Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

11.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51202

⸱

27 Ocak 2014

 , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, College Station, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, Texas A&M Health Science Center, Texas A&M University, College Station

Bu makalede

Özet

Bir bölünmüş intein aracılı protein hidrojel sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein kopolimerleridir. İki protein kopolimerlerinin Karıştırma bir hidrojel halinde kendi kendine birarada monte edilmiş bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-ekleme reaksiyonunu tetikler. Bu hidrojel yüksek pH ve sıcaklık-stabil, organik solventler ile uyumlu ve kolayca fonksiyonel küresel olan proteinleri içermektedir.

Özet

Bir bölünmüş intein katalizli protein trans-ekleme reaksiyonu ile aracılık ettiği bir hidrojel oldukça dengeli bir protein sentezini sunar. Bu hidrojel yapı blokları, her bir bölme intein bir çapraz bağlayıcı ve bir yarısı olarak görev yapan bir trimerik bir protein alt-birimini ihtiva eden iki protein blok kopolimerleridir. Bir çok hidrofilik gelişigüzel kıvrımlı bir su tutma için blok-kopolimerlerin birine sokulur. İki protein blok kopolimerlerinin karıştırılması iki ucunda çapraz bağlayıcı ile bir polipeptit ünitesi, sonuçta bir intein trans-birleştirme reaksiyonu tetikleyen bir hidrojel içine hızlı bir şekilde kendi kendini toplanır. Bu hidrojel, 50 ° C 'ye kadar, ve organik çözücüler içinde sıcaklıklarda, hem asidik hem de bazik koşullar altında, çok kararlıdır. Kesme kaynaklı rüptür sonra hidrojel hızla reformlar. Hidrojel yapı bloğunun bir "bağlantı istasyonu peptid" dahil edilmesi "yerleştirme protein"-etiketli hedef proteinlerin uygun bir birleşme sağlar.Hidrojel, bir doku kültürü büyüme ortamı ile uyumlu olan 20 kDa moleküllerin difüzyon destekler ve küresel biyoaktif proteinlerin immobilizasyon sağlar. Organik bir çözücü ile uyumlu katalizör olarak intein aracılı protein hidrojelin uygulama yaban turpu peroksidaz enzimi içine alıcı ve destekleyici aktivitesi ile gösterilmiştir.

Giriş

Proteinlerin tamamen yapılmış Hydrogcls ölçüde doku mühendisliği, ilaç dağıtım ve biofabrication 1 gibi çeşitli alanları ilerlemek için potansiyeli taşımaktadır. Onlar biyouyumluluk ve noninvaziv biyoaktif küresel proteinlerin birleşmesiyle desteklemek için potansiyeli de dahil olmak üzere geleneksel sentetik polimer hidrojeller üzerinde avantajları sunuyoruz.

Bu çalışmada, bir protein immobilizasyon iskelesi olarak bölünmüş bir intein aracılı protein trans-birleştirme reaksiyonu ve uygulama (Şekil 1) ile oluşturulan yeni bir protein hidrojel gelişimini tarif eder. Bu hidrojel için yapı blokları her bir (IN ve IC) intein bir bölünme ve çapraz bağlayıcı bir multimerik proteinin bir alt birimin N-ya da C-terminali fragmanını ihtiva eden iki protein blok kopolimerleridir. Intein Nostoc punctiforme (NPU) gelen DnaE 2,3 intein bölünmüş ve küçük bir trimerik protein Pyrococcus (12 kDa) Cuta horikoshii kullanılmıştır/ Em> çapraz bağlayıcı protein, 4,5 olarak kullanılmıştır. Farklı çapraz bağlayıcı bir çok çapraz bağlanmış protein ağı (hidrojel) oluşumuna yol açan, intein katalize trans-birleştirme reaksiyonu yoluyla birleştirilmektedir. NPU intein nedeniyle hızlı reaksiyon kinetiği (t 1/2 = 63 sn) ve yüksek trans-yapıştırma verim (yakın% 80) 2,3 seçildi. Cuta protein yüksek stabilite nedeniyle çapraz bağlayıcı olarak seçildi. Cuta trimerleri 150 ° C civarındaki bir sıcaklığa sahip ve denatürasyon kadar 5 M kadar guanidin hidroklorür 4,6 ihtiva eden çözeltiler içinde trimerik kuaterner yapıyı muhafaza eder. Farklı çapraz bağlayıcı arasındaki alt birimi değişimi fiziksel hidrojel yüzey erozyonu 7 önemli bir etken olduğundan, Cuta de çok güçlü arası alt birimi etkileşim daha istikrarlı bir hidrojel lider, bu tür alt birimi alışverişi caydırıcı olmalıdır. Bu yapı taşlarından bir su da kolaylaştırmak üzere, orta blok olarak çok hidrofilik bir peptid S-fragmanını içerirtutma 8.

