Yöntem makalesi

Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği

DOI:

10.3791/51213

⸱

18 Mart 2014

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Orthopedic Research, Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bildirilen protokol sağlar: fotodinamik hücre hatlarında tedavi (PDT) ve hayvan modellerinde tedavi uygulamadan önce PDT ayarlarının optimizasyonu etkinliğinin değerlendirilmesi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, daha az sistemik yan etkiler ile, kansere karşı daha etkili bir tedavi bulma zorluğu olmuştur. Bu nedenle Fotodinamik tedavi, daha seçici tümör tedavisi için yeni bir yaklaşımdır.

Oksijen varlığında, belirli bir dalga boyundaki ışık ile aktivasyon üzerine, bir sitotoksik yanıtı ortaya çıkarma 1 oksijen radikal üreten, toksik olmayan bir photosensitizer (PS), kullanan fotodinamik terapi (PDT). FDA tarafından neredeyse yirmi yıl önce onun onayına rağmen, PDT günümüzde sadece kanser türleri (cilt, mesane) ve nononcological hastalıkları (sedef, aktinik keratoz) 2 sınırlı sayıda tedavi etmek için kullanılır.

PDT kullanımının en büyük avantajı, sistemik yan etkileri engelleyen bir lokal tedavi, gerçekleştirmek için yeteneğidir. Ayrıca, (sinirler veya kan damarlarının çapında) örneğin hassas bölgelerde tümörlerin tedavisine izin verir. Burada, bir intraoperatPDT ive uygulama osteosarkom (OS), primer tümör uyduları hedef kemik tümör, cerrahi tümör rezeksiyonu sonrasında dokuyu çevreleyen tümör geride kabul edilir. Tedavi nükslerin sayısını azaltmakta ve (postoperatif) metastaz riskini azaltmayı amaçlamaktadır.

Bu çalışmada, iyi kurulmuş intratibial OS fare modellerinde, insan hastalığı üretmek için kullanılan yaygın olarak kullanılan OS hücre çizgilerinin etkili bir tedavi için uygun PDT ayarlarını elde etmek üzere in vitro PDT işlemleri içinde mevcut. PS mTHPC alımı, bir spektrofotometre ve fototoksisite bir WST-1 deneyi ile ve hayatta kalan hücrelerin sayımı ile değerlendirilen, hücre ölümünü teşvik etmek için 652 nm'de mTHPC lazer ışığı uyarım ile tahrik edilmiştir ile incelenmiştir. Kurulan teknikleri, hayvan modellerinde gelecekteki çalışmalar için uygun PDT ayarları tanımlamak için bize sağlar. Onlar PDT etkinliğinin değerlendirilmesi için kolay ve hızlı bir araçtır vitro, in vivo olarak bir uygulama yapılmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteosarkom (OS) sanat tedavi Bugünkü devlet, bir primer kemik tümörü, neo adjuvan kemoterapi ve cerrahi bir kombinasyonunu kapsar. Bu tedavi rejimi, kemoterapi kullanımından önce, yaklaşık% 20 ila lokalize hastalığı olan hastaların hayatta kalma oranı artışı, şu anda 4,% 3, 60-70 arasındadır. Ancak, son iki yılda, yerel hastalığı olan OS hastaların genel sağkalım, 5 4 durmuş durumda. Ayrıca, bu hastaların% 30-40 tan sonra 3 yıl içinde nüks ve metastatik hastalığı olan hastalarda% 20-30 4 kötü bir hayatta, 6, 7, yaşamaya devam. Bu hastaların sonuçlarını iyileştirmek için, yeni tedavi stratejileri geliştirilmesi gerekmektedir.

