Floresan Etiketli Suşların Cocultivation'ı ile Bakteri Hücre Popülasyonunda İntraspecies Rekabetini İzleme

Özet

Bakteriler yaşamları boyunca zararlı veya faydalı mutasyonlar biriktirebilir. Bir hücre popülasyonunda, yararlı mutasyonlar biriktirmiş bireyler, arkadaşlarını hızla geride kalabilir. Burada, floresan etiketli bireyleri kullanarak zaman içinde bakteri hücresi popülasyonunda tür içi rekabeti görselleştirmek için basit bir prosedür sunuyoruz.

Özet

Bakteri gibi birçok mikroorganizma son derece hızlı çoğalır ve popülasyonlar yüksek hücre yoğunluklarına ulaşabilir. Bir popülasyondaki hücrelerin küçük fraksiyonları her zaman hücre için zararlı veya faydalı olan birikmiş mutasyonlara sahiptir. Bir mutasyonun fitness etkisi, alt nüfusa güçlü bir seçici büyüme avantajı sağlarsa, bu alt nüfusa sahip bireyler hızla rakip olabilir ve hatta yakın arkadaşlarını tamamen ortadan kaldırabilir. Bu nedenle, yararlı mutasyonlar elde eden hücrelerin küçük genetik değişiklikleri ve seçim odaklı birikimi, bir hücre popülasyonunun genotipinin tamamen kaymasına neden olabilir. Burada, gram-pozitif model bakteri bacillus subtilisfloresan etiketli bireylerinin birlikte çalıştırıldığı zaman içinde bakteri hücre popülasyonunda, sırasıyla yararlı ve zararlı mutasyonların hızlı klonal genişlemesini ve ortadan kaldırılmasını izlemek için bir prosedür sunuyoruz. Yöntemin gerçekleştirilmesi kolaydır ve bakteri hücre popülasyonundaki bireyler arasında tür içi rekabeti göstermek çok açıklayıcıdır.

Giriş

Toprak bakterileri genellikle esnek düzenleyici ağlar ve geniş metabolik kapasitelerle donatılmıştır. Her iki özellik de hücrelerin katabolik ve anabolik yollarını, belirli bir ekolojik nişte bulunan besinler için arkadaşları ve diğer mikroorganizmalarla rekabet edecek şekilde ayarlamalarını sağlar¹. Bununla birlikte, bakteriler çevrelerine uyum sağlayamazsa, diğer mekanizmalar bir türün hayatta kalmasını açıklayabilir. Gerçekten de, birçok bakteri hızlı çoğaldığı ve popülasyonlar yüksek hücre yoğunluklarına ulaşabildiğinden, alt popülasyonlar hücrelere seçici bir büyüme avantajı sağlayan ve bu nedenle zindeliklerini artıran kendiliğinden birikmiş faydalı mutasyonlara sahip olabilir. Ayrıca, mutasyonel sıcak noktalar ve strese bağlı adaptif mutajensis, maladapted bir bakterinin evrimini kolaylaştırabilir^2,3. Bu nedenle, sürekli seçim altında mutasyonların ve büyümenin birikmesi, aynı cins içinde bile muazzam mikrobiyal çeşitliliğin kökenidir^4,5. Doğada olduğu gibi, bakteri genomlarının şekillendirilmesi de seçim altında sürekli ekim nedeniyle laboratuvarda meydana gelir. Bu, temel araştırmalarda ve endüstride dünya çapında kullanılan Gram-pozitif bakteri B. subtilis'in evcilleştirilmesi ile örneklenmiştir. 1940'larda B. subtilis DNA'ya zarar veren X ışınları ile tedavi edildi ve ardından belirli bir büyüme koşulu altında ekim^{yapıldı 6}. Evcilleştikleri sırada bakterilerde biriken mutasyonlar, birçok büyüme özelliğinin kaybını, yani B. subtilis laboratuvar suşu 168 karmaşık koloniler oluşturma yeteneğini kaybetti^7,8.