İki hidrojel yapı taşlarından karıştırılması her iki terminalinde de çapraz bağlayıcı ile daha uzun bir polipeptid zincirini üreten, fragmanları intein IN ve IC arasında bir trans-ekleme reaksiyonunu başlatır. Birden fazla bu tür moleküler birimlerden çapraz bağlayıcılar yüksek çapraz bağlanmış hidrojel ağ (Şekil 1A) oluşturan, birbirleri ile etkileşim. Belirli bir "bağlantı istasyonu peptit" (DSP), bir "bağlantı proteini" (DP) ile etiketlenmiş, hidrojel içine hedef proteini kararlı hareketsiz kılınmasını temin etmek için, hidrojel yapı taşlarından birine dahil edilir. Hidrojel montaj aracılık etmek intein bir bölünme kullanılması hedef proteinler önce hidrojel oluşumuna yüklü olarak, protein sentezi için hidrojel ek bir esneklik sağlar, ancak aynı zamanda tüm hidrojel boyunca hedef proteinin yüksek yoğunluklu, düzgün yüklenmesini sağlar sadece.

Intein aracılığında protein hidrojel oldukça sta olduğuile sulu bir çözelti içinde ble az-oda sıcaklığında 3 ay sonra tespit erozyon. Stabilite pH (6-10) ve sıcaklıklarda (4-50 ° C), geniş bir aralıkta muhafaza ve hidrojel aynı zamanda organik çözücüler ile uyumludur. Yeşil floresan protein (GFP) ve yaban turbu peroksidazı (HRP) Bu hidrojel, iki küresel proteinlerin immobilizasyonu için kullanılır. Ikinci protein tutulmasıyla Hidrojel, bir organik çözücü içinde, Biocatalysis gerçekleştirmek için kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Plasmid Yapı

Not: tüm genler, üreticinin talimatına göre Phusion High Fidelity-DNA polimerazı kullanılarak PCR reaksiyonları, standart altında amplifiye edildi. Klonlama için kullanılan primerler, daha önce 9 tarif edilmiştir. Tüm yapılar, Tablo 1 'de listelenmiştir.

