Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Post-lezyonlu Solunum nöroplastisite Eğitim için Servikal Spinal Kord Yaralanması bir fare modeli

13K görüntülenme

DOI:

10.3791/51235

28 Mayıs 2014

Bu makalede

Özet

Solunum yetmezliği servikal omurilik yaralanması sonucu ölüm önde gelen nedenidir. Kısmi servikal yaralanma tarafından uyarılan solunum yetmezliği, tekrarlanabilir ölçülebilir ve güvenilir klinik öncesi hayvan modeli olan müteakip solunum ve non-solunum nöroplastisiteyi anlamak için yardımcı ve varsayılan onarım stratejilerini test sağlayacaktır.

Özet

Servikal spinal kord yaralanması kalıcı felç neden olur, ve genellikle solunum sıkıntısı yol açar. Bugüne kadar, hiçbir verimli terapötiklerin yüksek servikal spinal kord yaralanması (SKY) sonrası solunum yetmezliği iyileştirmek / geliştirmek için geliştirilmiştir. Burada çeşitli lezyon sonrası solunum nöroplastisiteyi çalışma servikal 2 (C2) metamerik düzeyde yüksek SCI bir kemirgen pre-klinik modeli öneriyoruz. Bu teknik nedeniyle beyin bulunan solunum merkezlerinden frenik motor nöronlar bir deaferentasyon üzere diyaframa bir hemipleji neden olacak C2 düzeyinde bir cerrahi kısmi yaralanma oluşur. Yaralanma karşı taraf bozulmadan kalır ve hayvan iyileşme sağlar. (Torakal ve lomber düzeyde) lokomotor fonksiyonunu etkileyen diğer omurilik aksine, solunum fonksiyon hayvan motivasyon gerektirmez ve açığı / kurtarma miktar kolayca (diyafram ve frenik sinir kayıt yapılabilirs, tüm vücut havalandırma). Bu klinik öncesi C2 SCI modeli farklı seviyelerde (fizyoloji, moleküler) çeşitli solunum ve non-solunum nöroplastisite olayları incelemek ve solunum geliştirmek olabilir çeşitli farazi tedavi stratejileri test etmek için güçlü, kullanışlı ve güvenilir klinik öncesi modeli SCI hastalar.

Giriş

Spinal kord travması gibi kalıcı felç gibi dramatik olaylar ile insan nüfusunun gözlenen yaygın bir yaralanma olduğunu. Bununla birlikte, yaralanma şiddetine başlangıç ​​travma seviyesi ile boyutuna bağlıdır. Solunum yetmezliği üst servikal spinal kord yaralanması (SKY) 1 Aşağıdaki mortalitenin önde gelen nedenidir. Şu anda, tek terapötik tedavi ventilasyon yardımı altında hasta yerleştirmektir. Birkaç hastada lezyon sonrası gecikme oluşur spontan iyileşme, solunum yardımı 2 kapalı sütten olabilir bu yana, yenilikçi non-invaziv ilaçlar geliştirebilmek için ihtiyaç acil 3'tür. Farazi tedavi stratejilerinin uygulanmasını incelemek için, bu nedenle solunum yetmezliği üzerinde servikal SCI etkisini araştırmak ve iyi bir standart klinik öncesi modeli olması esastır.

