Yöntem makalesi

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi

10.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51207

⸱

1 Eylül 2015

 ,  , 
1Laboratory of Human Retrovirology, Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Microbiology, Infectiology, and Immunology, Université de Montréal

Bu makalede

Özet

Hücre içermeyen HİV-1 parçacıklarına farklı olarak, enfekte olmuş CD4 + T hücrelerinin etkili bir plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ile algılanır. Bu yazıda tip I IFN serbest bırakılması ile değerlendirilen periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ya da izole edilmiş bir PDC pDC'lerde ile doğuştan gelen algılamayı değerlendirmek için, HIV-1 ile enfekte edilmiş T hücreleri ile birlikte-kültür, bir yöntem tarif eder.

Özet

HIV-1 doğuştan gelen algılama plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ile enfekte CD4 + T hücrelerinin doğrudan temas olmasını gerektirmektedir. Bu işlemi incelemek için, burada açıklanan protokoller T hücre (MT4) ya da heterolog olan primer CD4 + T hücrelerinde ya enfeksiyonları algılamak için taze yalıtılmış insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ya da plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) kullanın. Uygun algılama sağlamak amacıyla, PBMC, kan toplama ve kullanılan enfekte T hücrelerinin optimal yüzdesi hemen sonra izole edilir esastır. Bundan başka, çok-parametrik akış sitometrik boyama PBMC örnekleri, fizyolojik oranda farklı hücre soyları içeren teyit etmek için kullanılabilir. Kontrollerin bir dizi de canlılığı ve pDC'lerde işlevselliğini değerlendirebilmek için dahil edilebilir. Bunlar Toll benzeri reseptörler bilinen agonist (TLR) yolları, hücresel yanıtları değerlendirmek ve Spon eksikliğini teyit, özel yüzey belirteçlerinin varlığı,Spontan tip-I interferon (IFN) üretimi. Bu sistemde, yeni izole edilmiş PBMC'ler veya PDC 18-22 st için 96 yuvalı plakalar içinde, HIV-1 ile enfekte hücreler ile birlikte kültürlenmiştir. Bu ko-kültürlerinden alınan üst sıvılar, sonra HEK-Blue IFN-α / β hücrelerinde ISGF3 yolundaki aktivasyonu izleyerek biyoaktif tip I IFN'lerin düzeylerini belirlemek için kullanılır. Önceki ve ko-kültür koşulları sırasında hedef hücreler enfekte olmuş hücrelerin yüzdesi, spesifik yüzey markerlerinin düzeyi ve enfekte olmuş hücrelerin ayırıcı öldürülmesi de dahil olmak üzere bir dizi parametre belirlemek için flow sitometri yöntemi tabi tutulabilir. Bu protokoller başlangıçta tip-I IFN üretimini takip etmesi için geliştirilmiştir rağmen, potansiyel pDC'lerde salınan diğer bağışıklık refleksinin-modülatör moleküllerini incelemek ve HIV-1 doğuştan algılama düzenleyen moleküler mekanizmaları içine daha fazla fikir edinmek için kullanılabilir.

Giriş

Tip-I IFN-üreten PDC viral enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattını temsil ve gibi doğal ve kazanılmış bağışıklık 1 arasında hayati bir bağ olarak hizmet vermektedir. Hücre içermeyen, HIV-1, bahsedilen parçacıkların zayıf doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından tespit edilir ise, HIV-1 ile enfekte olan CD4 + T hücrelerinin etkili bir pDC'lerde 2 tarafından algılanır. Sensör mekanizması daha sonra pDC virüs yakalama ve içselleştirme izlemektedir pDC, enfekte T hücresi ve CD4 moleküllerin yüzeyinde viral zarf glikoproteininin (gp120) arasında, bir ilk temas gerektirmektedir. TLR7 tarafından aktarılan HIV-1 RNA müteakip tanıma MyD88 / IRF7 yolağının aktivasyonunu tetikleyen ve sonuçta IFN üretimi 3-I tip yol açar. Önemli olarak, TLR9 aracılık pDC'lerde mevcut ikinci algılama yol, pDC-özel yüzey işaretleyicisi olabilir BDCA2 4, viral glikoprotein gp120 etkileşimi ile engellenir.