Günümüzde, en iyi çalışılan model bakteriler Escherichia coli ve B. subtilisiçin, belirli bilimsel soruları ele almak için genomlarını genetik olarak manipüle etmek için çeşitli güçlü araçlar mevcuttur. Bazen bir ilgi geninin inaktivasyonu, daha sonra standart büyüme ortamında açıkça görülebilen ciddi bir büyüme kusuruna neden olur⁹. Bunun aksine, zayıf bir büyüme kusuru neden olan ve böylece suşun kondisyonunu sadece biraz etkileyen mutasyonlar genellikle göz ardı edilir. Bununla birlikte, her iki durumda da mutant suşlarının birkaç nesil boyunca uzun süreli inkübasyonu ve geçişi genellikle ana suşun fenotipini geri kazandıran baskılayıcı mutantların birikmesine neden^2,9. Baskılayıcı mutantların karakterizasyonu ve ebeveyn mutant suşunun büyüme kusurunu geri kazandıran mutasyonların tanımlanması, önemli ve genellikle yeni hücresel süreçlerin aydınlatılmasına izin veren çok yararlı bir yaklaşımdır^10,11.

Biz B. subtilis¹²glutamat homeostaz kontrolü ile ilgileniyoruz. E. coli'yebenzer şekilde, B. subtilis glutamat homeostazının(yaniglutamat bozulmasında blok²⁾bastırıcı mutantların birikmesiyle pertürbasyonuna yanıt verir. Spontan mutasyonla elde edilen bu baskılayıcı mutantlardaki genomik değişikliklerin glutamat homeostazını hızla geri getirdiği gösterilmiştir^9,13. Bu nedenle, B. subtilis'in bakterinin evcilleştirmesi sırasında belirli bir büyüme durumuna adaptasyonunun enzim sentezinde ve glutamat metabolizmasında yer alan evrimleşmiş enzimatik aktivitelerde yansıtılması şaşırtıcı değildir¹². Evcilleştirme işlemi sırasında büyüme ortamında eksojen glutamat eksikliğinin, laboratuvar suşu 168^2,14'tekriyotik glutamat dehidrogenaz (GDH) gudB^CR geninin ortaya çıkması ve sabitlenmesi için itici güç olduğu ileri sürülmüştür. Bu hipotez, laboratuvar suşundaki GDH aktivitesinin azalmasının, eksojen glutamat az olduğunda bakterilere seçici bir büyüme avantajı sağladığı gözlemimiz ile desteklenmektedir². Ayrıca, bir B. subtilis suşunun yetiştirilmesi, GDH GudB sentezlenmesi, eksojen glutamat yokluğunda gudB genini inaktive eden baskılayıcı mutantların birikmesi ile sonuçlanır². Açıkçası, katabolik olarak aktif bir GDH'nin varlığı hücre için dezavantajlıdır, çünkü anabolizma için kullanılabilecek endojen olarak üretilen glutamat amonyum ve 2-oksioglutarat olarak bozulur (Şekil 1). Bunun aksine, glutamat ortam tarafından sağlandığında, üst düzey GDH aktivitesi ile donatılmış bir B. subtilis suşu, sadece bir fonksiyonel GDH sentezleyen bir suş üzerinde seçici bir büyüme avantajına sahiptir. Üst düzey GDH aktivitesinin, bakterilerin orta² tarafından sağlanan diğer karbon kaynaklarına ek olarak ikinci bir karbon kaynağı olarak glutamat kullanmasına izin verdiğini varsaymak mantıklıdır (bkz. Şekil 1). Bu nedenle, GDH aktivitesi, eksojen glutamanın mevcudiyetine bağlı olarak bakterilerin zindeliğini güçlü bir şekilde etkiler.

Burada, kromozom üzerinde tek bir lokusta farklılık gösteren iki B. subtilis suşu arasındaki tür içi rekabeti izlemek ve görselleştirmek için çok açıklayıcı bir yöntem sunuyoruz (Şekil 2). İki suş, floroforlar YFP ve CFP'yi kodlayan yfp ve cfp genleri ile etiketlendi ve farklı beslenme koşulları altında birlikte çalıştı. Zamanla örnekleme yaparak ve agar plakalarına uygun seyreltmeler yaparak, kültürlerin her birinde hayatta kalanlar ortak bir stereo floresan mikroskobu kullanılarak kolayca izlenebilir. Bu makalede açıklanan prosedürün gerçekleştirilmesi kolaydır ve zaman içinde bir hücre popülasyonunda sırasıyla yararlı ve zararlı mutasyonların hızlı klonal genişlemesini ve ortadan kaldırılmasını görselleştirmek için uygundur.