  1. Cuta-NpuN (N, Tablo 1) oluşturmak için:
    1. PCR, uygun primerler kullanılarak, sırasıyla, plazmidler pET30-Cuta-Tip1 10 ve KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, ikinci Cuta ve NpuN genleri amplifiye.
    2. Uygun kısıtlama enzimleri ile sindirilmesi, bu parçaları ve ardışık T7 promoteri ve N-(Şekil 2A) oluşturmak için bir C-terminal 6xHistidine etiketi arasındaki pET26b vektörüne bu parçaları yerleştirin.
  2. NpuC-S-Cuta (C, Tablo 1) oluşturmak için:
    1. PCR güçlendir NpuC, Cuta ve S parçalanmasınaUygun primerler kullanılarak plazmid KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-Cuta-Tip1 10 ve 10 pQE9 AC sırasıyla ATRP 12, ikinci t [3 AG (PEG)] 10,.
    2. Uygun kısıtlama enzimleri ile sindirilmesi, bu parçaları ve sırasıyla T7 promoteri ve C (Şekil 2B) oluşturmak için bir C-terminal 6xHistidine arasındaki pET26b vektörüne bu parçaları yerleştirin.
  3. : NpuC-S-SH3 lig Cuta-(Cı-SH3 lig, Tablo 1) oluşturmak için
    1. PCR yükseltin Cuta bir SH3 Lig (PPPALPPKRRR) ve fragman SH3 lig-Cuta oluşturmak için esnek bir bağlayıcı (GGGGS) 2 ihtiva eden primerler kullanılarak.
    2. Fragmanı SH3 lig-Cuta ile C Cuta geni değiştirin.
  4. SH3-GFP (Tablo 1) oluşturmak için:
    1. Kullanılarak plazmid pJD757 13 SH3 geni yükseltinUygun astarlar.
    2. GFP geni, bu sigorta fragmanı ve T7 promotörü (Şekil 2C) ve bir C-terminal 6xHistidine etiketi arasındaki pET26b vektörü içine yerleştirin.

2. Protein Expression

  1. Uygun ekspresyon plazmidi ile, kimyasal olarak kompetan Escherichia coli BL21 (DE3) 50 ul dönüşümü.
  2. Transformasyondan sonra, seri olarak, bu hücreler, seyreltik ve Luria-Bertani (LB) bunları plaka / 50 ug / ml kanamisin içeren agar plakaları.
  3. ~ 15 saat boyunca 37 ° C 'de, dönüştürülmüş hücreler içeren inkübe edin.
  4. İnkübasyondan sonra, koloniler 50-100 ihtiva eden bir levha almak ve LB suyu içinde 5 ml tüm koloniler tekrar süspansiyon.
  5. Aktarım 1 L kanamisin içeren LB suyu (50 ug / ml) süspansiyonu ve 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de hücreler büyür. 600 nm (OD 600) de emicilik izleyin. OD 600 ~ 0.8 kadar kültür büyütün.
    1. C ve C-SH3 lig için, kültür (1 mM nihai konsantrasyon), izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenmesi ile protein sentezlenmesinin uyarılması ve 250 rpm ile çalkalanarak bir 4 saat boyunca 37 ° C 'de kültür inkübe edin.
    2. N ve SH3-GFP için, kültür soğutmak için ~ 5 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde kültür şişesi içine daldırarak 18 ° C. Kültürü (1 mM nihai konsantrasyon) için IPTG eklenerek protein ifadesini uyarmak ve 250 rpm ile çalkalanarak bir 14-18 saat boyunca 18 ° C 'de kültür inkübe edin.
  6. Protein ekspresyonu sonrasında pelet toplamak için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 6,000 x g de santrifüj kültür. -80 ° C'de kullanıma kadar saklayın hücre pelet.