PDC TLR7 ve TLR9 algılama yolları potansiyel olumsuz ILT7 5 olarak adlandırılan diğer bir pDC-spesifik yüzey önleyici reseptörü ile (aynı zamanda, tetherinin veya CD317 adlandırılır) BST2 geçmesi ile modüle edilebilir. BST2 pDC'lerde ve bazı kanser hücrelerinin yüzeyinde yüksek seviyelerde ifade ancak, B hücreleri, makrofajlar ve T hücreleri gibi diğer hücre tiplerinde nispeten daha düşük seviyelerde olduğu. Önemli olarak, BST2 dönüştürülmüş hücre hatları, bir dizi ve ayrıca insan ve kemirgen kökenli 6 primer hücre kültürlerinde tip I IFN ile uyarılan edilebilir. Yanı sıra, bağışıklık düzenleyici işlevi, BST2 son HIV-1 salınımını inhibe ettiği bulundu ve diğer enfekte hücre yüzeyi 7 üzerinde çapraz bağlama oluşmakta olan virüs partikülleri tarafından viral partikülleri kapladı. HIV-1 durumunda, virüs kodlu yardımcı protein U (Vpu) bir BST2 antagonisti olarak hareket gösterilmiştir. Bu Vpu, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrenin hücre yüzeyinden ipten site BST2 aşağı doğru düzenleyen inanılmaktadıraktivite ile, bu kavramı 8,9 meydan olmasına rağmen, bir sonuç olarak, viral tahliyesini artırır ve 7 yayıldı. Vpu, çok sayıda yokluğunda tam olarak oluşmuş ve olgun projeni, HIV-1 partikülleri hücre yüzeyinde tutulur. Bu gergin parçacıklar bağışıklık algılama etkili hedefler temsil edebilecek olsun hala açık bir soru kalır. Buna ek olarak, bu Vpu Yüzeye BST2 seviyeleri modüle ederek pDC'lerde gelen tip I IFN üretimi disregüle olabilir olup olmadığı açık değildir.

HIV-1 algılama değerlendirmek için tasarlanmış İlk çalışmalar, genellikle tip I IFN 3,10-12 zayıf indükleyicileri olarak kabul edilir hücre içermeyen, HIV-1 parçacıkları kullanılarak yapıldı. Son çalışmalar PBMC'ler ve PDC verimli HIV ile enfekte CD4 + T limfositleri 2,13,14 anlamda olduğunu göstermektedir göz önüne alındığında, burada in vitro olarak HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerin tanınması üzerine pDC'lerde ile tetiklenen doğal tepkilerini ölçmek için basit bir yöntem tarif eder.

Protokol

Genel Notlar

Hatta kontrol bakteriyel enfeksiyonlar PBMC tarafından algılanabilen, çünkü herhangi bir antibiyotik olmaksızın kültür içinde hücreleri tutmak önemlidir. Bakteriyel bileşenlerin Böyle algılama belirli bir HIV-1 algılama ile tetiklenen ayırt edilemez bir plan interferon üretimini uyaracaktır. Ayrıca, tüm hücre rutin mikoplazma kontaminasyonu olmadığını anlamak için test edilmesi gerekir.

Mümkün daima endotoksin içermeyen çözümleri kullanın.

Farklı hücrelerin akış sitometrik karakterizasyonunu ko-kültürlerde kullanılmak üzere (PBMC, PDC, MT4 ve CD4 + T hücreleri) isteğe bağlı bir adımdır, ancak, belirli bir deney yorumlanabilir için gerekli olan değerli bilgiler sağlar çünkü çok tavsiye edilir.

Bulaşmış hedef hücrelere hazırlanması 1.

  1. RPMI 1640 medi insan CD4 + T hücre soyu MT4 bakımıBir RPMI-1640 ortamı olarak artık ifade% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir.
  2. Primer CD4 + T hücrelerinin izolasyonu.
    1. Yoğunluk gradyan santrifüjü ile, insan periferal kanından mononükleer hücreler izole edin.
    2. Üreticinin tavsiyelerine izlenerek, CD4 + T hücreleri, negatif seçim kiti kullanılarak, CD4 + T lenfositleri izole edin.
    3. RPMI-1640 ortamı içinde 48 saat için PHA-L (5 ug / ml) ile CD4 + T lenfositleri etkinleştirme ve muhafaza hücreler, rekombinant IL-2 (100 U / ml) ile takviye edilmiştir. Birincil T hücreleri 5 gün sonrası izolasyonu bulaştırmak.
  3. Hedef hücreler (MT4 T hücre soyu ya da heterolog primer CD4 + T hücrelerinde) enfeksiyonu.
    1. HIV-1 virüsü ile T hücrelerinin, kültür-co enfekte iki gün önce. Burada tarif edilen spesifik örnekte pNL4.3-GFP_ires_Nef vahşi tip (WT) ya da pNL4.3-GFP_ires_Nef ö Vpu (dVpu) virüsleri kullanılmıştır. Bu viral suşlar gre temsilfloresan protein (GFP) grafik işlemcisinden ifade etme kabiliyetleri bakımından farklılık izogenik enfeksiyöz moleküler klonların -işaretli en.
    2. Enfeksiyon (Mois) farklı çokluklarını kullanın ve ko-kültürler için enfeksiyon benzer seviyelerde kültürleri seçin. Eş-kültür, günün sitometrisi enfeksiyonun göstergesi olarak akışı ile GFP + hücrelerinin yüzdesini belirlemek. Ko-kültürler için% 20-50 enfekte olmuş hücrelerin bir dizi tek kültürleri kullanın.

