Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis'den Çalışması

Makrofajlar dahil olmak üzere, profesyonel fagositlerin, bağışıklık sisteminde önemli bir oyun. Doğuştan gelen bağışıklık sistemindeki ilk savunma hattı olmasının yanı sıra, aynı zamanda bir rol ^1-3 sunulması da sinyalizasyon ve antijen ile edinilmiş bağışıklık aktivasyonunda kritik bir rol oynamaktadır. Profesyonel fagositlerin işlevi çok yönlü iken, fagosom olgunlaşma profesyonel fagositlerin ^4,5 bakterisit ve antijen işleme fonksiyonlarının kritik bir omurgadır. Reseptör aracılı yutulma ve bakteriler gibi bir fagositik hedef, alımından sonra, olgunlaşmamış fagosom etkileşim ve endositik ağ bölümlerinde ve çeşitli diğer hücresel organel ⁶ değişim karmaşık ve iyi ayarlanmış bir dizisi boyunca geçer. Bileşiklerin yapısı, bu hücresel varlıklar olarak düzenlenmesi ile değiştirilir ve füzyon olayların zamanlama luminal phagosomal ortamı ve phagos belirleromal membran bileşimi ve böylece ^7, olgunlaşan fagozomun ⁸ kaderi.

Fagosom olgunlaşma fizyolojik alaka, kaçmak tutuklama veya fagosom olgunlaşmasını ⁹ yıkmak için çeşitli hücre içi patojenler tarafından istihdam çeşitli stratejiler ile örneklenmiştir. Hidrolitik enzim ve olgun fagozomun ⁷ arasında anti-bakteriyel faktörler bir kısmı ile endows geç endozomal / lızozomal bölmeli fagozomun füzyon: Bu stratejilerin çoğu doğrudan ya da dolaylı olarak fagosom olgunlaşma sürecinin son ve kritik aşamaya önlemek ^{, 8,10.} Doğal fizyolojik bir durum kullanılan ediliyor, özellikle deneysel ayarları altında etkilenen olumlu ya da olumsuz olması halinde, bu nihai ve kritik adım Analizi nedenle phagosomes olgunlaşma durumu hakkında güçlü göstergeler ile bize sağlayabilir ve.

Geç endozomal / lizozomal bölmesis genellikle çeşitli varlığı ile erken endositik bölmelerden tanımlanmış ve ayırt edici endositik yolunun terminal bölmeleri, spesifik, marker moleküllerin sahne olduğu kabul edilmektedir. Örneğin, diğerleri ¹¹ arasında Lizozomal ilişkili membran proteinleri (lambalar) gibi hidrolitik enzimler veya membran bileşenleri için. Terminal endositik bölmeleri-bundan böyle lizozomlar-da fagositik / endositik yolunun ¹² sonunda sindirim son aşamaları için ana konum olarak hizmet basitçe olarak anılacaktır. Bu şekilde, sindirilemez sondalar hücre dışı ortamdan endositoz ve makropinositoz yoluyla yüklenebilir ve alımı ve Chase belirlenmiş bir döngü takip sonra ^13,14 birikir lizozomlara endositik yolu aracılığıyla taşınır. ^15-17 endocyticprobes gibi organik sindirilemez polimer dekstran gibi floresan mikroskobu için fluorofor-konjuge problar yaygın olarak kullanılmaktadır.

14,18 kullanarak sunulan, toplanan time-lapse görüntüleme verileri, açık kaynak kodlu ve serbestçe kullanılabilir görüntü analiz yazılımı, Fiji (veya ImageJ) kullanılarak değerlendirilebilir anlatacağız.

Bizim yöntemin açıklaması ardından, benzer deneyler fagosom olgunlaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için modifiye ayarları ve faktörler kullanılarak dizayn edilebilir; hemen her otyapışık birincil veya hücre hattı fagositik hücrelerin kendi türü de dahil olmak üzere fonksiyon deneyler genetik kaybı gen nakavt ve knock-down, mutantlar veya füzyon proteinleri, fagositik-hedefler, microbead kaplama bileşikleri, endozomal / lizozomal sondaları ve faktörlerin böyle bir ifade diğerleri arasında sitokinler, kimyasal inhibitörleri veya siRNA bu yöntemin temel yaklaşım uygulanabilir tüm değişkenlerdir.

Biz aşağıdaki gibi bu yöntemin hedefi ve temel gereksinimlerini tanımlar:

