Elektronik von Frey aparatı kullanarak farelerin arka pençesindeki dokunsal hassasiyetteki değişikliklerin ölçülmesi

Özet

Elektronik von Frey ölçümleri, enflamatuar bir olaydan önce ve sonra sürekli olarak uygulanan basınç uyaranlarına kemirgen mekanik çekilme eşiklerindeki değişikliklerin hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesine izin verdiği için klasik von Frey filamentlerine etkili ve geliştirilmiş bir alternatiftir.

Özet

Mekanik basınçtan arka pençe çekilme eşiklerinde iltihaplanmanın neden olduğu değişikliklerin ölçülmesi, kemirgenlerde ağrı algısındaki değişiklikleri değerlendirmek için yararlı bir tekniktir. Geri çekilme eşikleri önce başlangıçta ve daha sonra cildin çok spesifik bölgelerine doğru bir kuvvet uygulayarak ilaç, zehir, yaralanma, alerjen veya başka bir şekilde uyarılmış iltihabı takiben ölçülebilir. Elektronik bir von Frey cihazı, klasik von Frey ölçümlerinin aksine, mevcut filament boyutlarıyla sınırlı olmayan fare arka pençe çekme eşiklerinin hassas bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Ölçümlerin kolaylığı ve hızlılığı, kısa bir süre içinde birden fazla ölçüm yapılabildiğinden, hızlı başlangıçlı inflamatuar ve nöropatik ağrının çeşitli modellerinde dokunsal duyarlılık sonuçlarının değerlendirilmesine izin verir. Bireysel kemirgen denekler için deneysel ölçümler, deney grupları içinde ve arasında temel yanıtları standartlaştırmak için kolayca oluşturulan bireysel başlangıç tepkilerine ve dışlama kriterlerine karşı dahili olarak kontrol edilebilir. Bu nedenle, bir elektronik von Frey aparatı kullanılarak yapılan ölçümler, diğer insan olmayan memeli modellerine de uygulanabilen, kemirgen mekanik allodini için iyi bilinen klasik von Frey filament bazlı tahlillerin yararlı bir modifikasyonunu temsil eder.

Giriş

Kronik bulaşıcı olmayan hastalıklar, insan mortalite ve morbidite yüklerinin orantısız bir payından sorumludur¹. Kronik ağrı, küresel hastalık yükünün önemli bir bileşeni olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir². Bu, ağrının önlenmesi, yönetimi ve tedavisindeki yeniliklere büyük bir ivme kazandırmıştır. Aynı zamanda, ağrının altında yatan biyolojinin karmaşık olduğuna dair bol miktarda kanıt vardır³. Koruyucu, uyumsuz ve kronik ağrının altında yatan mekanizmalar, bağışıklık ve sinir sistemleri arasındaki karmaşık etkileşime işaret eder^3,4. Bu mekanizmaların aydınlatılması, moleküler diseksiyondan davranışsal analize kadar titiz nicel, tekrarlanabilir deneysel yaklaşımlar gerektirir.

Kemirgen modelleri, inflamatuar ve nöropatik ağrının moleküler oyuncularının karakterizasyonunda paha biçilmez olmuştur⁵. Zararlı uyaranlara daha önce belirtilen tepkilerin zaman ve yoğunluğundaki azalma, bu hayvanlarda ağrı durumlarını ölçmek için kullanılır, çünkü kemirgen denekler başka türlü bir ağrı hissi bildiremezler⁶. Sıcaklık ve basınca karşı değişen tepkiler, enfeksiyon 7,8, kimyasal maruziyet^{6, 9,10,} cerrahi insizyon¹¹ ve sinir ligasyonunun neden olduğu nöropatik ağrının¹² neden olabileceği kemirgen inflamatuar nosisepsiyon modellerinde doku duyarlılığının ölçümleri olarak yaygın olarak kullanılır.