İsteğe bağlı adımlar: Böyle BST2 ve CD4 gibi ilgi molekülleri / ligandların yüzey ifadesini değerlendirmek için bu noktada akım sitometri boyama yapın. Hücre yüzeyi boyama, anti-CD4_PerCP / Cy5.5 1 ul ve anti-BST2_A660 1 ul, yıkama çözeltisi 100 ul, 0.5 x 10 6 T hücreleri, yeniden süspanse edin. Yıkama çözeltisi akış sitometrisi ile yıkanmasından önce, 4 ° C 'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Çalışmalar Vpu aracılı BST2 düşmanlık rolünü değerlendiren hedefleyen ise, HIV-1 parçacık gerçekleştirmekŞu anda salınım testi daha önce 15 nitelendirdi.

Hücreleri (Tüm PBMC'ler veya Zenginleştirilmiş PDC) Algılama 2. İzolasyon ve Zenginleştirme

Not: PBMC'Ier algılama kullanıldığında, kan alımından sonra yarım saat içinde izolasyon başlatmak ve zamanında bunu yapmak. Ko-kültürler veya pDC zenginleştirme için hemen PBMC'leri kullanın.

  1. Yoğunluk gradyan santrifüjü ile, insan periferal kanından mononükleer hücreler izole edin.
    İsteğe bağlı adım: o taze izole PBMCler fizyolojik oranlarda farklı hücre soyları ihtiva onaylamak için çoklu-parametrik akış sitometri boyama yapın. Hücre yüzeyi boyama için Fc bloke edici çözelti 100 ul 10 6 PBMC'ler tekrar süspansiyon ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. Bloke edildikten sonra, anti-CD3_Pacific Mavisi (miyeloid hücreleri), anti-CD14-PE_Texas Red 1 ul anti-BDCA2_APC 4 ul ve (pDC'lerde için), anti-ILT7_PE 1 ul (T hücreleri için) 1 ul ekle. Tasarlamakyıkama çözeltisi akış sitometrisi ile yıkama öncesinde 4 ° C'de 45 dakika boyunca borular.
  2. Üreticinin önerilerine ardından pDC negatif seçim kiti kullanarak PDC zenginleştirin. Bu, hızlı çalışması, soğuk hücreler tutmak ve önceden soğutulmuş çözümleri kullanmalarını tavsiye edilir. Bu maksimal pDC aktivitesi sağlamak yanı sıra, hücre yüzeyi ve spesifik olmayan hücre etiketleme üzerindeki antikorların kuafajı önleyecektir.
    1. Saflığı, zenginleştirme yüzdesini ve (örneğin ILT7 ve BDCA2 gibi) pDC- özel yüzey belirteçlerinin nispi miktarlarını onaylamak için taze izole pDC'lerde multi-parametrik akım sitometri analizi yapın. Hücre yüzeyi boyama için Fc bloke edici çözelti 100 ul 10 4 PDC tekrar süspansiyon ve 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. Bloke edildikten sonra, anti-CD3_Pacific Blue 1 ul anti-CD14_PE_Texas Red 1 ul anti-BDCA2_APC 4 ul ve anti-ILT7_PE 1 ul ekle. (PBS, 5, yıkama çözeltisi akış sitometrisi ile yıkanmasından önce, 4 ° C 'de 45 dakika boyunca inkübe edinmM EDTA,% 5 FBS). % 40 pDC saflıkta bir minimum (başlangıç ​​malzemesi% 0.4 PDC sahip ise, bu bir 100 katlık bir zenginleşmeye eşdeğer olacaktır) tavsiye edilir.