• Yöntemin Hedef: fagositik canlı hücreler yüksek zamansal çözünürlüğe sahip fagosom olgunlaşma, doğrudan nicel ve nitel gözlem ve analiz sağlamaktır.
• Fagositik yük: Bir uygun şekilde kaplanmış mikro parçacık veya biyolojik hedef. Burada kolayca Fc-γ reseptörü aracılığıyla fagositoz ile içselleştirilir 3 um küresel polistiren mikro-IgG kaplı kullanın. Seçenek olarak ise, bir mikroorganizma ya da kaplanmış mikrofon, retina reseptör hücrelerde mevcut olduğu için roparticle kullanılabilir.
• Fagositik hücreler: Uygun fagositik reseptörlerini sentezleyen Yapışık fagositik hücreler. Burada bol Fc-γ reseptörlerini ifade fare primer BMMs kullanın. Alternatif olarak, dendritik hücreler (DC), monositler veya fagositik epitel hücreleri ya da bunların mutantlan ya da genetik knock-out varyantlar kullanılabilir.
• Lizozomal kargo: Bir floresan etiketli lizozomal prob. Burada, Texas Red-konjüge edilmiş dekstran 70,000 kiloDalton (Dex70kD) lizozomlara luminal yük olarak kullanılır. Alternatif olarak, bu asitlik veya indirgeyici kapasitesi phagosomal özellikleri için bir hücre bölmesi veya organel ya da uygun bir prob, floresan bir saptanabilir marker ile etiketlenebilir fagosom olgunlaşma ilerlemesini incelemek için kullanılabilir.
• Örneğin, molekülleri, kimyasal bileşikler, gen knock-down, ya da olabilir mutant proteinlerin geçici ifadesini sinyalizasyon: etkileyen faktörler. Burada, biz Förg varbasitlik uğruna böyle bir faktör biri kullanılması, ancak mutant protein ifade ve Kasmapour vd. ^18. phagosomes fagositozunu veya şartlar ve hareketlilik etkileyebilir ve / olabilir Herhangi bir faktör bakın lütfen knock-down etkileyen faktörler ile yeni bir örnek ya da olgunlaşma phagosomes etkileşim bölmeleri potansiyel olarak kullanılabilir.

Bu protokolde, hayvan bakımı ve bütün prosedürler, kurumsal ve ulusal kurallara uyun.

"Π-" önceden ile gösterilir hazırlıkları hazırlayın.

1.. BMMs hazırlanması

1. Servikal dislokasyon ile farelerin itlafı yapın.
2. Doku femur ve tibia kemikleri, ücretsiz kemikleri çıkarın ve kemik iliği erişilebilirlik için iki ucunu kesin.
3. Buz soğukluğunda PBS veya bir sonraki safhaya kadar buz üzerinde 100 ug / ml streptomisin ve 100 U / ml penisilin ve ile desteklenmiş buz soğukluğunda DMEM ortamında (in kemik tutun.
   Not: kontaminasyon riskini en aza indirmek için bir sınıf II biyogüvenlik kabini altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
4. Bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 26 G (0.45 mm) bir iğne kullanılarak soğuk PBS + penisilin / streptomisin ile medüller boşluğu yıkayın.
5. 10 dakika için 350 xg nazik santrifüj Pelet hücreleri, BMM med yılında pelletinisteril mikrobiyoloji yum ve plaka Petri yemekleri kaplanmamış.
   1. BMM ortamının hazırlanması
      • Dulbecco Modified Eagles Medium DMEM
      • % 10 FCS inaktive
      • % 20, fare fibroblast L929 hücre hattı kültürü yüzer maddesi (makrofaj koloni uyarıcı faktör, M-CSF kaynağı)
      • % 5 at serumu
      • 2 mM glutamin
   2. L929 hücre dizisi kültür ortamının hazırlanması,
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 ortamı
      • % 10 FCS inaktive
      • 2 mM glutamin
   3. Fare fibroblast L929 hücre hattı kültürü yüzer hazırlanması;
      • Konfluent L929 hücreleri, 175 cm kültürlenmiş, 1:4 oranında bölünmüş olan 20 ml L929 orta ve kültür süpernatanı kullanılarak, 2 gün için ^{2 şişe,} 48 saat sonra toplandı, süzüldü ve BMM-ortama ilave
6. Temizlendi hücreleri inkübe_CO2 atmosfer,% 5 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde femur.
7. Inkübasyon, her 48 saat (en fazla 72 saat) sonra, ortam aspire ve 10 gün boyunca, taze BMM ortam ile değiştirilir. Flow sitometri tarafından test olarak hücrelerin% 95'inden fazlası CD14 için pozitif idi. CD14 makrofajlar tarafından ağırlıklı olarak ifade edilen bir örüntü tanıma reseptörü olduğunu. Bu reseptör için pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenerek, yapışık BMMs saf bir kültürü oluşturuldu.

Not: diğer hücre tipleri kullanıldığında göre hücreleri hazırlamak ve kültür.

2. Fagositik Kargo olarak mikrotaneciklerin Kaplama

1. 1 ml boncuk süspansiyonu hazırlanması için,% 2.5, 400 ul 3 um karboksilatlanmış polistiren mikro ya da alternatif mikro kullanın.
2. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer boncuk süspansiyonu PBS ile 3 kez yıkama ve 500 mM 2 100 ul ekle - (N-morfolino) etanlarulfonic asit sodyum tuzu boncuk pelet, pH 6.7 de MES tamponu.
3. Steril GKD ₂ O 50 ul 50 ug fare IgG (poliklonal IgG antikoru) çözülür ve boncuk süspansiyonu ekleyin.
4. Steril GKD ₂ O (450 ul) ile 1 ml süspansiyon doldurun.
5. Oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde 15 dakika için çözelti inkübe edin.
6. 10 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda EDAC çapraz bağlayıcı, N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidroklorür hazırlamak ve boncuk süspansiyonuna 14 ul ekle.
   Not: EDAC çapraz bağlantıları boncukların yüzeyi üzerindeki karboksil grupları ile IgG amino gruplarına ve kordon yüzeyi üzerindeki IgG immobilizasyon kolaylaştırır. Bu boncuk alımı için çok önemlidir ve bu nedenle çözelti, taze hazırlanmalıdır olduğunu.
7. Oda sıcaklığında 1 saat için bir döner tekerlek üzerine süspansiyonu inkübe edin.
8. EDAC çapraz bağlayıcının 14 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat için bir döner tekerlek üzerine süspansiyonu inkübe.
9. Bir mikrosantrifüj içinde 2 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin süspansiyon.
10. Boncuklar durdurma tamponu içinde topağın tekrar askıda ve 2 dakika boyunca 10,000 x g'de çözeltisi iplik, çapraz bağlama reaksiyonu durdurmak için durdurma tamponu (10 mM Tris, pH 9.4 içinde% 1 Triton-X-100) içinde 3 kat yıkayın.
11. PBS'de 3x boncuk yıkayın ve 1 ml PBS içinde pelletini.
    Opsiyonel: 30-50 ul çalışma alikotları hazırlayın.
12. Artık 4 hafta boyunca 4 ° C'de IgG kaplanmış boncuk süspansiyon, depolama ve süspansiyon dondurulacak asla izin.