3. Protein Saflaştırma

  1. N saflaştırılması (denatürasyon koşulları)
    1. Islak topak, 10 ml / g Tampon A (Tablo 2) içerisinde yeniden süspanse hücre topakları.
    2. ImmersBir buz-su banyosu içerisinde pelet süspansiyon e ve (1 sn darbe ve 1 dakika için 6 saniye ara ile Amp 10) sonikasyon ile hücrelerin bozulması.
    3. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüje lizat
    4. Süpernatant atın. (8 M üre ihtiva eden) Tampon DA pelet yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 xg'de santrifüj süspansiyon
    5. Daha önce tampon DA ile dengelenmiş bir 5 ml Ni-nitrilotriasetik asit (NTA) kolonundan süpernatant geçirir.
    6. 45 mM imidazol ile desteklenmiş Tampon DA 30 ml ile kolondan yıkanır. 150 mM imidazol ile takviye edilmiş tampon DA 20 ml kullanılarak arıtılmış proteininin elüt edilmesi.
    7. 3.1.7.1 ve 3.1.7.2 'de verilen aşağıdaki yöntemlerden birini biri ile <1 mM protein numunedeki üre konsantrasyonunu azaltmak:
      1. <20 kDa kesme ile tüpler kullanılarak 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca DPBS tamponu (Tablo 2) protein Dialyze.
      2. Santrifüj, 30 ve # protein saflaştınldı160, 2,800 xg kDa ultra-süzme spin kolon, 4 ° C hacme kadar az 1 ml'dir. Protein numunesinin seyreltilmesi için sütun 14 ml DPBS tamponu ekleyin. Santrifüj / seyreltme üç kez daha tekrarlayın adımları.
    8. Tampon değişimi sonra, saflaştırılmış protein (final 2 mM) ile ditiotreitol (DTT) ekleyin ve 2,800 x g'de, 30 kDa'lık bir ultra-süzme spin kolon, 4 ° C ile santrifüj ile ~ 100 mg / ml protein konsantre
    9. Kullanılana kadar -80 ° C'de konsantre edilmiş protein ve mağaza kısım.
  2. C ve C-SH3 lig saflaştırılması (yerli koşul)
    1. Tampon B 10 ıslak topağın ml / g 1x proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiş (pH 6.0) (Tablo 2) içerisinde yeniden süspanse hücre topakları. Hedef proteinin proteolitik bozulmasını en aza indirmek için asidik tampon kullanarak.
    2. 3.1.2 de tarif edildiği gibi, sonikasyon ile bir hücre süspansiyonu bozabilir. Lys santrifüj4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 xg'de yedi ve süpernatant tutun.
    3. Daha önce tampon B ile dengelenmiş bir 5 ml'lik Ni-NTA sütunu üzerinden Çözünür lizat KATKISI
    4. Tampon B ile yıkayın kolon 45 mM imidazol ile takviye edilmiş ve 150 mM imidazol ile desteklenmiş Tampon B, 20 ml hedef proteininin elüt edilmesi.
    5. C, 3.2.6 adıma atlayın. C-SH3 lig için, adımda verildiği gibi kısmen bozulmuş protein çıkarmak için ek bir iyon değişimli arıtma adımı 3.2.5.3 için 3.2.5.1 gerçekleştirmek
      1. 3.1.7 'de tarif edilen prosedür takip edilerek <1 mM'ye kadar C-SH3 lig NaCl konsantrasyonunu azaltır.
      2. Daha önce sodyum fosfat tampon maddesi (50 mM, pH 7.0) ile dengelenmiş bir 5 ml anyon değiştirici boncuklu agaroz matrisi sütunu üzerine hedef proteini yerleştirin.
      3. 10 mM Tris-HCl pH 8.0 Buffe ihtiva eden bir çözeltiden bir gradyan çalıştırarak kolondan Elute hedef protein1 M NaCI ile takviye edilmiş aynı tampon ihtiva eden bir çözeltiye r. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) göre en yüksek saflıkta protein yıkama ve havuz örnekleri sırasında numune alın.
    6. 3.1.7 'de tarif edildiği gibi, DPBS tamponu içine, saflaştırılmış proteini Tampon değişimi.
    7. Saflaştırılmış protein (nihai konsantrasyon 2 mM) ile DTT eklenir ve 3.1.8 tarif edildiği gibi ~ 100 mg / ml, 30 kDa'lık bir ultra-süzme spin kolon kullanarak protein konsantre edilir. Kısım ve mağaza -80 ° C'de kullanıma kadar protein konsantre.
  3. SH3-GFP saflaştırılması
    1. Islak topak, 10 ml / g Tampon A kullanılarak yeniden süspanse hücre topakları.
    2. 3.1.2 de tarif edildiği gibi, sonikasyon ile pelet süspansiyon bozabilir.
    3. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de lizat santrifüj ve supernatant toplamak.
    4. Daha önceden dengelenmiş bir 5 ml'lik bir Ni-NTA sütunu üzerinden süpernatant (Çözünür lizat) geçmekA. Tampon
    5. Tampon A içinde 30 ml 'si ile yıkayınız sütun 45 mM imidazol ile takviye edilmiştir. Tampon A içinde 20 ml 150 mM imidazol ile desteklenmiş kullanılarak arıtılmış proteininin elüt edilmesi.
    6. Tampon 3.1.7 'de tarif edilene benzer bir yaklaşım kullanarak DPBS tamponu içine, saflaştırılmış protein değişimi ve protein konsantre ~ 150 mg / 3.1.8 de tarif edildiği gibi, 30 kDa'lık bir ultra-süzme spin kolon kullanılarak ml.
    7. Kısım ve mağaza -80 ° C'de kullanıma kadar protein saflaştırılmış.
  4. Cuta içeren saflaştırılmış numunelerin SDS-PAGE analizi
    1. NaCl ~ 1 mM'ye kadar konsantrasyonunu azaltmak için iki kere distile edilmiş su içinde her bir saflaştırılmış proteini seyreltin. Bu NaCl konsantrasyonda, Cuta trimer proteinlerin çoğu SDS-PAGE jelleri üzerinde monomerler olarak çalışır.
    2. 2x SDS numune tamponu (0.5 M Tris-HCI, pH 6.8, Gliserol,% 10 ağırlık / hacim SDS,% 0.1 v bromo-fenol kırmızı,% 2 β-merkaptoetanol / ağ% 20), 95 ° C'de inkübe örnekleri ile karıştırın 5 dakika boyunca.
    3. Sam'e yükleyinples bir% 12 SDS-PAGE jeli üzerine. ~ 50 dakika için 200 V sabit gerilimde elektroforez yapınız.
    4. Standart protokollere (Şekil 1 C), aşağıdaki Coomassie parlak mavisi R250 ile boyanmıştır jellerde protein dikkate alınmalıdır.