Enfekte CD4 + T hücrelerinin ve Algılama Hücreleri (Tüm PBMC'leri veya Zenginleştirilmiş pDC'lerde) 3. Co-kültür

  1. Oyuk başına (10 6 hücre / ml'de seyreltilmiş) enfekte olmuş T hücrelerinin 30 ul PBMC'lerin 220 ul veya pDC'lerde 220 ​​ul (850,000 hücre / ml yoğunlukta seyreltilir) (100,000 500,000 hücre arasında değişen bir konsantrasyonda / ml) karıştırın Bir U tabanlı 96 oyuklu plaka.
    1. Tek başına kontroller, levha PBMC'ler veya pDC'lerde ve T hücreleri gibi. RPMI 1640 tam orta iyi 250 ul ses seviyesini ayarlayın.
    2. TLR7 ve TLR9 yolların bilinen agonist hücresel yanıtları değerlendirin. Bu amaçla, PBMC'lerin plakası 220 ul, U tabanlı, 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına ya da (100,000 ila 500,000 hücre / ml arasında değişen bir konsantrasyonda) pDC'lerde 200 ul (850,000 hücre / ml yoğunlukta seyreltilir) ve (TLR7 agonisti ekleme Imiquimod, nihai konsantrasyon: 2.5 ug / ml) ya da TLR9 agonisti (ODN 2216 CpG-A, nihai konsantrasyon: 5 uM). 37 ° C de inkübe hücreleri ve% 5 CO Şubat 18-22 saat ve aşağıda tarif edilen ko-kültürler benzer bir şekilde işler.
  2. 37 ° C 'de ko-kültürler inkübe ve% 5 CO Şubat 18-22 saat boyunca ve daha sonra V-tabanlı 96 çukurlu levhaya transfer edin. 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
    1. Düz dipli, 96 gözlü plakaya süpernatantlar aktarın. Süpernatanlar -80 ° C'de saklanır veya hemen tip I IFN tespiti için de kullanılabilir.
    2. % 2 lik paraformaldehid içinde eş-kültürlenen hücrelerin yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi kullanılarak analiz eder. Boyut ve granülasyonda farkı nedeniyle, MT4 hücreleri ileri dağılım (FS) profilleri ile kendi yan dağılım (SS) göre PBMC'ler veya pDC'lerde kolayca ayırt edilir. Primer T hücreleri, hedef enfekte hücreler olarak kullanılır, bu, örneğin CSFE gibi herhangi bir hücre izleyici boya ile önce birlikte kültür boyandı.
  3. HEK-Blue IFN-α / β raportör hücreleri kullanılarak biyo-aktif tip I IFN ölçümü.
    Not: Bu hücreler I IFN sinyal yolunun bir tam aktif türü elde etmek için, insan STAT2 ve IRF9 genleri ile HEK293 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu ile oluşturulmuştur. Bunlar aynı zamanda, uyarılabilir promoter ISG54 beta / IFN-a kontrolü altında salgılanan alkalin fosfataz (SEAP) raportör geni içerir. Tip I IFN ile bu hücrelerin uyarılması, JAK / STAT / ISGF3 yolunu aktive ve SEAP üretilmesine neden olmaktadır.
    1. % 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM içinde HEK-Blue IFN-α / β hücreleri koruyun. 180 ul nihai hacim içinde, düz dipli 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 50,000 hücre olan bir yoğunlukta bunları Plate.
    2. Iki kopya halinde her oyuğa ko-kültür süpernatant 20 ul ekle. Her bir plaka, aynı zamanda, iç standart bir kontrol seti (insan IFNa, 2500 U / ml ila 100 U / nihai konsantrasyonu) gerektirir. 18 için 37 ° C ve% 5 CO2 de inkübe edin-22 Saat.
    3. Enzimin varlığında mavi / mora dönerken pembeden değişir Quanti-Blue çözeltisi kullanılarak alkalin fosfataz aktivitesi, seviyelerini belirlemek. Üreticinin önerilerine aşağıdaki Quanti-Mavi hazırlayın. Düz dipli, 96 gözlü plakanın her bir oyuğuna, bu çözeltinin 180 ul ekle. Her birine de indüklenmiş HEK-Blue IFN-α / β hücrelerinin süpernatanlarında 20 ul ekle ve renk standardı IFN kontrol oyuklarında gelişene kadar bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edilir.
    4. 620-655 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak SEAP seviyelerini değerlendirmek ve IFN standart eğrinin doğrusal kısmından ekstrapolasyonla tip I IFN konsantrasyonunu belirler.