Not:% 0.02 'lik bir nihai konsantrasyona (ağırlık / hacim) bakteri gelişimini ve kirlenmeyi önlemek için süspansiyona ilave edilebilir da sodyum azit gibi bir koruyucu. Bu durumda önce kullanımına boncukların yıkama koruyucu sitotoksik etkilerinden kaçınmak için yapılabilir zorundadır. 2 dakika boyunca 10,000 x g'de süspansiyonun bir kısım santrifüj ve yeniden yıkamak ve boncuklarıPBS içinde süspansiyon pelet. Yıkama 3x tekrarlayın.

3. Dekstran Probe Stok solüsyonunun hazırlanması

1. Texas Red 70000 kilodalton çözündürülür 20 mg, PBS içinde Dextran (Dex70kD), üreticinin talimatlarına uygun olarak, -20 ° C / ml ve mağaza.
   Not: Birkaç aya kadar -20 ° C'de hisse tutun, ya da 4 ° C'de birkaç hafta için, üreticilerin belgelerine bakın.
2. (Seyreltilir olacak konsantre çözelti birkaç kat, yaklaşık 1 mg / ml 'de (DMEM,% 10 FCS, 2 mM L-glutamin) tam DMEM hücre kültür ortamı içinde seyreltilmesi ile stoktan deney için dekstran solüsyonu hazırlayın , hücrelere ilave edilmeden önce 20 ug / ml 'lik son çalışma konsantrasyonu).
3. Çözelti homojen hale getirmek ve daha sonra görüntüleme sırasında artefakt üretilmesine yol olabilir agrega çözmek için 5 dakika boyunca kısım dekstran sonikasyon için, bir ultrason banyosu su kullanın.
4. Maksimum g de santrifüjbir mikrosantrifüj içinde 5 dakika çözeltiden çözülmemiş her türlü yığınları ya da kirletici maddeleri uzaklaştırmak için.
5. Dikkatlice tüpün altındaki pelet kaçınarak, yeni bir tüpe süpernatant taşımak ve tam DMEM hücre kültür aracı maddesi içinde 20 ug / ml nihai konsantrasyona kadar çalışma çözeltisi seyreltin.
6. 0.2 um şırınga monte edilen filtre kullanılarak filtre-steril çözelti.

4. Dekstran Preloading

1. Tohum, canlı hücre görüntüleme cam alt tabak hücreleri ve eki ve iklime sağlamak için (% 5 _CO2 atmosferi içinde 37 ° C'de), en azından 12 saat boyunca inkübe edilir.
   Not: tabak başına (dört bölmeye kadar) birden fazla deneyler izin mevcut segmente cam alt yemekler vardır.
2. Protokol 3'te tarif edildiği gibi DMEM çözelti içinde dekstran hazırlayın. 37 ° C'de bir su banyosu kullanılarak, çözelti içinde DMEM hazırlanan dekstran ısıtmak
3. Aspire ortamı,nd alımı için 2-8 saat boyunca _CO2 atmosfer,% 5 37 ° C'de dikkatli bir şekilde hücrelere dekstran çözeltisi ekleyin ve inkübe edilir.
   Plan ve kullanılmış ve deneyler tekrarladığınızda kesinlikle bu süre tutmak olan prob ve hücre tipine göre protokol optimize: Not. Bu, endositik yolağındaki dekstran birikmesi Profile ve deneyler bu nedenle yeniden üretilebilirlik için gereklidir.
4. 3x ile önceden ısıtılmış tam bir DMEM ortam hücreleri yıkayın, aspirat orta ve taze ortam ile dikkatlice hücreler yıkayın.
5. _CO2 atmosfer,% 5 37 ° C'de 4-12 saat boyunca tam bir DMEM ortamıyla yapılan hücreleri inkübe edin.
6. Önceden ısıtılmış tam süzüldü kırmızı fenol içermeyen DMEM ortamı ile bir kez hücreler yıkayın.
7. En iyi sonuçları elde etmek için görüntüleme, görüntüleme başlamasından önce önceden ısıtılmış tam süzüldü fenol kırmızı içermeyen DMEM ortamı en az 30 dakika değiştirin. Fenol kırmızı arka plan gürültü artıyor, floresan sinyallerin söndürülmesine neden olabilir veböylece görüntü kontrastı ve netliği azaltır.

Not: kullanılan prob ve hücre tipine göre önceden planlanmış ve optimize protokole göre, mikroskop ve önceden görüntüleme ayarlarını ayarlayın.