4. Hidrojel Oluşumu

NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu çalışmada yapılan örnek hidrojeller her bir hidrojel yapı bloğunun 1.6 mM içerir. Bu protein konsantrasyonu yumuşak ve dengeli bir hidrojel elde edilir. DİKKAT: sodyum azid (NaN3) bakteriyel kontaminasyonu önlemek için ağırlık / hacim olarak% 0.5 'lik bir nihai konsantrasyona kadar hidrojel eklenir. NaN 3 derece zehirli ve Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda belirtildiği gibi aşırı bir dikkatle ele alınmalıdır.

  1. 100 ul numune hidrojel içinde 1.6 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için gerekli olan konsantre edildi proteinlerin her biri için ses hesaplayın. Örneğin:
    N konsantrasyonu:100 mg / ml
    N, Molekül ağırlığı: 26.3 kDa (Tablo 1'e bakınız)
    İstenen hacmi: 100 ul istenen konsantrasyonu: 1.6 mM
    figure-protocol-1
  2. 100 ul hidrojel (1.6 mM) yapmak için, C mix (x ul hacim 4.1 'e göre hesaplanmıştır),% 5 NaN3 (10 ul) ile, 100 mM DTT (5 ul) ve N-(y ul hacim göre hesaplanır 4.1), 2 ml bir cam şişe içinde.
  3. 100 ul'lik bir son hacim elde etmek için şişeye (y) ul - - ​​x (85), ve manüel bir pipet kullanarak bir girdap hareketi ile tüm bileşenleri karıştırmak DPBS tamponu ekleyin. Not: Solüsyon karıştırma üzerine çok viskoz hale gelir.
  4. Hava kabarcıklarını çıkarmak için 8000 x g'de 2 dakika boyunca karışımın santrifüjleyin.
  5. Karışımı oda inkübeintein trans-yapıştırma reaksiyonun tamamlanması için bir gece sıcaklığı. Ters tüp çevirerek hidrojel oluşumunu onaylayın. Bir hidrojel oluşturulur ise, proteinler, akmayacaktır.
  6. 3.4 (Şekil 1C) de tarif edildiği gibi, daha önce adım 4.2 ve bir SDS-PAGE jeli üzerinde adım 4.5 sonra toplanan numuneleri (her biri 0.5 ul) kontrol ederek intein trans-birleştirme verimi tahmin.