Sonuçlar

Şekil 1 'de tarif edilen ko-kültür sistemi, HIV-1 doğuştan gelen algılama kontrol edilen bir çalışma sağlar. Primer hücre değişken doğası nedeniyle, myeloid ve T hücreleri (sırasıyla CD14 + ve CD3 +) normal oranları örneğin Şekil 2A'da gösterilen örnekte olduğu gibi, görülmektedir ki önemlidir. Bundan başka, (non-aktive edilmiş T hücreleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek FS ve daha yüksek seviyelerinin, CD3), aktive edilmiş T hücrelerinin sadece düşük sayıda taze izole edilmiş PBMC'ler kültürlerinde tercih edilir. Çeşitli hücre tipleri arasındaki anormal oranları PBMC devam etmekte olan bir enfeksiyonun bir sonucu olarak, aktif bir fenotipe genellikle in vitro, muhtemelen uygun bir doğuştan gelen bağışıklık karşılığının ortaya çıkartılma mümkün değildir. En önemlisi, pDC'lerde nispi yüzdesi, Şekil 2B'de gösterildiği gibi değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu oran 0.2 ila% 1.2 arasında değişir, ancak, anormal algılama fenotipi extre hem görülmektedirBu aralığın mes. Şekil 2B (92 ve% 72%) olarak iki örneklerde görüldüğü gibi negatif seçimi kullanarak pDC'lerde zenginleştirilmesi, genellikle% 50-95 pDC saflıkta elde edilir. Genel deney için bir prototip örneği, Şekiller 3 ve 4 'de gösterilmiştir. Bu örnekte, MT4 hücreleri ko-kültür (Şekil 3A) zamanında 30% enfeksiyon elde etmek için pNL4.3-GFP_ires_Nef WT veya delta Vpu ile enfekte edilmiştir. Daha önce açıklandığı gibi, yalnızca WT virüsü enfeksiyonları yüzey BST2 önemli bir aşağı doğru düzenlenmesi (Şekil 3B) ile sonuçlanmıştır. Nedeniyle boyut ve ayrıntı onların farklılıklarına, MT4 hücreleri akış sitometri (Şekil 4A) tarafından PBMC'lerden kolaylıkla ayırt edilebilir. Ko-kültür inkübasyondan sonra, tip-I IFN (Şekil 4B), HIV-1 ile enfekte edilmiş hücreleri, serbest önemli miktarda temas bilinen TLR7 veya TLR9 agonist ve PBMC ile temas halinde, sadece PBMC'ler. Resim IFN PBMC ko-cu, yalnız olarak ölçülerek saptandısahte-enfeksiyonlu MT4 hücreleri ile ltured, ya da tek başına enfeksiyonuna maruz MT4 hücreleri (Şekil 4B). Burada verilen örnekte, PBMC'ler tarafından HIV-1 ile enfekte MT4 hücrelerinin doğal algılama anlamlı Vpu varlığında indirgenebilir bulunmuştur.

figure-results-1
Şekil 1:. Deneysel tasarım şematik bakış SUP: süpernatant büyük resim görüntülemek için buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Taze izole edilmiş PBMC'ler ve ENR fenotipik nitelendirilmesiiched PDC (A). miyeloid hücreler ve sağlıklı bir vericiden izole PBMC'ler gözlenen T hücrelerinin normal dağılım (miyeloid hücrelerin yüzdesi% 55-65 ila% 10-20 T-hücreleri arasında olmalıdır). PBMC'leri örnek yüzey CD14 (miyeloid soy işaretleyici) ve CD3 (T hücre işaretleyici) tanımak fluorofor-konjuge antikorlar kullanılarak boyandı. (B) pDC'lerde fenotipik karakterizasyonu. Zenginleştirme pDC'lerde önce PBMC'ler içindeki hücrelerin toplam sayısı (gösterilen örnekte% 0.99) arasında 0,2-1,2% arasında temsil etmektedir. Bu hücreler, hücre yüzeyinde mevcut gibi BDCA2 ve ILT7 gibi özel belirteçler, ekspresyonu göre tespit edilebilir. Negatif seçim önemli ölçüde pDC'lerde sayısını ettirecek ve CD14 + miyeloid hücrelerin (zenginleştirme gösterilen iki örnek 92 ve% 72,% ulaşan) gibi potansiyel olarak zararlı kirletmesini ortadan kaldırmak için kullanılabilir. CliDaha büyük resmi görmek için buraya ck.