Fotodinamik terapi (PDT), bir çok yeni anti-kanser terapisi, bir photosensi uyarılması için belirli bir dalga boyunda ışık kullanırkan akışı içine enjeksiyonundan sonra tümör hücrelerinde biriken tizer (PS). PS'nin Lazer ışığı uyarım tümör hücreleri ve hücre ölümü ile sitotoksik reaksiyonu meydana oksijen mevcudiyetinde oksijen radikalleri oluşturur. PDT tümör enfarktüs yol açan, vazokonstriksiyon ve tümör mikro-damar trombus oluşumuna neden olan ve, dolayısıyla tümör içinde yerel hipoksi ve anoksi Bu birincil mekanizma yanı sıra, iki ek PDT biyolojik işlemler, daha az tümör büyümesine katkıda uyandırdı. Son olarak, PDT yaralı ve ölen tümör hücrelerinin lokal bir bağışıklık tepkisinin, PDT'nin oldukça benzersiz bir özelliği tetikler. Bu, tamamlayıcı sistemi ve dendritik hücreleri antijen sunan 8 aktivasyonunu içerir. Bu durumda, şartlar tümör spesifik bağışıklık yol açan, lenfoid hücrelerin sonraki aktivasyonu tümör antijenlerin sunumu için oluşturulur.

Şimdiye kadar, PDT, yumuşak doku tümörleri ve hyperpl çeşitli tedavi etmek için kullanılmaktadırasya adlı, örneğin aktinik keratoz, Barrett özofagus, endobronşiyal tümörler, mesane kanseri, bazal hücreli karsinom, baş ve boyun kanseri 2 palyatif tedavi olarak. Tedavi çok az yan etkileri olan, yerel büyük ölçekli nekroza neden olduğu bilinmektedir ve bu yüzden seçici olarak tümör dokusu ortadan kaldırmak için potansiyele sahiptir. Bu avantajlara rağmen, PDT uygulama kemoterapötik ilaçların uygulanması daha teknik olarak daha zor olmaya devam etmektedir. Maksimal etkinlik, PS konsantrasyonu, ışığa maruz kalma süresini ve toplam ışık enerji transferini elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir. Bu, in vivo deneyler yapılabilir, ancak Optimize edilmiş gereken parametrelerin görece çok sayıda, bu ilk olarak in vitro en uygun şartları belirlemek için daha etkilidir.

Aşağıda tarif edilen deneylerde, PS 5,10,15,20-tetrakis-(meta-hidroksifenil) CHL kullanan PDT in vitro etkinliği testOrin, mTHPC (Şekil 1A) kısaltılır. mTHPC anda baş ve boyun kanseri hafifletici tedavisi için klinikte kullanılan tıbbi ürün Foscan, aktif maddedir. Düşük konsantrasyonlarda zaten büyük hücre hasarının neden olan, en güçlü PS biridir ve bu doku penetrasyonu 9, 10 açısından diğer PS üstün olduğu gösterilmiştir. Hafif emilme tayfı (Şekil 1 B), sırasıyla PS biriken doku lokalizasyonu ve PDT indüksiyonu için kullanılan iki önemli tepe, 417 nm 'de bir ve 652 nm' de bir ikinci, göstermektedir.

Şu anda, mTHPC için bir lipozomal formülasyon geliştirme aşamasındadır. İşte, biz bu lipozomal formülasyon alımını ölçmek için, ve iki insan OS hücre hatlarında FDT gerçekleştirmek için prosedürleri tarif; düşük metastatik HOS ve yüksek metastatik 143B hücreleri. Burada sunulan verilerin bazıları 11 daha önce rapor edilmiştir. ThBurada anlatılan E yaklaşım PDT etkinliği üzerinde bir metastatik fenotip etkisini araştırmak için bize sağlar. Orthotopically bağışıklık yetersizliği olan SCID farelerinin arka bacaklarda enjekte 143B hücrelerinin metastaz intratibial birincil tümörlerin, yakından insan Metastaz hastalığı taklit eden bir model neden olur. Bu nedenle, önerilen in vitro deneyler uygun PDT ayarlar daha sonra in vivo deneylerde kullanılmak üzere değerlendirmek için mükemmel bir şekilde uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Bulunduğu Low mTHPC arasında Alımı ve Yüksek Metastatik HOS ve 143B OS Hücre Hatlarının Karşılaştırılması