Mekanik duyarlılık veya basınç uyaranlarına yanıt, genellikle klasik von Frey filamentleri (CvF) kullanılarak ölçülür - bir dizi (örn. 0.4-15 g¹³) ağırlıklı uç, deneysel deneklere karşı kontrollerde ağrı davranışları indüklenene kadar seri artışlarla test dokusuna manuel olarak uygulanır. Mekanik hassasiyeti değerlendirmek için bu uçları veya kılları kullanmanın çeşitli yöntemleri vardır^6,13; En sık kullanılan yöntem aşağıdaki gibidir. Belirli bir basınca sahip bir uç (seri içinde; Örneğin, 2 g¹³) bir başlangıç noktası olarak seçilir ve bir sıçan veya farenin %50 geri çekilme eşiği (ucun dokuya uygulanma zamanlarının %50'sinde bir yanıt üretmek için gereken uyaran yoğunluğu), daha önce belirtilen yanıt davranışlarının¹³ görüntülenmesine dayalı olarak uç ağırlığında yukarı ve aşağı hareket ettirilerek belirlenir. Tedavi grupları için mutlak% 50 geri çekilme eşikleri daha sonra başlangıç ve tedavi sonrası zaman noktaları arasında karşılaştırılır. Bu manuel teknik oldukça zaman alıcıdır. Bir von Frey odasında hapsedilen her bir denek tarafından harcanan zamanın artmasına ek olarak, bu aynı zamanda çeşitli ağırlıklardaki test uçlarının iltihaplı dokuya uygulanma sayısını da arttırır ve bu da çalışmadaki kemirgenlere daha fazla rahatsızlık verir. Ayrıca, kemirgen grupları arasında %50 geri çekilme eşikleri hesaplanır ve karşılaştırılır; Deneysel deneklerin bireysel tepkileri, bildiğimiz kadarıyla, bir istisna⁶ dışında, tipik olarak bireysel tedavi edilmemiş temel yanıtlarına normalleştirilmemiştir. Sonuç olarak, kemirgen denekler genellikle önceden belirlenmiş bir aralıkta tutarlı başlangıç yanıtları temelinde tedavi gruplarına atanmış olarak rapor edilmez ve bireysel denekler de temel yanıtların standartlaştırılmasına izin veren tutarlı bir şekilde uygulanan bir dizi dışlama kriteri temelinde değerlendirilmez.

Burada, bir elektronik von Frey cihazı (EvF) kullanarak Bothrops jararaca zehirine maruz kaldıktan sonra fare arka pençe dokunsal hassasiyetini ölçmek için alternatif bir yöntem sunuyoruz. Cunha ve meslektaşları⁶, kemirgenlerde EvF tekniklerinin kullanımına öncülük ettiler ve EvF'nin kemirgen inflamatuar ağrı modellerinde "daha hassas, objektif ve nicel" bir dokunsal duyarlılık ölçüsü sağladığını göstermek için CvF ve EvF etkinliğini sistematik olarak karşılaştırdılar. Kısaca EvF ölçümlerinde, test edilen doku için uygun sertlikte tek tip çapa (0,8 mm) sahip higroskopik olmayan bir polipropilen von Frey ucu, kemirgenin uçtan geri çekildiği kuvveti/ağırlığı gösteren bir elektronik proba ve okumaya bağlanır. CvF ve EvF ölçümleri arasında birkaç önemli fark vardır. İlk olarak, EvF kullanarak hem temel hem de deneysel tepkileri ölçme süreci, bir yanıt olana kadar arka pençe üzerindeki basınç artan kuvvetle uygulanabildiğinden ve CvF'de olduğu gibi uçları değiştirmeye gerek olmadığından büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır; Hayvanlar tahlil odalarında daha az zaman harcarlar ve bu nedenle deney sırasında daha az stresli ve daha rahattırlar. İkincisi, EVF, çalışma konuları için rasyonel dışlama kriterlerinin kabul edilebilir temel eşik aralıkları şeklinde göreceli olarak uygulanmasına izin verir. Bu, tedavi grupları içinde ve arasında temel yanıtların standardizasyonuna izin verir. Üçüncüsü, deneysel bir tedaviyi takiben bir deneğin tepkisi her zaman kendi bireysel temel tepkisiyle karşılaştırılır ve ölçümler için önemli iç kontroller oluşturur. Dördüncüsü, geri çekilme eşiklerinin doğruluğu, manuel filamentlerin ağırlıkları şeklinde mevcut olan artışlar yerine sürekli olarak basınç uygulanabildiğinden, daha yüksek bir çözünürlük seviyesinde kaydedilir. İyi tasarlanmış CvF tahlillerinde olduğu gibi, EvF tabanlı deneyler de aynı araştırmacı (tedaviye kör) ile kuvvet uygulayarak ve tepki davranışlarını kaydederek gerçekleştirilir. Bu tekniğin, ölçümlerin iç tutarlılığını sağlamak için araştırmacılar tarafından zaman ve çaba gerektirdiğini ve tutarsız başlangıç tepkileri nedeniyle dışlanması gerekebilecek fareler için uygun ödeneklerin yapılması için deneylerin planlanmasını gerektirdiğini belirtmek önemlidir.