figure-results-3
Şekil 3:. PNL4.3-GFP_ires_Nef WT veya dVpu ile enfekte MT4 kültürleri içinde enfekte hücrelerin HIV-1 ile enfekte edilmiş hedef MT4 hücrelerinin Karakterizasyonu (A) yüzde GFP pozitif hücrelerin yüzdesi ile belirlenmiştir. Enfekte olmuş hücreler (B) BST2 hücre yüzey ifadesi yüzeyi boyama sonra değerlendirilmiştir. Gri dolu histogramlar Bağışıklık öncesi tavşan serumu (lekesiz kontrol) ile boyandı sözde-enfekte edilmiş hücreler temsil eder; Kalan histogramlar, anti-BST2 poliklonal tavşan serumu ile boyanan hücrelerin temsil etmektedir. Katı hatları ile Histogramlar kontrol GFP negatif (neg) hücreleri temsil eder; noktalı çizgiler ile histogram enfekte GFP pozitif (pos) hücrelere karşılık ise. Grip ortalamaorescence yoğunluğu (MFI) değerleri, her bir örnek için belirtilmiştir. Flow sitometri Şekil 2'de açıklandığı gibi yapılır ve analiz edildi. Daha büyük resmi görmek için tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4:. Taze izole edilmiş PBMC'ler ve enfeksiyonuna maruz MT4 T hücrelerinin ko-kültür PBMC'ler ve MT4 T hücreleri arasında, tek başına MT4 T hücreleri için de gözlenmiştir FS / SS profilleri tek başına PBMC'ler, ya da ko-kültürler akış sitometrisi (A) karşılaştırması. Boyut ve taneciklilik bakımından farklılıklar nedeniyle, MT4 T ​​hücreleri akış sitometrisi ile ko-kültürlerde PBMC'lerden kolaylıkla ayırt edilebilir. (B) TLR PBMC'lerin uyarılmasından sonra serbest tip I IFN miktarının Örnek Örnek7 ya da TLR9 agonisti (önce) veya yalancı veya pNL4.3-GFP_ires_Nef WT veya dVpu ile enfekte belirtilen MT4 hücreleri ile birlikte-kültürler sonra. Ham veri OD olarak 650 değerleri gösterilir ve bunlara karşılık gelen converseion. / Ml U ifade IFN konsantrasyonunu-ı yazın büyük resim görüntülemek için buraya tıklayın.

Tartışma

Burada anlatılan protokollerin son raporunda 18 de tarif edildiği gibi, grafik işlemcisinden ifade etme kabiliyetleri bakımından farklılık GFP etiketli HIV-1 virüs ile enfekte olmuş T hücrelerinin algılama ölçer. Bununla birlikte, bu yöntemler, kolayca potansiyel doğuştan gelen algılamayı ayarlayabileceğini diğer viral genleri eksik olan etiketlenmemiş virüsleri gibi virüslerden algılanmasını incelemek için modifiye edilebilir. GFP ifade yoktur kullanılan virüsler, enfekte hedef hücre yüzdesi p24 (kapsid) halinde, hücre içi boyama-kültür co ve sitometrisi veya p24 ELISA ile akış önce başka bir şekilde tespit edilmelidir. Bundan başka, bu protokoller mevcut hücre hatları ve primer çeşitli hücreler de dahil olmak üzere çeşitli hedef T hücreleri, birlikte kullanılabilir.

HIV-1 algılama çalışma için kullanılan ilk yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu metin içinde tarif edilen yöntemler bir dizi avantaj vardır. Birinci ve en önemlisi, bu gruplar bir dizi hücre içermeyen, HIV-1 p tarafından kurulmuşturMakaleleri tip-I IFN 2,13,14 kötü indükleyicileridir. Ayrıca, erken çalışmalarda üretilen tip-I IFN miktarını ölçmek için eski IFNa ELISA tabanlı yöntemler dayanıyordu. Bu algılama tekniğinin bir sınırlama IFNa'nın ve IFNβ diğer tip bakan iken eski IFNa ELISA kitleri çoğu sadece, IFNa'nın bir tür ölçmek olmasıdır. Tarif edilen raportör hücre çizgilerinin kullanımı aynı anda ölçülebilir insan tip I IFN'lerin tüm biyoaktif formları konsantrasyonu olarak, bu sınırlama üstesinden gelmektedir. Tekniği IFN ELISA kitinin yeni nesil daha ve tip-I IFN büyük miktarlarda kolayca tespit edilebilir birçok bağışçılar için daha ucuz, son derece duyarlıdır. Bununla birlikte, bu protokol kolayca ELISA gibi diğer tip I IFN Okuması yöntemlerle kullanım için adapte edilebilir.