Protokol

1. Agar Tabaklarının, Kültür Medyasının, Kriyostockların ve Ön Kültürlerin Hazırlanması

1. Büyüme ortamı ve gerekli reaktifleri hazırlayın (bkz. malzeme ve reaktifler tablosu).
2. B. subtilis suşlarını çizgile (örneğin. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) ve BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) sırasıyla bir ve iki aktif GDH ifade eden)² tek koloniler elde etmek için SP orta agar plakaları üzerinde yapılacak yarışma deneyinde kullanılacaktır. Plakaları gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
3. Tek kolonileri alın ve 4 ml LB sıvı ortam içeren steril kültür tüplerini aşılayın. Bakterileri gece boyunca 28 °C ve 220 rpm'de yetiştirin.
4. Hücrelerin 28 °C'de geceleme veya sporulate olmasını önlemek için gece kültürlerini büyütün.
5. Standart bir spektrofotometre kullanarak kültürlerin optik yoğunluğunu 600 nm (OD₆₀₀₎dalga boyunda ölçün.
6. Kültürler_{2.0'ın 600'üne} ulaştıysa, 0.75 ml'lik kültürleri 1.5 ml reaksiyon tüplerinde 0.75 ml steril% 50 gliserol çözeltisi ile karıştırın. Yaklaşık_{10 8} hücre/ml içeren kriyostocklar elde etmek için son OD 600 1.0 olmalıdır.
7. Tüpleri -80 °C'de saklayın.
8. Cfp ve yfp kodlama florofor genleri ile etiketlenmiş her bir suşun üç ön kültürünü yapın. -80 °C kriyostocklardan 1 μl hücre ile ön ürünleri (4 ml LB sıvı ortam içeren steril kültür tüpleri) aşılayın. Kültürleri bir gecede 28 °C ve 220 rpm'de kuluçkaya yatırın.

2. Bakterilerin BirlikteLiği, Numune Toplama ve Numune Depolama

1. 100 ml C-Glc ve CE-Glc minimal ortamı yeni hazırlayın (reaktifler ve malzemeler tablosuna bakın) ve her ortamın 20 ml'lik kısmını steril 100 ml sallama şişelerine aktarın.
2. Bir gecede yetiştirilen 0,1 ml'lik ön ürünleri alın, 1,5 ml'lik bir cuvette 0,9 ml LB orta ile seyreltin ve OD_600'übelirleyin.
3. Yarışma deneyi için,_1.0-1.5 arasında benzer bir OD 600'e sahip farklı suşların ön kültürlerini alın.
4. Karışık hücre popülasyonları elde etmek için, uygun OD_600'e sahip olan ön kültürlerin hücrelerini 20 ml C-Glc'de 0,05'in 600'ünE ve 100 ml sallama şişelerinde desteklenmiş CE-Glc minimal ortamına seyreltin. Yarışma deneyi için iki suş 1:1 oranında karıştırılmalıdır.
5. Şişelerden 10 ml numune alın, 15 ml plastik tüplere aktarın, hücreleri standart bir masa üstü santrifüjde 4.000 x g'da 10 dakika santrifüjleme ile hasat edin ve süpernatantı atın.
6. Hücreleri 0,5 ml taze LB ortamında yeniden biriktirin ve hücreleri steril 1,5 ml reaksiyon kabına aktarın. 0,5 ml% 50 steril gliserol ekleyin, süspansiyonu titiz bir girdapla karıştırın ve numuneleri bir sonraki tedaviye kadar -80 ° C dondurucuda saklayın.
7. Sallama şişelerinde kalan hücreleri 37 °C ve 220 rpm'de 24 saate kadar kuluçkaya yatırın. Floroforların fotoğraf ağartmasını önlemek için sallama şişelerini karanlıkta tutun.
8. 7 saat ve 24 saat büyümeden sonra 0,1 ml'lik daha fazla örnek alın. Numunelerin_1:10 seyreltmelerinin (C-Glc veya CE-Glc minimal ortamında) OD 600'lerini ölçün ve not edin.
9. OD_600/1.0 olan kriyostocklar yapmak için her kültürden uygun miktarda hücre alın. Numuneleri bir sonraki tedaviye kadar -80 °C'de saklayın.