Mekanik duyarlılığın uygulanması kolay, etkili, iyi kontrol edilen bir değerlendirmesi, zehirlenme gibi enflamatuar olay modellerine davranışsal değerlendirmenin eklenmesini kolaylaştırır - burada dokunsal hassasiyetteki değişikliklerin ölçümünde EVF ölçümlerinin kapasitelerini ve gücünü göstermek için kullandığımız örnek. Erkek ND4 İsviçre farelerinin, arka pençedeki Güney Amerika çukur engereği Bothrops jarkaraca'dan elde edilen zehir enjeksiyonunu takiben gelişmiş bir mekanik hassasiyet gösterdiğini bulduk. Davranışsal tepkilere, etkilenen dokuda ödem, nötrofil akışı ve mast hücre degranülasyonu eşlik etti.

Protokol

Macalester College'ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tüm protokolleri onayladı. Bu deneyler için 8-12 haftalık erkek ND4 İsviçre fareleri kullanıldı.

1. Bothrops jararaca Zehri Hazırlama ve Enjeksiyon

1. DİKKAT: B. jararaca zehiri zehirlidir. Tozu tutarken ve solüsyonları hazırlarken eldiven, maske ve göz koruması kullanın.
2. 45 μg / kg B. jararaca zehiri (daha önceki doz-yanıt deneyleri ile belirlenen rejim) veya% 0.9 salin aracı (10 μl), 29 G x 1/2 iğneli 3/10 ml insülin şırıngaları kullanarak her iki arka pençeye intraplantar enjeksiyon yoluyla uygulayın. Not: Deneysel tasarıma bağlı olarak, tedavi ve kontrol solüsyonları, her denek içinde iç kontroller sağlamak için sırasıyla her bir arka pençeye ayrı ayrı enjekte edilebilir.

2. Elektronik von Frey Aparatı Kurulumu ve Çalıştırılması

1. Elektronik von Frey ünitesini prob standına yerleştirin. Prob ve kablonun ekran ünitesine uygun şekilde bağlandığından emin olun ve cihazı açın. Kurulum modunda okumayı sıfıra (0.00 g) ayarlayın ve sağlanan test ağırlığını (5.00 g) yavaşça von Frey probunun konisine yerleştirin.
2. Okumayı bir laboratuvar not defterine kaydedin ve test oturumu bittikten sonra bu prosedürü tekrarlayın. Test oturumundan önce ve sonra test ağırlığı okumalarınız arasında 0.20 g'dan daha büyük bir tutarsızlık varsa veya test ağırlığı uygulandıktan sonra okuma dalgalanıyorsa, cihazın (üretici tarafından) yeniden kalibrasyonu gerekli olabilir.
3. Fare arka pençesinin çekilme eşiğini değerlendirmek için, probla birlikte verilenler arasından uygun polipropilen ucu kullanın. Uç seçimi, incelenen dokuya bağlıdır. Sert uçlar daha az hassas, daha sert arka pençe dokusu için iyi çalışırken, yarı esnek uçlar ano-genital sırt gibi daha hassas bir alan için daha iyi bir seçim olabilir (Chatterjea, yayınlanmamış). Sert ucu yavaşça probun konisine monte edin.
4. Uygulanan maksimum basıncı kaydetmek için, uygulanan maksimum basınç ekrana kaydedilecek şekilde çalışma modunu kurulumdan çalıştırmaya geçirin. Bu modda, prob geri çekildiğinde uygulanan maksimum basınç okuması görüntü ekranına kaydedilecektir.