  1. DMEM, Ham F12 ve bir oranı 4.5:4.5:1 içinde ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu ihtiva eden hücre kültür ortamı hazırlayın.
    Not: PS mTHPC bir lipozom formülasyonu, 1.5 mg / ml mTHPC bir son konsantrasyonda su içinde çözülür.
  2. Levha 0.2 x 10 6 HOS ve 143B hücre / oyuk, 6 oyuklu tabaklar (her bir durum için kopyaların) ve hücreler gece boyunca uygun sağlar.
    Not: sayısını tek tek hücre çizgileri için ayarlanmalıdır. % 80-90 arasında bir confluency Deney zamanında en çok uygundur.
  3. Ertesi gün farklı zaman dilimlerinde (zamana bağlı alımı) için mTHPC sabit bir konsantrasyonu ile inkübe hücreleri, ya da sabit bir süre (doza bağlı bir uptake) boyunca mTHPC artan yoğunluklarda.
  4. Belirli bir zaman p mTHPC ile hücreleri inkübeoints veya mTHPC konsantrasyonları.
    Not: Bu çalışmada, HOS 143B ve hücre çizgileri, her ikisi için de 0.6 ug / ml ile inkübe edildi mTHPC 0, 2.5, 5, veya 10 saat, ya da 5 saat boyunca 0, 0.6, 2.5 ve 10 ug / ml ile mTHPC. Uygulanan zaman aralıkları ve dozajlar, kullanılan bir hücre hattı ile ilgili olarak değişebilir.
  5. Her zaman hücreleri direkt ışık maruz kalmasını önlemek için karanlık veya karartılmış ışık koşullarında çalışmak unutmayın.
  6. Belirtilen koşullarda hücrelerin inkübasyonundan sonra, ortam aspire ve hücreler PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, 0.5 ml tripsin / EDTA ile hücreleri ayırmak ve hücreleri sayın.
  7. Ayrıldıktan sonra, 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri orta aspire ve 200,000 hücre / ml 'lik bir son yoğunluğa kadar PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  8. Elde edilen hücre süspansiyonu pipetle 100 ul, 96 oyuklu bir plaka içerisinde ve bir floresan spektrofotometrede bu hücrelerin floresan ölçer (örneğin 20.000 hücre). AyarımTHPC floresans ölçümleri için ler vardır: emisyon için 652 nm eksitasyon ve 417 nm.
  9. , Hücre başına içsel mTHPC miktarının hesaplanması aşağıdaki gibi hücre sayısı ve hücre hacmine nispi floresan ünitesi (RFU) normalleştirmek amacıyla:
  10. 0-4 ug / ml (araç kullanımı üç kopyalı ölçüm) ikinci PBS mTHPC farklı konsantrasyonları kullanılarak standart bir eğri hazırlanır. 96 oyuklu bir plaka içerisinde her seyreltme oranından 100 ul pipet ve aşama 1.6 altında tarif ayarları kullanarak kuyuların floresan ölçer.
  11. Kuyuda (ug / ml) mTHPC konsantrasyonunu vermektedir mTHPC, doğrusal standart eğrinin eğimi ile (20,000 hücreler için elde edilmiş) RFU bölün.
  12. (Hücre süspansiyonu 100 ul temsil ug) bir kuyuda mTHPC toplam miktarını almak ve 20,000 hücre hacmi ile bu değeri 10 bölmek için bu mTHPC konsantrasyonu bölün.
  13. X (4/3 x π): Bir kürenin için formülü ile hacmini hesaplayınR3. Mikroskop altında 20 tripsinize edilmiş hücre çapını ölçmek ve bu değeri 2 ile bölünmesiyle elde edilir yarıçapı r.
  14. Son olarak, 10 saat (doza bağlı alımı) saat ya da% 100'e ayarlanmış olan 10 ug / ml mTHPC (zamana bağlı alımı) ile işlem gördükten sonra HOS hücreleri için elde edilenlere tüm değerleri normalize.