3. Nicel Analizler için Numune Tedavisi, Kaplama ve Kuluçka

1. Tüm örnekleri topladıktan sonra, kriyostockları çözün ve hücreleri% 0,9 tuzlu su çözeltisinde seyreltin (reaktifler ve malzemeler tablosuna bakın) 10^-3'ekadar.
2. SP orta agar plakaları üzerinde 10 -3 seyreltmenin^0.1 ml'si plaka ve steril cam pipetler kullanarak hücreleri dağıtın.
3. Plakaları tek koloniler ortaya çıkana kadar karanlıkta 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.

4. Kantitatif Analiz için Stereo Floresan Mikroskopisi ile Hayatta Kalanları Saymak

1. Stereo floresan mikroskobu altında hayatta kalanları sayarken daha iyi bir yönlendirme için agar plakasının altını siyah bir kalemle dört parçaya bölün.
2. Plakayı mikroskobun altına baş aşağı yerleştirin ve soğuk ışık kaynağını kullanarak kolonileri odak noktasına getirin.
3. Koloniler odakta olduğunda, CFP etiketli gerinimde kalan hücreleri görselleştirmek için CFPiçin uygun filtre kümesine geçin. Kolonileri bir kalemle etiketleyerek bu gerginlikte hayatta kalanları sayın ve sayıyı not edin.
4. Etiketleri etanol ile çıkarın ve yfp etiketli gerinimde kalan hücreleri görselleştirmek için YFPfiltre kümesine geçin. Kolonileri bir kalemle etiketleyarak hayatta kalanları tekrar sayın ve sayıyı not edin.

5. Yarı Saydam Analizler için Örnek Tedavi ve Mikroskopi

1. Açıklayıcı rakamlar için, SP agar plakasındaki 3.1 adımından^{10 -4} seyreltmenin (yaklaşık 100 hücre) 10 μl'sini tespit edin (bkz. Şekil 3).
2. Plakaları tek koloniler ortaya çıkana kadar karanlıkta 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
3. Petri kabını kapaksız olarak mikroskop altına yerleştirin ve soğuk ışık kaynağını kullanarak noktayı odak noktasına getirin.
4. Açıklayıcı figürler için lekelerin fotoğraflarını çekin. Soğuk ışık kaynağı ile kolonilerin fotoğraflarını çekmek için uygun bir pozlama süresi seçin.
5. Plakayı hareket ettirmeden CFP filtre kümesine değiştirin, pozlama süresini ayarlayın ve fotoğraf çekin. Aynı şeyi YFP filtre kümesiyle de yapın ve daha fazla analiz için resimleri kaydedin.

6. Veri Analizi

1. Nicel veri analizleri için Excel gibi yazılımları kullanın. Sayılan kolonilere dayanarak, sarı ve mavi kolonilerin yüzdesini% 100 olarak ayarlanmış tüm koloni sayısına göre hesaplayın.
2. Yığılmış çubuk diyagramı oluşturmak için hesaplanan sayıları kullanın (bkz. Şekil 4 ve Şekil 5). Farklı noktalardan çekilen resimlerin birleştirilmiş resimlerini oluşturmak için Adobe Photoshop gibi bir görüntü işleme programı kullanın. Alternatif olarak, http://rsbweb.nih.gov/ij/ indirilebilen serbestçe kullanılabilen ImageJ yazılımı görüntü işleme için kullanılabilir.
3. CfP filtre kümesi ve YFP filtre kümesiyle çekilen resimleri tek bir noktadan açın. Medyadan gelen arka plan floresanlarını azaltmak için kontrastı ve parlaklığı optimize edin.
4. Resimlerden birine gidin ve tümlerini seçin. Resmi kopyalayın ve diğer resme yapıştırın.
5. Resimleri birleştirmek için "renk atlatma" işlevini kullanın veya kanallar sekmesini kullanarak floresan resimlerin üzerine bindirin. Farklı ortamlardan ve farklı zaman noktalarından kolonilerin birleştirilmiş resimleri, sıvı kültürü içindeki farklı suşların büyümesini temsil eder.