3. Hind Pençesi Çekilme Eşiği Değerlendirmesi için Genel Hususlar

1. İdeal olarak, bir EVF aparatı kullanarak arka pençe çekilme eşiğini (mekanik hassasiyet) ölçmek için iki araştırmacıya ihtiyaç vardır - biri cihazı çalıştırmak ve ölçümleri gerçekleştirmek için, diğeri ise kaydedilen ölçümleri yazıya dökmek ve fareleri işlemek için.
2. Yanlılığı azaltmak için, cihazı çalıştıran araştırmacı tedavilere ve kaydedilen geri çekilme eşiği değerlerine karşı kör olmalıdır. Ayrıca, ölçümler arasında tutarlılığı sağlamak için, aynı kişi tüm temel ve deneysel geri çekilme eşiklerini değerlendirmelidir.
3. Tüm ölçümleri sessiz, sıcaklık kontrollü bir odada ve günün aynı saatinde¹⁴ gerçekleştirin.
4. Ölçümleri kaydeden deneyci, her fareyi bir ağ zemin standı üzerine yerleştirilmiş çok birimli polimetil metakrilat (PMMA) muhafazasının ayrı odalarına yerleştirmelidir. Hazneleri delikli PMMA kapaklarıyla örtün ve farelerin kaçmasını önlemek için üstüne ağır bir nesne yerleştirin. Atılan atıkları emmek/toplamak için standın altına emici malzeme yerleştirin. Başlangıç veya deneysel geri çekilme eşiği değerlendirmesi ^6,7,10'dan önce farelerin odalarda 15 dakika alışmasına izin verin.
5. Farelerin arka pençeleri, ağ tabanının açıklıklarından kolayca erişilebilir olmalıdır; bu nedenle, örgü zemin standını frenli bir arabaya veya her taraftan erişilebilen sabit bir tezgah üzerine rahat bir yüksekliğe yerleştirin.
6. Ölçümler sırasında, farelerin, ölçüm odasının hemen dışına yerleştirilmiş bir gıda peleti¹⁵ veya ölçümden önce, ancak ölçüm sırasında değil, odanın tabanının tel örgüsü boyunca bir kaleme vurularak veya çalıştırılarak üretilen çok hafif bir gürültü ile dikkatinin dağılması gerekebilir. Bu, farenin sabit kalmasına neden olur ve deneycinin daha kolay ölçüm yapmaya başlamasını sağlar.

4. Temel Hind Pençe Geri Çekilme Eşiği Değerlendirmesi

1. İlk temel ölçüm seti, tedavinin uygulanmasından 48 saat önce yapılmalıdır. Sert ucu monte ettikten sonra probu sıfırlayın. İki elinizi kullanarak, sol veya sağ arka pençenin ortasını (ayak tabanı alanı) uyarmak için probu yavaşça kaldırın (her iki pençe de aynı tedaviyi aldıysa).
2. Arka pençe geri çekilmesi, arka pençe yalama veya dört pençe atlama^6,10 gibi tanımlanmış nosiseptif tepki davranışları gözlenene kadar basıncı kademeli olarak artırın. Diğer araştırmacıya, gözlemlenen davranışı ortaya çıkaran baskıyı yazıya dökmesi talimatını verin.
3. Bitişik haznede bulunan farenin geri çekilme eşiğini ölçün. Her farenin para çekme eşiklerini bir kez değerlendirene kadar devam edin. Dört kez daha tekrarlayın, böylece her fare daha önce açıklandığı gibi^{5x ölçülür 10}.
4. Her fare için, 5 ölçümün ortanca değerini hesaplayın ve ardından her değerin ortanca değerden ne kadar saptığını hesaplayın. En az sapan 3 değer seçin ve daha önce açıklandığı gibi bir temel para çekme eşiği elde etmek için bunların ortalamasını^{alın 10}. Bu gösterimde, 5 değerden 3'ü kullanılarak ölçüm standartlaştırılmıştır; Belirli ölçüm sayıları deneysel tasarıma göre değişebilse de, taban çizgilerini değerlendirmek için tüm farelerin eşit sayıda dürtülmesini sağlamak önemlidir.
5. Temel ölçümleri 24 saat sonra tekrarlayın. Fare başına 5 ölçüm yapın ve temel bir geri çekilme eşiği elde etmek için medyana en yakın olan 3'ün ortalamasını alın.
6. Bir farenin ortalama temel çekilme eşiğini hesaplamak için, tedaviden 48 ve 24 saat önce alınan temel çekilme eşiklerinin ortalamasını alın. Ortalama temel çekilme eşiği 3,50 g'ın altındaysa veya iki temel eşik arasında 2,00 g veya daha fazla fark varsa, fareyi deneyden hariç tutun. Bu kriterler, deneydeki tüm farelerin tutarlı başlangıç yanıtlarına ve tedaviyi takiben daha düşük eşiklerin gözlemlenmesine izin veren yeterince yüksek temel geri çekilme eşiklerine sahip olmasını sağlar.
7. Not: Dışlama eşiği, incelenen dokuya, incelenen hayvanların türüne ve kullanılan uç tipine bağlı olacaktır. Örneğin, 3.5 g'nin ND4 arka pençe dokusu için yararlı bir kriter olduğunu bulduk, ancak ano-genital sırt gibi daha hassas alanların daha düşük bir dışlama eşiğine ihtiyacı var (Chatterjea, yayınlanmamış).
8. Fareleri tedavi gruplarına atayın, böylece deney gruplarının ortalama geri çekilme taban çizgisi, tedaviler uygulanmadan önce mümkün olduğunca benzer olur.

