Cihaz, uzun zaman atlamalı floresan mikroskobu da dahil olmak üzere herhangi bir canlı hücre görüntüleme için uygun olan, ve uyuşturucu deney sırasında ilave edilebilir. Derin UV'lerin micropatterning yöntemi 10Azioune ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve ark. PDMS 11 Desen nitelendirildi Azioune et al. 12 de protokol uzanan Mevcut Carpi et al. 13 içeren bir video versiyonu

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. PDMS pasivasyon

  1. PDMS bir parça kesin yaklaşık olarak önceden yapılmış tabakasından x 20 mm 35 mm (örneğin, GelPak, malzeme tabloda listelenen gibi).
  2. Plastik üst ve alt koruma tabakaları çıkarın (gerekli ise) ve Petri çanağı (muamele edilmiş kültür hücre) bir plastik PDMS yerleştirmek için cımbız kullanın.
  3. / Dakika 30 salınım ile bir karıştırıcı üzerine 5 dakika için% 70 etanol ile PDMS yıkayın.
  4. Bunun üzerine akan hava ile yüzeyi kurulayın.
  5. Yaklaşık 5 cm UV ampullere göre belirli bir mesafede, 5 dakika için derin UV (λ = 180 nm) ile aydınlatma imkanını (lamba referans malzemeleri tabloya bakın; parametreleri farklı lambalar için değişir).
  6. Her bir parça PDMS için EDC / NHS çözeltisi 200 ul (solüsyonun reaktivitesi saat meselesi çürükleri için bu kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır) hazırlayın. PH 6.0 'da 0.05 M MES + 0.5 M NaCl tampon, 1 ml için, Sülfo-NHS 11.5 mg ve 19.2 mg EDC ekleyin.
  7. TransferiIşıklı edilmemiştir Petri kabı, bir kapağa Petri kabı PDMS levhalar. Bu PDMS çevresi çok hidrofobik olmasını sağlamak ve bir sonraki adımı kolaylaştıracaktır.
  8. EDC / NHS solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  9. Su ile EDC / NHS durulayın.
  10. PLL-PEG-g çözelti (10 mM HEPES pH 8.6 içinde 0.5 mg / ml) ilave edilir ve 3 saat için oda sıcaklığında gece boyunca ikinci inkübe edin.
  11. Su ile PLL-PEG-g durulayın. (G-PLL-PEG ile işlevselleştirilmiş) pasifleştirilmiş PDMS 4 ° C'de birkaç gün boyunca saklanabilir

2. PDMS desenlendirilmesi

  1. PDMS levha alın ve desenlendirme için microfeatures taşıyan bir sentetik kuvars photomask üzerine yerleştirin (bkz. Şekil 1). PLL-g-PEG photomask krom yan bakan taşıyan PDMS tarafını yerleştirin.
  2. Yaklaşık 5 cm UV ampullere göre belirli bir mesafede, fotomaske yoluyla, 7 dakika boyunca yanar.
  3. Maske + PDMS üzerine su ekleyin ve yavaş yavaş maske kapalı PDMS soyun.
  4. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile pH 8.6 de HEPES tamponu içinde 50 mg / ml 'de fibronektin çözeltisi ile inkübe edin. Bu diğerleri ECM proteinleri kullanmak mümkündür, ancak bunlar bu protokol ile test edilmemiştir.
  5. PBS ile durulayın.

3. Cihaz montaj

  1. Germe cihazı (sorun giderme için Tartışma) üzerine önceden pasifize PDMS monte edin.
    1. Sedyenin sabit kısmına PDMS bir tarafı takın.
    2. PDMS tabakanın çok fazla sıkıştırma olmadan sedyenin mobil kısmına diğer tarafı düzeltildi.
  2. Kalın bir PDMS bıçak içinde PDMS bir dikdörtgen (22 mm x 19 mm) kesme ve (Şekil 2 ye bakınız) hücreleri ve medya koruyacaktır bir havuz (ya da çerçeve) elde etmek için içine bir dikdörtgen kesin.
  3. Bu havuzu PDMS altında silikon gres ekleyin ve bir med oluşturmak için PDMS levha üstüne yerleştirinyum havuzu muhafaza eder. Yağ germe sırasında PDMS tabaka üzerine havuzun kayma sağlayacaktır.