7. Özel İpuçları: Cfp ve yfp ile Etiketlenmiş İzojenik Suşların Boya Anahtarı Deneyi ve Cocultivation

B. subtilis'teki iki florofor kodlayan genden birinin ifadesi zindeliği ve dolayısıyla bakterilerin büyüme hızını etkileyebilir. Bu nedenle, ekim sırasında bir rakip suşunun hücre popülasyonundan elimine edilmesi sadece floroforun olumsuz etkisinden kaynaklandığını dışlamak için aşağıdaki deneylerin yapılması önerilir:

1. Tüm deneyi tekrarlayın ve ters etiketli suşları birlikte kullanın(örneğin, önceki cfpetiketli suş şimdi yfp geni ile etiketlenmiştir ve bunun tersi de vardır). Ters olmasına rağmen, elde edilen sonuçlar, bir suşun diğer suşa göre seçici bir büyüme avantajına sahip olduğu önceki gözlemle karşılaştırılabilir olmalıdır.
2. Tüm deneyi tekrarlayın ve yfp ve cfp ile etiketlenmiş izojenik suşları koordine edin (örneğin BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) ve BP41 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). Zaman içinde hücre popülasyonunun bileşimini takip ederek iki florofordan birinin bakterilerin zindeliği üzerindeki olumsuz etkisini tahmin edin.

Sonuçlar

Burada açıklanan yöntem, sırasıyla florofor cfp ve YFP'yi kodlayan cfp ve yfp genleri ile etiketlenmiş B. subtilis suşlarından oluşan bir hücre popülasyonunda tür içi rekabeti görselleştirmek için başarıyla uygulanmıştır. Şekil 3'tegösterildiği gibi, yöntem tür içi rekabeti çok açıklayıcı bir şekilde görselleştirmek için kullanılabilir. Örneklerin küçük alanlarda tespit haline getirerek, hücre popülasyonunun klonal bileşimi bir bakışta görünür hale getirildi. Nicel analizler iç...