Not: Temel ölçümler, bir deneyden 48 saat önce gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, tedavilerin başlamasından önce düzenli aralıklarla en az 2 set temel ölçüm tamamlanmalıdır.

5. Deneysel Arka Pençe Geri Çekilme Eşiği Değerlendirmesi

1. Deneyin tasarımı tarafından belirlenen uygun zaman noktalarında tedaviyi takiben arka pençe çekilme eşiğini (mekanik hassasiyet) değerlendirin. Ölçümler tamamlandıktan hemen sonra fareleri yiyecek ve suya erişimi olan kafeslerine geri getirin.
2. Yukarıda belirtilen adımları izleyin; özellikle hassasiyet birden fazla zaman noktasında değerlendirilecekse, (tedavi edilen) arka pençe dokusunun aşırı uyarılma olasılığını azaltmak için 5 ölçüm yerine 3 ölçüm yapın. Alınan üç ölçümden herhangi ikisi 2.00 g'dan fazla farklılık gösteriyorsa, dördüncü bir ölçüm yapın.
3. Her fare için deneysel çekilme eşiği elde etmek için 3 ölçümün ortalamasını hesaplayın. 4 ölçümün yapıldığı herhangi bir fare için, deneysel geri çekilme eşiğini elde etmek için medyandan en az sapan üçünün ortalamasını hesaplayın.
4. Belirli bir zaman noktasında her fare için delta çekilme eşiği elde etmek için, taban çizgisini deneysel çekilme eşiğinden çıkarın. Tüm fareler ve tüm deneysel zaman noktaları^{için tekrarlayın 9}.
5. Toplanan veriler üzerinde uygun istatistiksel analizler yapın. Burada JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) kullanarak Tek Yönlü Varyans Analizi ve Tukey HSD post hoc analizi gerçekleştirdik.

Sonuçlar

Yerel B. jararaca zehri uygulaması, ND4 Swiss erkek farelerin arka pençe dokunma hassasiyetinde değişikliklere ve doku ödemine neden olur.

45 µg/kg B. jararaca zehri uygulamasından 1,5 saat sonra, ND4 Swiss erkek fareler arka patilerini bazal seviyeden 3,0 g daha düşük bir basınçta geri çektiler (Şekil 1A). Tüm gruplar için bazal geri çekme tepkisi ~4,5 g uygulanan basınçta gerçekleşti; zehir tedavisi sonrası deney fareleri arka patilerini 1-1,5 g uygulanan basınçta geri çektiler (veriler gösterilmemiştir). Salin uygulanan kontrol fareleri, test edilen tüm zaman noktalarında bazal seviyeye kıyasla basınca verilen tepkide çok az azalma gösterdiler veya hiç göstermediler. Tedavi edilen farelerdeki azalmış yanıt eşikleri, zehirleme sonrası 3. ve 6. saatlerde açıkça korundu (Şekil 1A) ve 24. saate gelindiğinde kontrollerden ayırt edilemez hale geldi (veriler gösterilmemiştir). Zehirlenmiş farelerin arka patilerinde inflamasyonla karakteristik olan doku ödemi görüldü. Zehir uygulamasından 1,5 saat sonra, daha önce tanımlandığı şekilde¹⁰ ölçülen tedavi edilmiş arka patiler, bazal seviyeden 1,5 mm daha kalındı; ödem 3. ve 6. saatlerde devam etti (Şekil 1B). Buna karşılık, salin uygulanan patiler deney süresince herhangi bir şişme veya kalınlık değişimi göstermedi. Burada gösterilen temsilci deney için, bazal ölçümler için toplam 21 fare kullanıldı ve deneye dahil edilmek üzere 14 fare seçildi. Bunlar, bazal seviyedeki ortalama geri çekme yanıtları grup genelinde yaklaşık 4,5 g olacak şekilde tedavi gruplarına atandı.

B. jararaca zehriyle indüklenen dokunma hassasiyetindeki değişikliklere, ND4 Swiss erkek farelerin arka pençelerinde mast hücre degranülasyonu ve nötrofil infiltrasyonu eşlik eder.