2. PS in vitro Fototoksisite Ölçümü

  1. 96 oyuklu bir plaka (mTHPC her bir konsantrasyonu için kopyaların kullanılır) içerisinde 3,000 hücre / oyuk tohum ve gece boyu bağlı sağlar. Benzer şekilde ek bir 96 oyuklu plaka hazırlanması ve aşağıda tarif edildiği gibi hücre tedavisi, ancak daha sonra faz kontrastlı görüntüleme için bir kenara koydu.
    Not: sayı her bir hücre hattı için ayarlanmalıdır. Deneyin zamanında% 50-60 arasında bir confluency idealdir.
    1. MTHPC konsantrasyonlarının her biri için hücrelerin gelen karanlık toksisite denetimi eklemek için unutmayın.se mTHPC seçilmiş konsantrasyonlarının varlığında veya yokluğunda inkübe edilecek hücreler, ancak aydınlatılmış olmayacaktır.
  2. Ertesi gün, hücre çizgileri ile ilgili olarak mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5 ve 10 ug / ml) farklı konsantrasyonları ile inkübe edilir ve hücreleri 5 saat boyunca karanlıkta tutun.
    1. Bölüm 1.3.2 başvurun
      Not: Kuluçka süresi aydınlatma hücre hattı ve kullanılan PS bağlıdır önce, bu nedenle, ayrı deneylerde, farklı konsantrasyonlarda ve farklı zaman noktaları test için tavsiye edilir.
  3. Belirtilen süre için inkübe edildikten sonra, PBS ile iki kez yıkama ve hücreler mTHPC olmadan yeni taze ortam ekleyin.
  4. MTHPC absorpsiyon spektrumu için özel bir 652 nm diyot lazer, (bkz. Şekil 1) ile hücrelerin aydınlatın.
    1. 13.5 cm dista bir yükseklikte, 21.88 mW / cm 2 gücüne lazer ayarlama5 J / cm 2 lik bir enerji dozu elde etmek amacıyla, hücrelerden ım. 230 saniye boyunca hücreleri aydınlatın. (Ve mTHPC olmadan) karanlık toksisite kontrol hücrelerini aydınlatmak etmeyin.
      Not: Her zaman PS uyarma için kullanılan lazer ışıktan gözleri korumak için gözlük.
  5. Aydınlatma sonra, 24 saat boyunca 37 ° C'de karanlıkta hücreleri tutun. Daha sonra, suda çözülebilen tetrazolium (WST-1) reaktif (orta μl/100 10 ul) ekleyin.
  6. Üç saat WST-1 reaktifi ilave edildikten sonra, 415 nm'de, 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğine absorbansı ölçülür.
  7. Hayatta kalan hücrelerin yüzdesini hesaplamak için, (örneğin mTHPC olmadan mTHPC ve nonilluminated olmadan aydınlatılmış)% 100 her bir durum için non mTHPC tedavi edilen hücreler için elde edilen değerlerin ortalaması olarak ayarlayın.