Kritik adımlar: Tüm hücresel bileşenleri (hedefler ve etkileyiciler ikisi) kalitesi sıkı kontrol edilmesi önemlidir. Potansiyel kirlenme bile asymptomatic, izlenmesi ve kontrol edilmesi gerekmektedir. Daha önce de belirtildiği gibi, asemptomatik bakteriyel kontaminasyonu antibiyotik kontrol ve mikoplazma gibi potansiyel olarak diğer hücre içi patojenler, HIV-1 enfeksiyonu, tip I IFN yani üretim sonrası görülen benzeyen bağışıklık karşılıklarını üretir. Ayrıca, tüm reaktifler LPS veya diğer olası endotoksinlerin serbest olması gerekir. İnsan örnekler sıklıkla normal algılama etkileyebilir yatan devam eden enfeksiyonlar ile astarlanabilir yana Benzer şekilde, PBMC'ler ve pDC'lerde izlenmesi önemlidir. Her zaman, önerilen negatif kontroller, sözde-enfekte edilmiş hücreler ile bu hedef hücrelerin yokluğu gibi ortak kültürler de dahil olmak üzere önerilir. Enfekte olmuş hücrelerin canlılığı, aynı zamanda, tip-I IFN apoptotik hücrelerin 2,14 sahip ortak-kültür, aşağıdaki üretilmediği yana doğru pDC algılamak için önemlidir.

Tekniğin önemli bir sınırlama, taze izole edilmiş primer hücrelerde ihtiyacıdır. Bu prosedür değildiya da önceden doldurulmuş ya da kültür içinde tutuldu PBMC'ler veya PDC kullanılarak test edilmiştir. PBMC izole emek yoğun bir iştir ve bu hücreler çok sınırlı bir ömrü vardır. Insan kanı ile çalışırken Ayrıca, kan yoluyla bulaşan patojene karşı korumak için, standart protokoller kullanılmalıdır. Taze izole insan hücreleri içeren çalışmaları ile ilgili değişkenlik çeşitli kaynaklar genellikle vardır. Aralarında donör-to-donörden karşılaşılan bu hücreleri izole etmek için uygulanan farklı yöntemler ve kalıtsal değişkenlik vardır. O vericinin arasında değişkenlik kaçınmak mümkün olsa da, bu tür TLR7 ve TLR9 yolların bilinen agonistleri yanıt ölçüm olarak öne pozitif kontroller, kullanımı, bu deneyler için önemli bir iç kontrol sağlayacaktır. Bir yanıt TLR7 yolu HIV-1 3 karşı uygun bir cevap için gerekli olan süre TLR9 yolunun agonistleri için sağlam bir yanıt sağlıklı pDC yanıt ile ilişkili gözlemlenmiştir.

2 dayanarak ss = "jove_content">. Deneysel tasarım gerektiriyorsa hücreler seçim sürecinin ardından antikorun serbest kalması Ancak, negatif seleksiyon (belirli pDC yüzey belirteçlerinin tükenmesi gereken bağlamda örneğin), pozitif seçimi üzerinde tercih edilir. İzole PDC kültürde hızlı bir şekilde apoptoza girerler. Bu hücreleri gerektiren deneyler zaman uzun süre boyunca kültüre olması için, kültür ortamı, IL-3 ile takviye edilebilir. Bu sitokin pDC proliferasyon ve apoptozu 16 inhibe eder. Bu pDC olgunlaşma veya farklılaşmasına yol açabilir Bununla birlikte, IL-3, kullanım sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekmektedir.

Burada anlatılan yöntem doğuştan algılama sırasında yer alan ilk adımları yeniden amacıyla taze izole edilmiş PBMC'ler veya pDC'lerde hedef HIV-1 ile enfekte hücreleri birleştirir. Bu yöntem, kuşkusuz explor faydalı olacaktırHIV enfeksiyonu ile ilgili e erken doğuştan gelen bağışıklık olaylar. Ilgili protokolleri tip I IFN ölçmeye yönelik olmasına rağmen, bunlar, enfeksiyonlu hücrelerde tanınması üzerine pDC'lerde salınan diğer biyoaktif molekülleri ölçmek için modifiye edilebilir. Bunlar: tip-III IFN (IFN-λ) ve kemokinler CXCL10, CCL4 ve CCL5 17 (örneğin, TNF-a ve IL-6 gibi) pro-enflamatuar sitokinler.