Artan taktil duyarlılık ve doku ödemine ek olarak, zehirlenmiş ve salin uygulanmış farelerin arka ayaklarında nötrofil göçünü (Şekil 2A-B) ve mast hücresi degranülasyonunu (Şekil 2C-D) değerlendirdik. Nötrofiller, dolaşımdan lezyona göç eden ilk inflamatuar hücrelerdir ve inflamatuar nosiseptif yanıtları araciledikleri bilinmektedir^10,16,17. Mast hücreleri dokuda yerleşik sentinel hücrelerdir¹⁸ ve mast hücresi degranülasyonu, farelerin arka ayağındaki¹⁰ ve sıçanların dura materindeki¹⁹ nosiseptif yanıtlarla ilişkilendirilmiştir.

Burada, ötanize edilen farelerden venom uygulamasının 1,5 saat sonrası alınan, hematoksilin-eosin boyalı 4 µm parafin gömülü sagital plantar doku kesitlerinin¹⁰ sayılmasıyla yapılan değerlendirmede, venom verilen arka pençelere nötrofil akışının, salin uygulanan arka pençelere kıyasla yaklaşık 1.000 kat arttığı saptanmıştır (Şekil 3A).

Salinle işlem görmüş patilerde, arka pati dokusundaki plantar mast hücreleri büyük ölçüde sağlamdı veya hafif granül kaybı gösteriyordu (Şekil 3B). Buna karşılık, zehir etkisindeki arka patiler, mast hücrelerinde %15-20 oranında orta ve yaygın granül kaybı sergiledi (Şekil 3B). Yukarıda açıklanan doku kesitleri toluidine blue ile boyandı ve granül kaybı durumunu belirlemek için daha önce tanımlandığı üzere¹⁰ gözlemlenen mast hücresi başına görünür granül sayıları sayıldı.

Şekil 1. Yerel B. jararaca Venom uygulaması, ND4 Swiss erkek farelerin arka pençe mekanik duyarlılığında değişikliklere ve doku ödemine neden olur. Bazal geri çekilme eşikleri ve bazal pati genişliği, intra-plantar uygulama öncesindeki 48. ve 24. saatlerde değerlendirildi. B. jararaca zehir (Bjv; 45 µg/kg) veya taşıyıcı (salin) uygulaması (10 µl). Geri çekilme eşikleri, tedaviyi takiben 1,5, 3 ve 6. saatlerde değerlendirildi (A). Aorta plantar bölgedeki ortalama pençe genişliği (bir farenin sol ve sağ pençesinin genişliğinin ortalaması) dokuların ödem durumunu belirlemek amacıyla, daha önce tarif edildiği üzere, başlangıçta ve ardından tedaviyi takiben 1,5, 3 ve 6. saatlerde dijital kumpas kullanılarak değerlendirildi¹⁰ (B). Anlamlılıklar, Sal ile işlem görmüş farelerle karşılaştırılmıştır (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < sırasıyla 0,001). Tedavi grubu başına n = 10-11 fare. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Şekil 2. B. jararaca zehirinin neden olduğu mekanik hassasiyete, ND4 Swiss erkek farelerin arka pençelerinde mast hücresi degranülasyonu ve nötrofil infiltrasyonu eşlik etmektedir. Tedaviden 1,5 saat sonra her grup için 3 fare CO₂ ile ötanize edildi ve arka pençeleri çıkarılıp 24 saat boyunca %10'luk formalinde saklandı, ardından %70'lik etanola aktarıldı, 1-2 hafta boyunca %15'lik EDTA ile dekalsifiye edildi ve parafine gömüldü. Nötrofilleri (A-B) ve mast hücrelerini (C-D) görüntülemek için 4 µm'lik sagital kesitler sırasıyla hematoksilin-eozin (A-B) ve toluidin mavisi (C-D) ile boyandı. Görüntüler, belirtildiği üzere 400X ve 1.000X büyütmelerde elde edildi. Daha büyük görüntüyü görüntülemek için buraya tıklayın. 