5. Yerleştirme Protein (DP) ve Docking Station aracılığıyla GFP İmmobilizasyonu Peptit (DSP) Etkileşim

  1. 50 ul GFP-işlevselleştirilmiş hidrojel (1.2 mM) yapmak için bir 1.7 in 1:1 molar oranında (4.1 göre hesaplanan, x ul) C-SH3 LIG birleştirmek ve SH3-GFP (y ul, 4.1 'e göre hesaplanan) ml mikrosantrifüj tüpü ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
  2. X - - ​​<5% 3, NaN (5 ul), 100 mM DTT (2.5 ul), (42.5 eklemeaynı tüp em> y) ul DPBS. N ve C-SH3 lig 1:1 'lik bir mol oranının elde edilmesi için N-(y ul, 4.1' e göre hesaplanan) eklenir. Bir girdap hareketi tarafından bir pipet kullanarak örnek karıştırın.
  3. 2 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj ve karışım karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca karışım inkübe edin. İnkübasyon sırasında SH3-GFP formları kapsül bir hidrojel.

6. Organik çözücü içinde, enzimatik bir reaksiyon için bir immobilizasyon iskelesi olarak 1.6 mM hidrojelin kullanımı

  1. Bir model enzim olarak HRP kullanın. DPBS HRP (28 mg / ml ya da 0.63 mM) bir stok çözelti hazırlayın.
  2. HRP tutulmasıyla, 30 ul hidrojel (1.6 mM) yapmak için, bir iç C HRP (2 ul),% 5 NaN3 (3 ul) ve DTT (100 mM, 1.5 ul) ile (x ul, 4.1 'e göre hesaplanan) kombine 1.7 ml santrifüj tüpü.
  3. N (y Ekle </ Em> 4.1 göre hesaplanan ul) ve DPBS (23.5 - x - y) ul. Bir girdap hareketi ile bir pipet ucu ile karıştırın.
  4. 2 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj ve karışım gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    DİKKAT: Aşağıdaki aktivite deneyi için kullanılan reajanlar oldukça zehirlidir. Ilgili Malzeme Güvenlik Bilgi Formları ile özel güvenlik tavsiyelerini kullanın.
  5. Enzimatik reaksiyon için,, n-heptan 14 N, N-dimetil-p-fenilen diamin (5.8 mM), fenol (5.8 mM) ve tert-butil hidroperoksit (2.9 mM) içeren reaksiyon kokteyli 1 ml hidrojel daldırın. El ile hidrojel ve çözücünün temas yüzey alanını artırmak için bir pipet kullanarak jel bozabilir.
  6. Bir plaka okuyucusu (Şekil 5) 546 nm 'de farklı zamanlarda alınan örneklerin optik absorbans ölçülerek, HRP ürün, bir indofenol tipi boya algılar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Intein aracılığında protein hidrojel oluşturulması için bir şematik Şekil 1A 'de sunulmaktadır. Hidrojelin yapı blokları protein Cuta-NpuN (N) ve NpuC-S-Cuta (C) (Şekil 1A, Tablo 1) kopolimerleridir. NpuN / C Nostoc punctiforme (NPU) için intein doğal olarak bölünmüş DnaE en N-/C-fragments bulunmaktadır. Cuta Pyrococcus horikoshii 4,5 Bir kararlı trimerik proteindir. (Şekil 1 A ve 1 C) lige ürünü (Cuta-S-Cuta J) - indirgeyici mad...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, oldukça dengeli bir intein aracılığında protein hidrojel sentezini ortaya koymuştur. Bir bölünme kullanılması intein koşullu iki sıvı faz bileşenlerinin karıştırılması tepki olarak şekillendirilecek olan hidrojel sağlar. Özel olarak, bölünmüş intein kovalent da kendi kendine bir hidrojel halinde birleşmektedir bu birimler çapraz bağlanması ile çevrili bir polipeptit ünitesi hasıl, bir trans-ekleme tepkimesi aracılığı ile, iki sıvı faz yapı taşlarını bağlar. Hidrojel karıştırılması ile indüklenen f...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Hiçbir rakip mali çıkarları var.