Bu teknik makalede, biz belirli bir klinik öncesi fare modeli o tariff solunum bozukluğu C2 seviyesinde kısmi servikal SCI tarafından uyarılan. Bu model şu anda (: 4-13 değerlendirmeleri için) dünyanın çeşitli laboratuvarlar tarafından kullanılır. Ancak, cerrahi prosedür hafif farklılıklar bu özel servikal yaralanma fare modeli oluşturmak için farklı araştırmacılar arasında görülebilir. Solunum çıkışında C2 SCI etkisi ilk Porter 14 tarafından 1895 yılında tarif edilmiştir. Servikal hemiseksiyona sessiz frenik sinir aktivitesi ve sonraki diyafram felç yol açan, yaralanma aynı taraftaki (beyin sapı, Şekil 1A rVRG bulunan), merkez sürücüden frenik motor nöronlar bir deaferentasyon neden olur. Karşı taraf bozulmadan kalır ve hayvan hayatta kalmak için izin verir. Bir düşük değerli spinal kesimi (C4 düzeyinde 15, örneğin bir çürük hasarı) bulunan farklı SCI farklı olarak, her iki tarafta frenik motonöron çekirdeğin bütünlüğü korunur. Bir červ sonraical C2 yaralanması, bazı spontan aktivite nedeniyle segmental seviyesi C3-C6 (Çapraz Frenik yolları, CPP, Şekil 1B) spinal orta hat geçti taraf sessiz sinaptik yolların bir aktivasyonuna (frenik ve diyafram), ipsilateral tarafta görülebilir . Olan CPP, aktivasyonu, tanımı gereği, bir taraf kısmi frenik sinir kurtarma neden bir kontralateral phrenicotomy ile birlikte bir C2 hemiseksiyona, saat hafta sonrası yaralanma 16-18 oluşabilir. Solunum kurtarma bu CPP yolun gerçek yararlı etkisi 19 sınırlıdır ve daha fazla araştırma ve tedavi spontan restorasyonu 3 büyüklüğünü artırmak için geliştirilmelidir.

Bu protokol (öncesi ve frenik motor nöronlar, internöronlar, moleküler ve cellula solunum fizyolojisi çeşitli düzeylerde solunum lezyon sonrası plastisiteyi incelemek için klinik öncesi fare modelinde güçlü bir türü sağlarr, örneğin, ön bacak) lokomosyon yanı sıra C2 kısmi servikal omurilik yaralanmasının ardından solunum ve lokomotor kurtarma geliştirmek amaçlanmıştır invaziv ve non-invaziv tedavi stratejileri test etmek için bir model.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol Excellence (Paris Sud, hibe sözleşmesi No 246556 Üniversitesi) ve Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines RBUCE-UP sandalyenin Etik komitesi tarafından onaylandı.

Steril Cerrahi Aletler 1. Hazırlanması

  1. Laboratuvar deterjan ile cerrahi aletleri temizleyin.
  2. Ameliyat öncesi araçları otoklavlayın.
  3. Cerrahi bir oturumda, 2 ameliyatları arasında 180 ° C'de 10 dakika boyunca sıcak bir boncuk sterilizatör ipuçlarını yerleştirerek araçları sterilize edin.

İlaçların 2. Hazırlanması

  1. Pre-anestetik ilaçlar kokteyl ve ameliyat sonrası ilaçlar için x 1 2 ml şırınga hazırlayın.
  2. Carprofen (5 mg / kg), Buprenorfin (50 ug / kg), Baytril (5 mg / kg) ve deksmedetomidin (0.5 mg / kg): sıçanın ağırlığına göre, ön anestetik ilaç ile bir şırınga hazırlar. Ringer laktat ile 1 ml hacmi tamamlayın.
  3. Içinde hazırlayınBaşka bir şırınga ön anestetik ilaç için ters: atipamezol (500 ug / kg).

Rat 3. Anestezi

  1. Hayvana, aşama 2.2 'de tanımlanan ön anestetik ilaç solüsyonu subkutan uygulayın. Ardından, kafesine geri hayvan koymak ve yatıştırıcı etkisi görünene kadar bekleyin.
  2. % 100 O 2% 5 izofluran ile dolu kapalı bir bölmeye sıçan yerleştirin ve solunum ritmi (30 sn civarında) yavaşlatır kadar bekleyin. Daha sonra, odasından sıçan kaldırmak ve entübasyon masa üzerine yerleştirin.