Şekil 3. B. jararaca Zehirle tetiklenen mekanik hassasiyete, ND4 Swiss erkek farelerin arka patilerinde mast hücre degranülasyon seviyelerinde ve nötrofil girişinde meydana gelen belirgin artışlar eşlik etmektedir. Boyanmış doku kesitlerindeki nötrofiller ve mast hücreleri, bir Olympus CX21LED mikroskobu kullanılarak sayıldı. Nötrofiller, her işlem grubu için 3 arka patide, topuktan parmak uçlarına kadar, 400X büyütmede yan yana gelen görüş alanlarında sayıldı. (A). Mast hücreleri, her grup için 3 ayak tabanında sayıldı ve degranülasyon durumları, hücre sınırının dışında görülen granül sayısına göre; daha önce açıklandığı üzere; sağlam (0), hafif (0-10), orta (10-20), yaygın (21+) şeklinde skorlandı.¹⁰ (B).  Aynı hücrelerin iki kez sayılmasını önlemek için, arka pençe kesitlerinde nötrofil sayılarını ve mast hücresi degranülasyon seviyelerini değerlendiren araştırmacılar, oküler retikülüne işlenmiş bir ızgara kullandılar. Araştırmacılar, uygulanan tedaviye karşı körleme yöntemine tabi tutulmuştur.s. Anlamlılıklar, Sal ile tedavi edilen farelerle karşılaştırılmıştır (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < sırasıyla 0,001). Tedavi grubu başına n = 3 fare.  Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Tartışma

Geri çekilme tepkilerindeki değişikliklerin ölçümü, kemirgen ağrı ve inflamasyon modellerinde dokunsal duyarlılıktaki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan önemli bir araçtır. Burada, bu değerlendirmeyi gerçekleştirmek için elektronik bir von Frey cihazının faydasını gösteriyoruz. Bu tekniğin çeşitli avantajları vardır: i) birbirine oldukça yakın birden fazla zaman noktasında birden fazla fare için uygulanan basınca verilen geri çekilme tepkilerini hızlı bir şekilde değerlendirebiliriz, ii) küçük bir doku alanına sürekli ve spesifik basınç uygulamak için tek bir uç kullanabiliriz, iii) bir geri çekilme tepkisi elde etmek için uygulanan kesin basıncı doğru bir şekilde ölçebiliriz, ve iv) davranışsal değerlendirmelerin mümkün olduğunca kesin ve objektif olmasını sağlamak için sağlam temel kesintileri, dışlama kriterlerini ve iç kontrolleri kolayca uygulayabiliriz.

Bir EvF testi için en iyi sonuçları elde etmek için kritik adımlar, cihazın önceden kalibrasyonu ve tutarlı ölçüm uygulamalarıdır. Protokol bölümünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, cihazın dikkatli bir şekilde kullanılması ve kullanımdan önce ve kullanım sırasında uygun kalibrasyonun sağlanması gerekir. Herhangi bir ölçüm yapılmadan önce, makinenin optimum şekilde çalışmasını sağlamak için test ağırlığı okumalarının onaylanması gerekir. Okumalar önemli ölçüde dalgalanıyorsa veya test ağırlığı okumaları doğru değilse, aparatı kalibre etmek için derhal üreticiyle iletişime geçilmelidir. Bunu akılda tutarak, cihazın beklenmedik bir kalibrasyon ihtiyacı nedeniyle zamana duyarlı deneylerden ödün vermemek için mümkünse yedek bir elektronik von Frey aparatına sahip olunması tavsiye edilir. Ayrıca, iyi eğitimli tek bir araştırmacı, tedavi gruplarına kör kalırken belirli bir çalışma veya deney serisi için tüm temel ve deneysel ölçümleri yapmalıdır. Fareler sessiz bir odada değerlendirilmeli, sabit bir sıcaklıkta tutulmalı, EvF odalarına en az 15 dakika alıştırılmalı, ancak odada gereğinden fazla tutulmamalıdır (özellikle tek bir gün içinde birden fazla ölçüm yapılırsa) stres ve rahatsızlığa bağlı davranış varyasyonlarını en aza indirmek için.

EvF ölçümleri, mevcut CvF tekniklerine göre önemli gelişmeler sunar. Araştırmacılar sürekli basınç uygulayabilir ve CvF filament deneylerinde 6 yapıldığı gibi çeşitli ağırlıklardaki uçlar arasında geçiş yapmak zorunda^kalmazlar. Bu, özellikle iltihaplı veya yaralı doku durumunda geçerli olan dokuda daha az dürtmeye yol açar. Geri çekilmenin meydana geldiği kesin basınç, CvF ölçümlerinde kullanılan mevcut filament ağırlıkları ile de sınırlı olan %50 geri çekilme ölçümleri kullanılarak ölçülebilir¹³. Rasyonel ve tek tip dışlama kriterleri uygulanabildiğinden (yukarıda tartışıldığı gibi), fareler deney gruplarına atanabilir, böylece tüm gruplar deneyin başında benzer ortalama taban çizgilerine sahip olur. EvF ölçümleri, mutlak tepkilerin kendisini değil, belirli bir uyarana verilen davranışsal tepkideki değişiklikleri değerlendirir. Bu nedenle, her farenin nosiseptif yanıtındaki değişiklik, bireysel deneysel ve temel geri çekilmeleri arasındaki fark olarak ölçülür, böylece alınan her ölçüm için dahili kontroller sağlanır.