Teşekkürler

Biz flow sitometri ve hücre sıralama deneyler sırasında uzman teknik yardım için E. Massicotte.H ve J. Tanrıya teşekkür ediyorum. Ayrıca, biz kan örnekleri sağlamak için IRCM klinik personeli ve tüm bağışçılara teşekkür etmek istiyorum. Periferik kan örnekleri Institut de Recherches cliniques de Montreal (IRCM) araştırma etik inceleme kurulu tarafından onaylanmış araştırma protokolleri altında Helsinki Bildirgesi uyarınca yazılı bilgilendirilmiş onam alındı ​​sağlıklı yetişkin donörlerden elde edildi. Aşağıdaki reaktifler NIH AIDS Reaktif Programı, AIDS, NIAID, NIH Bölümü ile elde edilmiştir: Dr. Douglas Richman gelen MT4 hücreleri; ve İnsan rlL-2 Dr. Maurice Gately, Hoffmann den - La Roche A.Ş.

Cohen İnsan Retrovirology Kanada Araştırma Başkanı sahibidir. Bu çalışma Cohen'e CIHR (CIHR 111.226) dan ve Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) Dr. Bego ve Cohen'e AIDS şebekesinden hibe ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MT4 hücreleriNIH AIDS Reaktif Programı120Bu reaktif, Dr. Douglas Richman'dan NIH AIDS Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH: MT-4 aracılığıyla elde edildi.
HEK-Blu IFN-&alfa;/β raportör hücreler InvivogenHKB-IFNAB 
RPMIWisent350-000-CL 
DMEMWisent319-005-CL 
FBSWisent080-150 
Ficoll-Pâ que ArtıMyltenyi17-1440-03 
CD4 + T hücre izolasyon kiti IIMyltenyi130-091-155 
Elmas Plazmositoid Dendritik Hücre İzolasyon Kiti II Myltenyi130-097-240 
PHA-LSigma-AldrichO2769 
İnsan rIL-2NIH AIDS Reaktif Programı136Bu reaktif, NIH AIDS Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH aracılığıyla elde edilmiştir: Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.'den insan rIL-2.
ImiquimodInvivogenTLRL-IMQS 
ODN 2216 CpG-AHijyenik BiotecHC4037 
İnsan IFN&alfa;PBL İnterferon kaynağı11100-1 
QUANTI-Mavi SedirREP-QB2 
Akış sitometrisi (Antikorlar/reaktifler) 
Fc bloke edici çözelti (aşağıdaki bileşim):Not: yıkama çözeltisi yapın (PBS, 5mM EDTA,% 5 FBS)
% 10 Keçi serumuSigma-AldrichG 9023& nbsp;
% 10 Tavşan serumuSigma-AldrichR 9133&
% 10 Fare serumuSigma-AldrichM 5909 
2.5 mg / ml insan IgGSigma-AldrichI 4506 
anti-CD3_Pacific BlueBiolegend300417 
anti-CD14_PE-TxRedLife TechnologieMHCD1417 
anti-BDCA2_APCMyltenyi130-090-905 
anti-ILT7_PEBiolegend326408 
anti-CD4_PerCP/Cy5.5Biolegend317427 
anti-BST2_Alexa 660eBioscience50-3179 
Paraformaldehit Sigma-AldrichP 6148 
Hücre süzgeciBD Falcon352340 
Camgöbeği ADP cihazı Beckman CoulterCY20030 

Kaynaklar

  1. Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells in immunity. Nature immunology. 5, 1219-1226 (2004).
  2. Lepelley, A., et al. Innate sensing of HIV-infected cells. PLoS pathogens. 7, e1001284(2011).
  3. Beignon, A. S., et al. Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions. The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).
  4. Martinelli, E., et al. HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).
  5. Cao, W., et al. Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction. The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).
  6. Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling. Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).
  7. Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
  8. Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).
  9. McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions. PLoS pathogens. 9, e1003299(2013).
  10. Manel, N., et al. A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells. Nature. 467, 214-217 (2010).
  11. Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1. Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).
  12. Fonteneau, J. F., et al. Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells. Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).
  13. Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids. Virology. 221, 113-119 (1996).
  14. Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration. Virology. 343, 256-266 (2005).
  15. Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin. Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).
  16. Grouard, G., et al. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).
  17. Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance. Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).
  18. Bego MG,, Côté, É, Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. Cohen ÉA. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11 (7), e1005024(2015).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

HIV-1 Doğal AlgılamaTip I İnterferonAkış SitometrisiPBMC İzolasyonuTLR Agonisti StimülasyonuSüpernatan AnaliziHEK-Blue IFN Reporter
HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.