5. IgG kaplı boncukların

1. Oda sıcaklığına kadar önceden hazırlanmış% 1 boncuk süspansiyonu bir kısım dengelenmesi 2-3 dakika süreyle bir ultrason banyosu içinde su sonikasyon.
2. Kontaminasyon (iyi bir başlangıç ​​konsantrasyonu 1 ul / 2 cm ² çanak yüzey) riskini en aza indirmek için bir sınıf II biyogüvenlik kabini altında tam süzülmüş kırmızı fenolsüz DMEM ortama% 1 boncuk süspansiyonu 1-6 ul ekleyin.
   Not: Burada BMMs 25,000 hücre / göz 'de ekildi ve% 1 stok boncuk süspansiyonu, 6 ul kabındaki ortam ilave edildi. Bu, yaklaşık 15:1 'lik bir boncuk / hücre oranına eşittir. Oranı kullanılır ve kordon malzemeye bir hücre türüne ayarlanmalıdır, i.e. polistiren boncuklar daha fazla sayıda çok daha hızlı ve böylece yapışık hücreler ile temas halinde gelir oysa lavabo ve lateks boncuk, düşük yoğunluğa sahiptirler ve hızlı bir şekilde dibe çöker, yok.
   Not: Deney bağlı olarak, önceden gözlenecektir bölgeyi belirlemek için bir avantaj olabilir. Boncuk süspansiyonu nedenle olumlu alımı olayları gözlemleme olasılığı artan, sadece cam alt yemeğin belirli bölgeye eklenebilir.
3. Boncuk yoğun bulut yavaşça cam alt çanak süspansiyon pipetleme dağınık olabilir.
4. Boncuklar, cam alt tabağın tabanına çöker ve yapışık fagositik hücreler ile aynı düzlemde yaklaşık kadar bekleyin.
5. Ilgi (ROI) bölgeye odaklanır ve zaman atlamalı görüntüleme başlar.

Not: görüntüleme kullanılan görüntüleme sistemine bağlı olarak, devam iken, bu sta odak ince ayar için gerekli olabilirbility ve gözlemlenen hücrelerin hareketlilik. Ancak, bu imkansız kılabilecek kuvvetle yeniden odaklama bir sonucu olarak odak düzleminden sapan phagosomes uygun analiz edin.

6. Görüntüleme

Optimum görüntü kalitesi için aşağıdaki genel yönergeleri izleyin;

1. Bu tür bir lazer-tarama ya da eğirme disk sistemi gibi bir konfokal görüntüleme sistemi kullanın.
   Not: Leica LAS AF yazılımı tarafından kontrol ve çevre kontrol odası ile donatılmış bir Leica TCS SP5 AOBS Lazer tarama konfokal mikroskop time-lapse video görüntüleme için burada kullanılmıştır.
2. Vb tarama hızı, büyütme, çözünürlük gibi görüntüleme ayarlarını optimize eder. el sistemine bağlı olarak her 7-20 saniye bir karenin bir oranda sağlamak için bir şekilde.
   Not: Burada, 200 Hz tarama hızı, 2x yakınlaştırma tarayıcı ve 512 x 512 piksel resu çözünürlükte 2-3x bir çizgi ortalama3-5 sn / rame arasında kayıt süresi içinde lted. Her 10 saniyede bir çerçeve bir oran en az 120 dakika süreleri time-lapse film kaydetmek için kullanıldı.
3. Kullanılan görüntüleme sistemi ve prob (lar) dayalı uygun uyarma / emisyon ayarlarını kullanın.
   1. Aşırı fotoğraf beyazlatma önlemek için ayarlarını optimize.
      Not: Burada, Texas Red Dekstran 70 kD bir DPSS (561 nm) lazer ve ışık emisyon 610 nm emisyon zirve ile 600-650 nm bir Leica melez detektörü (HYD) tarafından tespit edildi kullanarak heyecanlıydı. Lazer yoğunluğu, sinyal yoğunluğu üzere uyarlanmış ve fluorofor (ler) ve hücreleri üzerinde lazer ışığının verilmedi toksisite etkisinin foto-ağartma en aza indirmek için mümkün olduğu kadar düşük tutulmalıdır. Genel olarak, doğru ve kararlı sinyal şiddetini elde etmek tarama hızı, hat kavuşur, tarama çözünürlüğü, çerçeve aralığını ve görüntüleme süresini dengelemek ve boncuk alımı ve fagosom olgunlaşma yanlısı tam süresini yakalamak için önemlidircess.
4. Onlar floroforla ile konjuge değilse boncuk gözlemlemek için bir aydınlık alan (BF) kanalı da bulunmaktadır.
   Not: Texas Red kanalının yanında, BF kanal boncuk görselleştirmek için kullanılan, aynı DPSS lazer ışık kaynağı ve sinyal bir fotoğraf çarpan (PMT) detektörü ile tespit edilmiştir olarak kullanılmıştır.
   Not: harmanlanmış olan verileri satın alırken aynı kayıt ayarlarını uygulamak için emin olun. En önemli parametreler şunlardır: uyarma lazer şiddetleri, dedektör ayarı, satın alma ayarları, büyütme ve çerçeve aralıkları. Gözlem veri noktaları (her 12 sn de kare ile başka bir dizi ile her 7 saniyede edinilen kare ile bir gözlemi harmanlamak gibi) üst üste olmayacak gibi aynı kare aralıkları kullanılarak değil, bir eğri-ortalama adım gerektirecektir. Bu veri değerlendirme için gerekli adımları artırmak ve bu OriginLab gibi eğri-ortalama fonksiyonu ile ek yazılım, 'gerektirecektirs Origin Pro istatistik yazılımı ( http://www.originlab.com/ ).
5. Tercihen, kullanılan görüntüleme sisteminin yerli dosya formatında time-lapse video kaydetmek ve sıkıştırılmış formatlarda ihraç kaçının.