Tartışma

Bakterilerin rekabetçi uygunluğunu analiz etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir¹⁶. Çoğu durumda bakteriler farklı antibiyotik direnç kasetleri ile etiketlenmiştir¹⁷. Yaklaşımımıza benzer şekilde, hücrelerin antibiyotik direnç kasetleri ile etiketlanması, tanımlanmış büyüme koşulları altında kokültivasyon sırasında bakterilerin rekabetçi zindeliğinin değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, bu yöntem kromozom^17'dekibelirli bir çekirgede birbirinden farklı hücrelerin rekabetçi uygunluğun...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
(NH4)2SO4	Roth, Almanya	3746
Agar	Difco, ABD	214010
Amonyum ferrik sitrat (CAF)	Sigma-Aldrich, Almanya	9714
CaCl < sub> 2	Roth, Almanya	5239
Glikoz Uygulaması	, Almanya	A3617
Gliserol	Roth, Almanya	4043
K2HPO4• 3H2O	Roth, Almanya	6878
KCl	Applichem, Almanya	A3582
KH2PO4	Roth, Almanya	3904
KOH	Roth, Almanya	6751
MgSO4&boğa; 7H2O	Roth, Almanya	P027
MnCl2	Roth, Almanya	T881
MnSO4• 4H2O	Merck Millipore, Almanya	102786
NaCl	Roth, Almanya	9265
Besin suyu	Roth, Almanya	X929
Potasyum glutamat	Applichem, Almanya	A3712
Tripton	Roth, Almanya	8952
Triptofan	Uygulaması, Almanya	A3445
Maya özü	Roth, Almanya	2363
1.5 ml Reaksiyon tüpleri	Sarstedt, Almanya	72.690.001
2.0 ml Reaksiyon tüpleri	Sarstedt, Almanya	72.691
15 ml Vidalı kapaklı plastik tüpler	Sarstedt, Almanya	62.554.001
Petri kapları	Sarstedt, Almanya	82.1473
1.5 ml Polistiren küvetler	Sarstedt, Almanya	67,742
15 ml Cam kültür tüpleri	Marka, Almanya	7790 22
100 ml Alüminyum kapaklı sallama şişeleri	Marka, Almanya	928 24
Steril 10 ml cam pipetler	Marka, Almanya	278 23
İnkübatör (28 ve 37 ° C)	New Brunswick	M1282-0012
Standart pipet seti (2-20 μ l, 10-100 & mu; l, 100-1.000 μ l)	Eppendorf, Almanya	4910 000.034, 4910 000.042,
1.5 ve 2 ml reaksiyon tüpleri için masa üstü santrifüj	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Almanya	75002425
15 ml plastik tüpler için masa üstü santrifüj	Heraeus Biofuge Primo R, Almanya	75005440
Standart spektrofotometre	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Almanya	80-2112-21
Stereofloresan mikroskobu	Zeiss SteREO Lumar V12, Almanya	495008-0009-000
Dondurucu (-20 ve -80 &derece; C)	-
Buzdolabı (4 & derece; C)	-
Otoklav	Zirbus, LTA 2x3x4,	Almanya-pH
metre	pH-metre 766, Kalimatik, Knick, Almanya	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Almanya	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Almanya
	Staedler, Almanya	317-9
Powerpoint programı	Microsoft, ABD-Office
Excel programı	Microsoft, ABD-Veri		işleme programı
Adobe Photoshop CS5	Adobe, ABD	CS6 ile değiştirildi, indir	Görüntü işleme için bilgisayar programı
pro 2011 yazılımı	Zeiss, Almanya	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Zeiss
Specific solution recipes
SP Orta
8 g Besin suyu
0.25 mg MgSO4• 7H2O
1 g KCl
Katı SP ortamı
gerekirse H2O			otoklav ile 121 ° C'de 20 dakika boyunca 1 L ekleyin; C
1 ml CaCl2 (0,5 M), filtrasyon
edilmiş 1 ml MnCl2 (10 mM), filtrasyon
edilmiş 2 ml amonyum ferrik sitrat (CAF, 2,2 mg/ml), filtrasyon
LB Orta
10 g Tripton
5 g Maya özütü
10 g NaCl
Katı			için 15 g agar
H2O			otoklav ile 1 L ekleyin; C
C-Glc Minimal Orta
200 ml 5 x C tuzları
10 ml L-Triptofan (5 mg/ml), filtrasyon
edilmiş 10 ml amonyum ferrik sitrat (CAF, 2.2 mg/ml), filtrasyon
edilmiş 10 ml III' tuzları
25 ml Glikoz (%20)			121 & °C'de 20 dakika otoklavlandı; C
steril H ile 1 L ekleyin H2< / sub>O
CE-Glc Minimal Orta< / güçlü >
200 ml 5 x C tuzları
10 ml L-Triptofan (5 mg / ml), filtrasyon
edilmiş 10 ml amonyum ferrik sitrat (CAF, 2.2 mg / ml), filtrasyon
edilmiş 10 ml III’ tuzlar
20 ml Glutamat (% 40)
25 ml Glikoz (% 20), 121 ° C'de 20 dakika otoklavlanır; C
steril H < alt > 2 < / alt > O
5 x C tuzları ile 1 L ekleyin
20 g KH2PO4
80 g K2HPO<>4 boğa; 3H < alt > 2 < / alt >O
16.5 g (NH < alt > 4 < / alt >) 2 < / alt > SO< alt > 4< / alt >
L steril H < alt > 2 < / alt >O			otoklav ile 121 & derece 20 dakika ekleyin; C
III' tuzları
0.232 g MnSO4• 4H2O
12.3 g MgSO4• 7H2O
, steril H2O ile 1 L ekleyin, 121 ° C'de 20 dakika otoklavlayın; C
% 40 Glutamat çözeltisi
200 g L-Glutamik asit
yaklaşık 80 g KOH
H2< / sub>O			otoklav ile 121 &° C'de 20 dakika boyunca 0.5 L ekleyin; C
0.9% Tuzlu (NaCl) Çözelti
20 dakika boyunca steril H2O			otoklav ile 1 L ekleyin; C
% 50 Gliserol çözeltisi
295 ml Gliserol (% 87)
H < alt > 2 < / sub>O			otoklav ile 121 ° C'de 20 dakika boyunca 0,5 L ekleyin; C
Bakteriler (Tüm suşlar Bacillus subtilis suş 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)	Laboratuvar suş toplama
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)