3. Hücre Sayım tarafından Hücre sayısı Tahmini

  1. Tohum 20,000 hücre / biz, 24 oyuklu bir plaka içerisinde ll ve onları bir gece boyunca bağlı sağlar.
  2. MTHPC ile 5 saat (0.001, 0.003, 0.15, 0.6 ve 1.25 ug / ml) için hücreler inkübe edin ve yukarıda tarif edildiği gibi, onları aydınlatır.
  3. Orta toplayın, 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile, bir kez PBS ile yıkayın hücreleri bunları trypsinize ve bunları toplamak.
  4. Santrifüj işleminden sonra, ortam aspire taze ortam ve 200 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  5. Bir Neubauer odası içinde hücreleri sayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bildirilen teknikler ile, insan OS hücrelerinde mTHPC bazlı PDT incelenmiştir. İlk olarak, mTHPC zamana ve doza bağımlı bir alım, düşük metastatik HOS ve yüksek düzeyde metastatik 143B OS hücre hatlarında araştırılmıştır. mTHPC alımı bir floresan spektrofotometre ile mTHPC floresanı (Reidy et al. 11 izni ile yeniden Şekil 2) ölçülmesi ile değerlendirilebilmektedir. Şekil 2A, bir zaman bağlı bir şekilde mTHPC alımını göstermektedir. Hücre süspansiyonunun flores...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PDT cevap olarak uygun bir sitotoksisite elde etmek için, doğru lazer ışığı ayarları ve inkübasyon sürelerini seçmek çok önemlidir. Burada açıklanan işlemler PS alımını belirlemek için in vitro ve in PDT kaynaklı sitotoksisite ölçmek için tutarlı ve etkili. PS mTHPC spesifik soğurma dalga boylarını kullanarak, hücresel alımı PS doğrudan bir şekilde tespit edilebilir ve PS sitotoksik reaktif oksijen türleri oluşturmak için etkinleştirilebilir.

Bu in vitro kurulumu k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını veya çıkar çatışması beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar nazik onların yardım ve teknik uzmanlık için Susanna GRAFE ve Arno Wiehe özel sayesinde, lipozomal mTHPC formülasyonu ile bize sağlamak için biolitec Araştırma GmbH ile (Jena, Almanya) teşekkür etmek istiyorum. Biz de sonuçları büyük bir bölümünü oluşturulan ve yayımı 11 coresponsible oldu Kerstin Reidy, teşekkür etmek istiyorum.

Bu çalışma Schweizerischer Verein Balgrist, Zürih Üniversitesi, Krebsliga Zürih yanı sıra Walter L. ve Johanna Kurt Vakfı, Zürih, İsviçre hibe ve EuroNanoMed ERA-NET / SNF İsviçreli bir hibe ile hibe tarafından desteklenmiştir Ulusal Bilim Vakfı 31NM30-131004/1. Bu çalışma aynı zamanda HSM Kanton Zürih Muskuloskeletal Onkoloji (Yüksek İhtisas Tıp) programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMPAA GmbH, Freiburg, AlmanyaE15-883
HAM F12PAA GmbH, Freiburg, AlmanyaE15-817
Isı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumuGIBCO, Basel, İsviçre10500-064
mTHPCbiolitec Research GmbH, Jena, AlmanyaBu lipozomal formülasyon Ar-Ge'den kaynaklandığı için D
şu anda katalog numarası mevcut değil. Stok: 1.5 mg / ml; 9:1 dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) ve dipalmitoilfosfatidilgliserol (DPPG; %>99 saflık) karışımında sağlanır
Spectramax Gemini XS plaka okuyucuMoleküler Cihazlar, Sunnyvale, CAID# 861
Mikroskop Zeiss Observer.Z1Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Almanya
Ceralas PDT 652 nm Lazerbiolitec AG, Jena, AlmanyaLD652nm2W400u
Suda çözünür tetrazolyum (WST) reaktifiRoche Diagnostics AG, Rotkreuz, İsviçre1644807

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
  2. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
  3. D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
  4. Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
  5. Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
  6. Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
  7. Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
  8. Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
  9. Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
  10. Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
  11. Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
  12. Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
  13. Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).
  14. Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fotosensitiz r Al mWST 1 AnaliziFloresan SpektrofotometrisiLazer I AktivasyonuH cre Canl l AnaliziM T H P C KonsantrasyonuSitotoksik Oksijen Radikallerin Vitro Sitotoksisite

İlgili makaleler