Not: (. LİF) İşte, zaman-lapse film sonra doğrudan Fiji açmak için ithal edilen yerli Leica LAS AF formatında dosyalar kaydedildi. Fiji dahil Bio biçimleri ithalatçı plug-in kullanarak en mikroskop üreticilerin yerel dosya formatlarını okuyabilir. JPG veya TIFF veya AVI konteyner formatında bir video dosyası olarak bir resim serisi time-lapse film dışa gerekli ya da tavsiye edilmez. Yerli mikroskop dosya biçimini kullanarak, kayıplı sıkıştırma algoritmaları (örneğin JPEG) kaçınarak orijinal bir gözlem mümkün olan en iyi görüntü kalitesini koruyarak ek olarak sigortalanır dosyanın meta-veri (zaman damgaları, büyütme, lazer ve satın alma yoğunlukları, Dedektör ayarları vs) korunur ve Fiji için mevcuttur. Herhangi bir nedenle, time-lapse video dosyalarını analizi için farklı bir formatta ihraç edilmesi gerekiyorsa Ancak, TIFF görüntü serisi ve ayrı RGB renk (kırmızı, yeşil, mavi) bu zaten kanalları gibi sıkıştırılmamış dosya biçimlerini kullandığınızdan emin olun Fiji genellikle başarıyla ihraç dosyaları diğer renk kanallardan BF kanalı ayrı olamaz gibi, adım. Ayrıca, bir referans olarak orijinal mikroskop dosyalarını korumak için emin olun.

7. Time-lapse Film Analizi

1. ImageJ, Fiji veya benzerleri sinyal dernek analiz yeteneği sağlar başka bir yazılım kullanın.
   Not: Burada, Fiji time-lapse film analizi için kullanılmıştır. Fiji ücretsiz indirmek için kullanılabilir yeniden araç menüler ve ek yerli eklentileri ile bir görüntü işleme paketini içeren bir İmageJ dağıtım http://fiji.sc . Bu mezhep açıklanan prosesiyon, Şekil 2'de gösterilmiştir.
2. "Aç", "Dosya" tıklayarak ve dosyayı seçerek, ya da sürükleyerek ve Fiji için dosyayı bırakarak tarafından Fiji dosyasını açın.
3. Aşağıdaki seçenekleri seçin;
   1. Görüntüleme Stack: Görünüm hyperstack ile yığını,
   2. Renk seçenekleri: Renk modu renklendirilmiş,
   3. Ayrı pencerelere bölünmüş kanalları: Bölünmüş kanal (kaydedilen her RGB renk kanalı için ayrı bir pencere açılacaktır).
4. Durumda bir resim serisi, "Dosya" "Import", "Görüntü Sırası" ve hedef görüntü serilerini içeren klasörde herhangi bir görüntü dosyasını seçmek giderek Fiji serisi yük kullanılacaktır.
   1. Set filtreler ve örneğin seri yükleme seçilen görüntüler için şartlar;
      1. Görüntü sayısı: yüklenecek kaç kare.
      2. Görüntüyü Başlangıç: serisinin başlangıç ​​kare olan görüntü.
      3. Artırmak: artımı arasındaçerçeveler (vb her karesini, her saniye çerçeve,.) yüklenecek.
      4. Dosya adı içeriyor: ("Kanal 1" den görüntüler çok kanallı bir time-lapse video renk-ayrılmasından sonra etiketli nasıl normalde "C001", ayarlayarak örneğin) dosya adını kullanarak belirli bir kanal için filtreleme.
5. , "... Ölçeği ayarlama", "Analiz" giden kutusu "Küresel" kontrol ve "ölçek kaldırmak için tıklayın" linkine tıklayarak ölçekleme çıkarın.
   Not: Bu adım farklı büyütme değerlendirilecek olan çeşitli deneysel setleri için kullanılmıştır halinde görüntülerin piksel göre analiz sağlar. Büyütme ayarları her zaman sabit tutulmuştur ve yerli mikroskop dosya doğrudan Fiji ithal ise Fiji mikroskop dosyasının meta gelen büyütme ve ölçek verileri anlamak ve kullanmak gibi, bu adım, atlanabilir.
6. Ölçüm parametre ayarlama"Area", "standart sapma", "Entegre yoğunluğu", "Ekran etiket" ve "gri ortalama değeri:", "Set Ölçümleri", "Analiz" olacak ve aşağıdaki kutuları işaretleyerek s.
7. Ölçülür ve "OK" ile onaylayın olmaktır sonda gelen sinyali içeren renk kanalına yönlendir.
8. Ölçümleri başlatılabilir vardır ve pencerenin üst kenarı üzerine tıklayarak BF kanal pencereyi seçmek hangi çerçeve gidin.
9. Içselleştirilmiş boncuk üzerinde dairesel bir yatırım getirisi, yani bir ilgi bölgesi (ROI) seçmek için "oval seçim aracı" kullanırlar. Seçim BF kanalda gibi görünen kordonun dış kenarına sıkıca takılı olduğundan emin olun.
   Not: PC kullanırken dairesel yatırım getirisi sağlamak için seçim aracını kullanırken, Shift tuşuna basılı tutun.
10. Optimal olarak boncuk tam yutulma önce birkaç kare tamamlandıktan ölçüm başlatın ve notBir tam olarak oluşmuş olgunlaşmamış Boncuk fagosom oluşturulur ve fagositik fincan kapalı olduğu kare edildiği. Bu, BF kanalı nispeten açık bir şekilde ayırt edilebilir olmalıdır.
11. "Analiz" ve ölçüm yürütmek için "Tedbir" tıklayın gidin; sonuç "Sonuçlar" başlıklı ayrı bir pencerede görüntülenir.
12. , Sonraki kareye git boncuk taşındı durumunda ROI konumunu ayarlamak ve ölçümü tekrarlayın. Sonuç sonuç penceresinde listesine eklenir, her analiz çerçevesi "Etiket" sütunundaki değere göre tespit edilebilir.
    Not: (tedbir için örneğin "M") kısayol tuşlarını kullanarak önemli ölçüde değerlendirme sürecini hızlandırabilir; kısayol listesini görmek ve menüden "Eklentiler" altında kostüm olanları atayabilirsiniz.
13. Ilgili tüm çerçevelerin ölçümü tamamladıktan sonra, sonuçlar MS Excel gibi bir elektronik tablo uygulamasında kopyalanabilir. Sütun "IntDen" intensitie gösteriyorölçüm yönlendirildi olduğu kanalda seçilen alanın s.