4. Orotrakeal entübasyon

  1. Sırtında hayvan yalan, sonra masaya ön dişlerinin bağlı bir kayış koyarak başını sağlamlaştırmak.
  2. Bir fiber optik ışık ile, göğüs boşluğu yanar. Daha sonra, hayvanın ağzına bir larengoskop (ya da bir özel yapılmış, ayrıntılar için Jou ve diğ. 20) yerleştirin. Ses telleri gözünüzde canlandırın.
  3. Kaydırdıe ve (ses tellerinin arasında) trakea içine bir orotrakeal kılavuzunu yerleştirmek. Kılavuzundaki orotrakeal tüp (16 G kateter boyutu) kaydırın.
  4. Kılavuzunu çıkarın ve trakea olup yemek borusu, borunun uygun pozisyon teyit nemin varlığı için orotrakeal tüpün ucuna yerleştirilmiş bir gırtlak ayna ile kontrol edin.
  5. (683 kemirgen ventilatör, Harvard Apparatus) bir kemirgen ventilatöre tüp bağlayın ve (% 100 O 2)% 2 izofluran konsantrasyonu ayarlayın.
  6. Cerrahi bant ile orotrakeal tüp sabitleyin.

5.. Spinal Cerrahi

  1. Cerraha 90 ° açıyla işaret burun ile, ısıtılmış bir cerrahi tabakta ventral dekübit pozisyonda hayvan yerleştirin. Ameliyat boyunca 37.5 ° C civarında vücut ısısını korumak.
  2. Skapulalarda arasındaki makası ile saç tıraş ve gazlı bez ile saç kaldırmak.
  3. Sonra 7 ile, betadin ile cildi temizleyin% 0 alkol. Bu adım 3x tekrarlayın.
  4. Bir ayak tutam Uygun anestezi derinliği sağlamak için cerrahi başlamadan önce yapılır.   Ardından, skapulalarda arasındaki makas ile yanal cilt kesisi rostro-Kaudale gerçekleştirin.
  5. Kanamayı önlemek için herhangi bir tendonun izleyerek acromiotrapezius kas rostro-kaudal kesin. Sonra (omur çevreleyen) spinalisteki kasları erişmek için romboid kas ayrışır.
  6. C3 vertebra C1 spinalisteki kas geri çekin. C2 vertebra önemli bir apofizlidir ile biridir.
  7. Steril pamuklu kullanarak vertebra dorsal parçası etrafında kas temizleyin.
  8. Bir rongeur dikkatlice C2 apofizle kaldırmak başlar. Dorsal spinal kord maruz kadar sonra, titizlikle devam ediyor. Bu laminektomi dorsal hemi laminektomi olduğundan emin olun. Bu alanın çevresinde omurilik ve arterleri kapsayan dura dikkat edin.
  9. Bir # 55 forseps ile, ros teşrihtro-caudally C2 boyunca dura, sonraki her rostral ve kaudal tarafında yanal devam ediyor.
  10. Beyin omurilik sıvısı süngerle.
  11. Microscissors servikal dorsal kök sayısının 2 altında bir yan bölüm yapmak. Lezyonun ölçüde omurilik (yaralanma dorsal görünümü için Şekil 2A bakınız) orta hat ulaşacak kadar yakın olduğunu bir mikro neşter ile doğrulayın. Eğer değilse, o zaman başka bir kesim yaralanma tamamlamak için yapılabilir. Kanama halinde steril pamuklu kullanın. Aksi takdirde, hayvan yaralanma kurtarmak olmayacak ve solunum yetmezliği olacak, karşı tarafa gitmek için dikkatli olun.
  12. Koruyucu bir tabaka olarak kasları dikin ve cilt geri dikin. Betadin doymuş steril gazlı bez ile yarayı temizleyin.
  13. Izofluran buharlaştırıcı-kapatın ve ters ilaç enjekte (atipamezol [500 mg / kg, im]), vücut sıcaklığını kontrol edin.
  14. Hayvan ventilatöre karşı nefes başladığında,ventilatörden trakeal tüp ayırın, sonra orotrakeal tüpü çıkarın. Geri kazanımı için ısıtılmış bir kafeste hayvan yerleştirin.