Teşekkürler

Yazarlar, plazmid KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11 onun tür hediye için plazmid onun tür hediye pQE9 AC 10 ATRP'si 12, Dr Tom Muir (Princeton Üniversitesi), Dr David Tirrell (Caltech) kabul etmek istiyorum plazmid onun tür hediye pJD757 13 için plazmid pET30-Cuta-Tip1 10, ve Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) onun tür hediye Dr Takehisa Matsuda (Teknoloji, Hakusan, Ishikawa, Japonya'da Kanazawa Enstitüsü) . Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı KARİYER, ABD Hava kuvvetleri Yip ve Norman Hackman İleri Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar

Phusion High Fidelity DNA polimeraz

New England BioLabs

M0530S

Yetkili Escherichia coli BL21 (DE3)

New England BioLabs

C2527I

Luria Bertani

VWR

90003-350

Bacto Agar Media

VWR

Kanamisin sülfat

VWR

IPTG

VWR

EM-5820

Imidazole

VWR

EM-5720

Üre

VWR

EM-9510

Dithiothreitol (DTT)

Fisher

BP172-5

Proteaz İnhibitörü kokteyli

Roche Uygulamalı Bilim

11836153001

DPBS

VWR

82020-066

Brilliant Blue R

Acros Organics

A0297990

Sodyum Azide

Fisher

AC190380050

Dikkat, son derece toksik< / p>

yaban turpu peroksidaz< / p>

Sigma< p > P8125-5KU < / p >

< / p >

< p > N, N-dimetil p < / em > fenilen diamin < / p >Fisher< p >AC408460250< / p>

Dikkat, çok toksik< / p>

fenol< / p>

Fisher

AC149340500< / p>

Dikkat, çok toksik< / p >

tert-butil hidroperoksit < p >

Fisher

AC180340050< / p>

Dikkat, çok toksik< / p>

n-heptan < / p>

Acros Organics

120340010< / p>

[başlık]

Çalkalayıcı/İnkübatör

Fisher Scientific

Max Q 6000

Santrifüj

Sorvall

RC 6

Sonicator

QSonica

Misonix 200

Ultrafiltrasyon Tüpleri< / p>

Amicon Ultra

UFC903024< / p>

< / p>

  Ni Sefaroz Yüksek Performanslı HisTrap sütunu

GE Healthcare Life Sciences

17-5248-01

HiTrap SP Sepharose FF iyon değişim sütunu

GE Healthcare Life Sciences

17-5156-01

Plaka okuyucu

Moleküler Cihazlar

SpectraMax Gemini EM

Kaynaklar

  1. Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
  2. Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
  3. Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
  4. Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
  5. Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
  6. Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
  7. Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
  8. McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
  9. Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
  10. Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
  11. Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
  12. Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
  13. Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
  14. Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
  15. Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
  16. Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
  17. Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
  18. Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
  19. Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İntein Aracılı SentezSplit-intein Trans-splicelemeProtein Blok KopolimerlerAfinite KromatografisiHidrojel OluşumuEnzim İmmobilizasyonuOrganik Solvent StabilitesiKenetlenme İstasyonu PeptidiHorseradish Peroksidaz
Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.