8. Beyazlatma Düzeltme

Kullanılan prob ve görüntüleme ayarlarınıza bağlı olarak, foto-ağartma oluşabilir. Onun ölçüde bağlı olarak, bu güçlü değerlendirmenin sonucunu etkileyebilir. Ancak, bu etki kısmen ölçülen değerlere değişimin eşit ama zıt oranı uygulanarak düzeltilebilir. Eğer mevcut ise, foto-ağartma katsayısı her fagozomun analizine uygun bir zaman aralığında, bütün çerçeve içinde zamana bağlı sinyal yoğunluğu azalma veya çerçevenin, özellikle kırpılan alanı ölçülerek hesaplanabilir. Bu işlem, Şekil 3 ve 4'de tasvir edilmiştir.

1. Fiji "Eklentiler" menüsü altında, tam çerçeve içinde genel bir düşüşe, ya da zamanla ROI spesifik prob sinyal yoğunluğu (Şekil 3 belirlemek için "Zaman Serisi Analyzer" plug-in'i kullanabilir.)
   Not: Zaman Serisi Analiz plug-in indirmek için kullanılabilir http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Eklentiler menüsünde durumda zaten mevcut değil.
2. Sadece analiz fagozomun çerçevelerine tekabül eden çerçeveler için, MS Excel'de (saniye olarak) zamana karşı ölçüm çizilir.
3. Arsa için bir lineer trend-line (Şekil 4A) uygulamak; azalan sinyal için bir negatif eğim foto-ağartma etkisinin varlığını gösterir.
4. Bir analiz fagozomun (Şekil 4B ve 4C) gelen değerlere ters eğim uygulayın: Düzeltilmiş sinyal yoğunluğu (SI) = ham SI + (zaman saniye * eğim ters)

Not: Her bir analiz fagosom kaydedilmiş bir time-lapse film sırasında (tam alım çerçeve başlayarak), belirli bir zaman dilimine sahip olacak, fotoğraf-bleaching belirli süre için yeniden hesaplanmalıdır ve bu özel fagozomun itibaren ölçülen değerlerin düzeltilmesi için geçerli olacaktır.

9. Veri Değerlendirilmesi

1. Verileri harmanlayın ve uygun yazılım ağartıcı düzeltilmiş değerlerinin ortalama ve istatistiksel hata hesaplar.
2. Uygun bir biçimde değerlendirilen veriler çiziniz.

Not: Burada, bilimsel istatistikler ve yazılım GraphPadPrizmasındaki komplo ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ) kullanılmıştır. Prizma yazılım sürece tüm veriler aynı kare hızını (yani tüm bu tek bir kare her 10 sn gibi aynı aralıklarla ile elde edilmiştir) gibi ilgili hata göstergeleri ile ortalama bir eğri oluşturmak ve çizmek mümkün değildir.

Not: aynı experim tekrarlar içinde mutlak SI değerlerinin Geniş varyasyonlarıent kümesi çok büyük istatistiksel hata tanıtmak ve veri kullanılamaz hale getirecektir. Protokol, örneğin görüntüleme ayarları, harmanlanmış olması farklı deney tekrarları arasında kesinlikle özdeş tutulan, bu durum olabilir.

Görüntüleme için hücrelerin ve boncukların doğru hazırlama kritik önem taşır. Şekil 1 BMMs için Optimize edilen protokolüne bağlı olarak tohumlama, prob yükleme ve bu yöntemde ilk görüntüleme adımlar, ana hatlarını göstermektedir. Bu protokol parametreleri hücreleri ve kullanılacak olan sondaların türüne bağlı olarak test edilmiş ve optimize edilmesi bu nedenle önemlidir.

Önceden yüklenmiş hücrelere IgG kaplı boncuk ilave edildikten sonra, bu büyütme önceden tanımlanmış ayar tutarken görüş alanı mümkün hücrelerin en çok sayıda potansiyel alımı olayların en büyük sayı temin etmek üzere, bir şekilde seçilmiş olmasına dikkat edilmelidir Protokolün. Şekil 2'de gösterildiği gibi, bu yaklaşım, her zaman atlamalı video analiz phagosomes daha büyük bir sayı için sağlayabilir. Her bir deney grubu video verim başına veri noktaları artırmak için ek olarak, bu değişik periphe tarafından tanıtılan varyasyonu azaltırral koşulları ve verilerin sağlamlığını arttırır.