EvF'nin belki de en önemli sınırlaması, manuel muadiline benzer şekilde, aynı araştırmacının belirli bir dizi temel ve deneysel ölçüm için tüm ölçümleri yapması gerektiğidir. Bu, tekniğin ölçeklendirilmesini zaman, personel ve ekipman açısından zorlaştırıyor. Bir seferde ~20 farenin (tahlil odalarının konfigürasyonuna bağlı olarak), ölçümler arasında en az 45 dakika olması koşuluyla, birden fazla zaman noktasında 30-45 dakika veya daha kısa sürede ölçülebileceğini bulduk. Bu bağlamda ilgili bir husus, bireysel deneycilerin öğrenme eğrisidir. Bireysel bir araştırmacının tam ölçekli bir deneye başlayabilmesi için iç tutarlılığın sağlanması gerekir ve bu, istenen tutarlılığa ulaşılana kadar tekrarlanan temel yanıt ölçümlerini içeren saatlerce özel uygulama gerektirir. Ek olarak, temel değerlerin kullanılması, bir deney için temel alınan tüm farelerin dahil edilemeyeceği anlamına gelir; Deney başına baz alınan farelerin %25-30'unun tipik olarak hariç tutulduğunu bulduk.

Değişiklikler ve gelecekteki uygulamalar açısından, EvF davranışsal ölçümleri, inflamatuar patolojilerin altında yatan eşlik eden akut ve/veya kronik ağrıyı analiz etmek için çok çeşitli inflamasyon modellerine güçlü bir boyut katar. Zehirlenmede, ND4 erkek farelerin arka pençelerinde doku şişmesi, lökosit alımı ve mast hücre degranülasyonunun beklenen sonuçlarına dokunsal duyarlılıkta belirgin, hızlı başlangıçlı değişikliklerin eşlik ettiğini bulduk. Bu bulgular, mast hücre aracılarının sıçanlarda²⁰ termal duyarlılığa katkıları ve CvF²¹ kullanılarak ölçülen ND4 İsviçre farelerinde B. jararaca zehiri tarafından indüklenen mekanik duyarlılık hakkındaki önceki gözlemleri doğrulamaktadır. EvF protokolü, arka pençe dışındaki dokularda, örneğin CvF'nin şu anda kullanıldığı karın⁷ ve ano-genital sırt^8'de kullanım için kolayca değiştirilebilir. Alerjiler, yara iyileşmesi, nöropatiler ve diğer patolojilerin kemirgen modelleri, arka pençe dahil ve ötesindeki dokulardaki mekanik duyarlılık ölçümlerini içerecek şekilde kolayca uyarlanabilir.

Özetle, EvF, kemirgenlerde nosisepsiyon ölçümüne yönelik klasik bir yaklaşımı güncelleyen yararlı ve etkili bir tekniktir ve çok çeşitli hastalık modellerinde ağrının altında yatan karmaşık mekanizmaların araştırılmasında önemli bir yeni araçtır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ND4 İsviçre erkek fareleri	Harlan	0-32	Burada kullanılan fareler 8-12 haftalıktı ve Macaleter College'ın IACUC yönergelerine göre barındırıldı ve kullanıldı.
3 ml / 100 İnsülin şırıngası, 29 G 1/2 iğne	BD	BD309301	Her kullanımdan sonra uygun kaba atın.
B. jararaca zehir	Sigma	V5625	DİKKAT: Toksik madde. Göz ve cilt koruması kullanın. Steril% 0.9 tuzlu su içinde çözülür.
Elektronik von Frey cihazı; prob = 90 g aralığı	IITC	2394	Yavaşça hareket edin ve her zaman yatay olduğundan emin olun. Probu sıfırlamak için "Program" ve "Temizle" tuşlarına basın. Kurulumdan çalışma moduna geçmek için "Fonksiyon" ("MH" okuması için) veya "MAX" düğmesine basın.
Kafes standı + PMMA odaları	IITC	410	Her tarafa erişmek için sabit bir tezgah üstüne veya dört tekerlekli bir arabaya yerleştirin.
Yalnızca elektronik von Frey sert uçlar, 90 g aralığı	IITC	2390	n/a