4. Hücreleri Desenlendirme

  1. Versene ile% 50 confluency kültür şişesi hücreleri çıkarın.
  2. Hücre sayımı ve 200,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon bunları.
  3. Havuzda hücre süspansiyonu 1 ml (ek ayrıntılar için Tartışma) ekleyin.
  4. Hücreler (RPE-1 hücreleri, 10 dakika ve HeLa hücreleri 20 dakika sürer, hücre tipine bağlı olarak) 10-30 dakika boyunca desen bağlanan olsun.
  5. Yavaşça dengelenmiş ortamda (inkübatör ortamı dengeye) ile yüzen hücreleri yıkayın.
  6. Hücreler desenleri birkaç saat boyunca yayalım (RPE-1 en az 2 saat gerekir; HeLa hücreleri 3 saat ihtiyacınız olacak).
  7. PDMS tatili durumda, buharlaşma ve orta sızıntıyı önlemek için havuz üstünde bir lamel ekleyin.
  8. Ters bir mikroskop cihazı koymak ve görüntüleme başlar. Immersiyon yağı ob kullanmaktan kaçınınnedeniyle odaklanma sorunları için çalışmaz gibi alamayarak hedeflere ulaşamama riski.

5. Germe

  1. X-, y-ve z-ekseni (özellikle x) 'de aşama pozisyon düzeltme sırasında mikrometrik vidasını. Aşama pozisyon PDMS genişletme ve odak kaybına karşı koymak için düzeltilmesi gerekmektedir. (TARTIŞMA paragraf "streç sırasında" bak).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu ekran protokol sunulan teknik mitotik memeli hücrelerinin geri çekme lifleri üzerinde kuvvetlerinin uygulanmasını izin verdi. Gerçekten de, hücre bölünmesi esnasında, mitotik aşamasında, memeli hücreleri bir küre şeklini alır ve alt-tabakaya bağlı olan ince bir zar ile çevrili aktin kabloları geride bırakmak için çekin. Bu kablolar (geri çekilme lifler), bölünme girmeden önce hücre geometri hafızası vardır. PDMS ince film bir fotomaske aracılığıyla derin UV micropatterns yapmak (Şekil 1) hücre ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu teknik çok kez kullanılan ve iyice test olmasına rağmen, başarısız bir deney yol açabilir çeşitli kritik adımlar vardır.

PDMS Hakkında:

Bu iş için, GelPak, piyasada mevcut ince PDMS levha kullanılmıştır. Alternatif PDMS yaprak PDMS karışımı doğrudan döküm alınabilir. Daha tekrarlanabilir ve özel yapılmış PDMS'nin kıyasla kırmak için daha az olasıdır, çünkü GelPak kullanmanızı öneririz.

Cihaz hakkında:

Bu ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Teşekkürler

Bu çalışma Fransa Institut Curie, Paris, tarafından kurulmuştur. Mekanik sedye Damien Cuvelier (Institut Curie) tarafından tasarlanan ve Grem tarafından üretilen (mecanique-grem.com). PDMS desenleme Ammar Azioune (Bordeaux II Üniversitesi) tarafından geliştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GelPakGelPakPF-60-X4Farklı kalınlık/yapışkanlık mevcuttur. Bir alternatif, PDMS  kendini.
Silikon gresGE Bayer SilikonlarBaysilone-MacunBu biyouyumlu
Germe cihazıGREM m & eacute; caniqueSedye 2011 
EDC (N- (3-Dimetilaminopropil) -N ve prim; -etilkarbodiimid hidroklorür)Sigma3450-20 ° C'de 6 ay kararlı; C
NHS (N-Hidroksisülfosüksinimid sodyum tuzu)Sigma56485Nemden koruyun
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)SurfaceSolutions (Zürih) 
Sentetik Kuvars fotoğraf maskesiToppanKuvars Fibronektin'de standart ikili fotoğraf maskesi alın
;
Sığır plazması Sigma F1141 & nbsp'den

Kaynaklar

  1. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  2. Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).
  3. Guillot, C., Lecuit, T. Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis. Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).
  4. Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
  5. Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).
  6. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).
  7. Mitrossilis, D., et al. Real-time single-cell response to stiffness. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).
  8. Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).
  9. Fink, J., et al. External forces control mitotic spindle positioning. Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).
  10. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
  11. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs. Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).
  12. Azioune, A., et al. Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates. Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).
  13. Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs. Protoc. Exch. , (2011).
  14. Sinha, B., et al. Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae. Cell. 144 (3), 402-413 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre GermeMikrodesenlemeDerin UV Tekni iMekanik Germe CihazFibronectin KaplamaVideo MikroskopisiRetraksiyon LifleriMitotik H crelerSubstrat Germe

İlgili makaleler