Bu sinyal dernek ölçüm prosedürü (Şekil 2) aynı kişi tarafından ve kör bir şekilde mümkünse yürütülen tavsiye edilir. Bu, her fagozomun atanan ROI seçilir ve her çerçeve sonra elle taşınacaksa gibi, birden çok kişisel-hata kaynaklarını ortadan kaldırarak hatayı azaltmak ve önyargı azaltmaya yardımcı olabilir.

Doğal olarak kural "daha büyük örneklem büyüklüğü, daha iyi" burada da geçerli olsa, hepimiz davranış olarak tek bir hücreye çok fazla ağırlık vererek önlemek için görüş alanında hücre başına en fazla 5 boncuk-phagosome değerlendirilmesi önlemek Aynı kültür içinde hücreler zorunlu 19 homojen değil. Bu phagosomes mümkün olduğu kadar rasgele seçilmiş olması gerekir. Bu çerçevede, bu tür phagosomes da görüntülemenin tüm süresi için odak düzleminde tam olarak görülebilir olması ve aynı parametreler olmamaAşırı fotoğraf beyazlatma etkilenen önemlidir. Ayrıca, tek bir hücre tarafından büyük bir parçacık iken aşırı sayıda bu hücredeki phagosomes için füzyon dinamikleri etkileyebilir, bu nedenle öncelikli nispeten "boş hücre", daha önceden bu süreçte Alınan olan phagosomes verilmelidir. Genel bir kural olarak, (25 phagosomes kadar bu nedenle,) göre en fazla beş bağımsız deneyin en az beş hücrelerden gelen ortalama değerleri iyi istatistiksel anlamlılık sağlamalıdır.

Bazı çok foto stabil iken bazı sondalar güçlü kasar yaşayacaktır gibi olası bir foto-ağartma etkisi (Şekil 3) tespit etmek Zaman Serisi Analizi uygulama veya benzer bir yöntem, çok önemlidir. Güçlü bir ağartma etkisi aynı sonda ile tüm deneylerde gözlenmiştir ise foto-ağartıcı düzeltme adımı (Şekil 4), sadece uygulanmalıdır. Bu dikkat edilmesi gerektiğini, bu işlem yalnızca kısmen doğrubeyazlatma etkisi. Önemlisi, sadece birkaç durumda aşırı ağartma tür yanlış uyarma veya görüntüleme ayarları, yanlış orta pH, sağlıksız hücreleri veya nonfresh reaktifleri gibi nonoptimal koşullar, bir işareti olabilir.

Şekil 5C'de, boncuk fagosom Şekil 5A'da bir ok ile gösterilen ve Şekil 5B'de, analiz edilir ve 90 dakika arasında bir zaman dilimi sırasında phagosome olgunlaşması için Dex70kD sinyal yoğunluğu (SI) birleşme çizilir. Eğrisinin gürültü kaynağı nedeniyle bu tür diğer fagosom ve odak düzlemi dalgalanmalar analiz fagozomun tıkanması gibi faktörlere ölçülen sinyalin varyasyonları çerçeve çerçeve. Ancak, fagozomun sinyal dernek zamansal eğilim kolayca açıktır. Şekil 5A'da görünen iki hücre 10 phagosomes arasındaki analiz ortalama sonra ortalama eğrisi (Şekil 5D) çizilebilir hangi istatistiksel eRROR ortalamanın standart hatası (SEM) ya da örnek boyutu ve deneysel koşullara bağlı olarak, standart sapma (SD) olarak çizilebilir. Ortalama eğrisinin mutlak SI değerleri, tek bir analiz fagozomun bu genellikle farklı olsa da, normal olarak temporal eğilim çok benzer. Analizinden sonra, vahşi tip BMMs boncuk-phagosomes için lizozomal lümen kargo olarak Dex70kD teslim fagositozundan sonra 35-40 dakika içinde bir platoya ulaştığı sonucuna varılabilir.

Bu nedenle bu yöntem fagosom olgunlaşma sürecinde çeşitli faktörlerin kalitatif veya kantitatif etkisini incelemek için kullanılabilir.

Şekil 1. Görüntüleme için hücrelerin hazırlanması. Önceden hazırlanmış BMMs ilave edilmeden önce bir cam alt tabak en az 12 saat içinde tohumlanırdekstran, bir ortam içinde dekstran çözeltisi, 20 ug / ml konsantrasyonda ilave edilir ve 2-8 saat (yükleme) inkübe edildi, hücreler yıkanır, taze ortam ilave edilir ve hücre en az 4 saat (Chase) inkübe edilir, hücreler tekrar yıkanır ve boncuk süspansiyonu hemen önce görüntüleme başlangıcına eklenir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Görüntü analizi için adım öğretim adım. Fiji farklı kanallarda time-lapse video veya görüntü sırası yükledikten sonra, değerlendirme (şekil bir görüntü kolaj gösteriyor ve burada gösterilen tüm pencereleri aynı anda açık kalacak değil unutmayın bu adımları takip .) (A) menü, piksel "Analiz" Altındamesafe ölçeklendirme görüntülerin meta-veri Fiji mevcut değildir durumunda reset, farklı büyütme önceden Fiji kullanılmakta olan veya time-lapse kayıtları (, (b) "Ölçeği ayarla" giderek, farklı büyütme altındadır c) Bütün sonradan yüklenen görüntü serisi sıfırlama geçerlidir "Küresel" kutucuğu işaretleyerek ve "Ölçeği çıkarmak için tıklayın" linkine. (D) parlak bir alan (boncuk-phagosomes açıkça görülebilir) (BF) kanal görüntü serisi ve sonda sinyalini içeren kanal hem yüklü ve aynı çerçeve sayılarını ve piksel boyutlarını, örneğin sahip olduğundan emin olun. 450 x 450 piksel boyutları her 400 çerçeve iki dizi. (E) "Analiz" menüsü altında, değerlendirme parametreleri "Area", "Entegre yoğunluğu" ve "Display etiket" parametreleri seçilmiş olması "Set Ölçümleri", altında ayarlanabilir. (F (G) Bu kırmızı kanallı noktalı çizgi ve beyaz ok ile gösterilen bu İlgi (ROI) aynı bölgede kırmızı-kanal yoğunluk ölçümünü sağlar. Genelge ROI "Oval" seçim aracını kullanarak BF kanalda seçilir. (H) "Analiz", "Tedbir" veya kısayol komutunu kullanarak altında ölçümü başlatın ve deney istenen süresi (örneğin 90 dakika) için bütün serinin her çerçeve için tekrarlayın. Her çerçeve içinde, hareket ve ilgi boncuk fagozomun için ROI konumunu yeniden ayarlamak ve BF serisinin bir sonraki kareye gidiyor ve otomatik olarak "Tedbir" komutunu vererek kırmızı kanalın ilgili çerçevesindeki yatırım getirisini ölçen unutmayın. (I) Ölçüm sonuçları"Sonuçlar" penceresinde bir liste olarak görünecektir. "Label" sütunu altında, her bir hat için tam çerçeve açıkça belirtilir; tek bir çerçeve tekrarlanan ölçüm için ya uzun resim serisi çerçeveleri atlanır kontrol etmek için kullanabilirsiniz. (J) entegre yoğunluğu için kısa "IntDen" kritik çıkış parametresi olarak; değerlendirme ile devam etmek için bir MS Excel sayfası azından etiket ve "IntDen" değerleri kopyalayın. IntDen değerin birimi tanımsız ve keyfi birim (au) olarak gösterildiği gibi, bu sürece protokolleri sıkı takip edilir gibi herhangi bir sorun yaratmaz. Ölçek çubuğu 10 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. Fotoğraf-beyazlatma analizi.60; faiz kanalında (a) Açık resim serisi ve gerekirse ölçeği kaldırıldı emin olun, (b) "Eklentiler" menüsüne tıklayın (c) "Time Series Analyzer" altında. (D) dikdörtgen seçim aracını kullanarak, hemen hemen tüm çerçeveyi kapsayan bir dikdörtgen ROI, ya da filmin süresinin tamamı, (e) Seçilen ROI eklemek için ilgi azından tüm hücre çizmek, (f) tıklayın "ortalama almak Zaman İzler "ve (g) Sonuçlar gösterilecektir" "tablosu ve" Zaman Ortalama "komplo İzler. Sadece bir "ortalama" (yoğunluğunu ortalama) değeri kare sayı değil "IntDen" değer karşı çizilen olduğunu, ancak unutmayın. Az (h) aynı karede aynı ROI için "IntDen" ölçmek için, herhangi bir diğer parametreleri değiştirmeden menü, run "Tedbir", "Analiz". Bu Me eşdeğer sağlayacak"IntDen" bir yoğunluk, dönüşüm faktörü ("Area" eşit) hesaplamak ve MS Excel saniye zamana karşı tam çerçeve ROI "IntDen" çizmek için bu değeri kullanın. (J), "Liste" tıklayın bir Excel sayfası değerler listesini kopyalama ve "Mean" değerler "IntDen" değerleri dönüştürmek. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 4. Fotoğraf-beyazlatma düzeltme. Kullanılan prob ve görüntüleme ayarlarınıza bağlı olarak, foto-ağartma oluşabilir. Bu güçlü bir değerlendirmenin sonucunu etkileyebilecek. A) bütün çerçeveden prob Ham IntDen değerleri (au), MS Excel saniye zamana karşı çizilmiştir. Bir doğrusal eklemetrend çizgisi,.. açıkça negatif eğim düzeltme formülü kullanarak ham IntDen üzerinde düzeltilmiş IntDen C) Düzeltilmiş IntDen değerlerini ters yansımalar verimleri uygulayarak, bir örnek olarak, foto-beyazlatma etkisi varlığını B) gösterir kısmen telafi edilir fotoğraf-beyazlatma etkisi. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,. Temsilcisi hücreleri, kinetik ve düzeltilmiş sinyalin ortalamanın Sunumu. A) BMMs okla gösterilen IgG kaplı boncuk alımından sonra dakika 0 ° C'de dekstran probu ile yüklendi. Ölçek çubuğu 10 mikron. Tekabül Film 1 B) 2.5X alındıktan sonra, ImageJ "talasemi" Look-up-table (LUT) ile daha iyi görüş için yanlış renkli 85 dakikalık bir zaman dilimi içinde belirtilen phagosome gösteren, bir time-lapse film eklemek yakınlaştırılmış. Ölçülen fagosom ROI beyaz kesik çizgi ile gösterilir. Fagozomun dekstran teslimat birikiminin örnekleri beyaz oklarla gösterilmiştir. C)), belirtilen fagozomun. D lizozomlara teslim Texas Red 70kDa dekstran floresan sinyalini düzeltildi ± SEM iki belirtilmedikçe hücreler içinde 10 phagosomes ikinci IntDen floresan değerlerinin ortalaması . resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.