6. Post-cerrahi bakım

Ameliyatın ardından, hayvanlar kurtarma için mümkün olan en iyi ortamı sağlamak için sürekli olarak izlenir. Antibiyotik (Baytril, 5 mg / kg), anti-enflamatuar (Carprofen, 5 mg / kg 'ı) ve buprenorfinin (50 ug / kg) ilaç enfeksiyonları önlemek ve oluşumunu azaltmak için ilk 2 gün ameliyat sonrası için her 12 saat verilmektedir post-operatif ağrı. Sıçanlar yumuşak yiyecek ve su (ya da 1 ameliyat sonrası gün için jelleştirilmiş su) erişim ad libitum sahiptir. Deri altına sıvılar ilk birkaç ameliyat sonrası günlerde kaybını önlemek için de kullanılabilir. Vücut ağırlığı ve gıda alımı, günlük olarak izlenmektedir. Onların ortamı deney ve zaman travma sonrası (kafeslerine ikili konut, boru) boyunca zenginleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yaralanma Kapsamı

Başarı ve bu özel deneysel modelin uyarlık her manipülatör / cerrahın deneyimine bağlıdır. Kalan ventrolateral beyaz madde 21 bağışladı ile bir C2 yaralanma takiben solunum kurtarma (frenik sinir aktivitesi ve diyafram aktivite) sonraki miktarı ilişkilidir. Yaralanma "el yapımı" olduğu ve cerrah bazı pratik gerektirir yana, her yaralanma ölçüde tam boyutunu belirlemek için histolojik teknikler (paraformaldehitle dokusunun% 4, dondurulmu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

C2 Yaralanma Modeli Yapımı Teknik Sorunlar

C2 yaralanma fare modeli solunum lezyon sonrası nöroplastisiteyi incelemek için ilginç bir araçtır. Ancak, tekrar üretilebilir ve güvenilir bir modeli üretmek için gerekli adımlar çok sayıda ve her biri çalışmanın sonuçları etkileyebilecek. Örneğin, entübasyon işlemi sırasında, aşırı bakım orotrakeal tüp gibi yaralanma nedeniyle kendisine başlangıç ​​solunum yetersizliği yanında obstrüktif solunum yetmezliği gibi çeşitli komplikasyo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma hibe sözleşmesi No 246556 (Avrupa projesi RBUCE-UP) kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) fon tarafından desteklenen, HandiMedEx Fransız Kamu Yatırım Kurulu tarafından tahsis. Marcel Bonay Chancellerie des Üniversiteler de Paris (Bacaklar Poix), Sante Respiratoire tr Fonds de Dotation Recherche ve Centre d'Yardımlaşma Respiratoire bir ikametgah d'Île de France (Cardif) tarafından desteklenen

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Animal
Erkek Sprague Dawley SıçanJanvier225-250 g
Cerrahi Aletler
Student Dumont #5 forsepsGüzel Bilimler Aracı91150-20
Öğrenci Standart Desen ForsepsGüzel Bilim Aracı91100-12
Mayo-Stille MakasGüzel Bilim Aleti14013-15Kavisli
Öğrenci Vannas Yaylı MakasGüzel Bilim Aleti91500-09Düz
Yaylı Makas - 8 mm Bıçaklıİnce Bilim Aleti15025-10Düz Künt/Künt
Friedman Pearson RongeurGüzel Bilim Aleti16121-14Kavisli
Diseksiyon Bıçağı - İnce UçluGüzel Bilim Aleti10055-12Düz
Olsen-Hegar İğne TutucuGüzel Bilim Aracı12002-14Tırtıklı
Weitlaner-Locktite EkartörGüzel Bilim Aracı17012-112x3 Künt
Emilebilir cerrahi sütürlerCentravetBYO001Sütür boyutu 4-0
Equipment
Sıcak Boncuk SterilizatörüGüzel Bilim Alet18000-45
Kateter CentravetCAT188 16G
Laringoskop
Kılavuz tel
Gırtlak aynaCentravetMIR011
Emzirilmiş ZillerCentravetRIN020
ŞırıngaCentravet
İğneCentravet
O2Hava SıvıI1001M20R2A001
683 RodentT Vantilatör 115/230VHarvard Aparatı55-0000
Bağımsız BuharlaştırıcıWPIEZ-155
İnce çizgi ısıtmalı yatakWPIEZ-211
Hava kabıWPIEZ-258
Drugs
CarprofenCentravet
RimadylCentravetRIM011
BuprenorfinCentravetBUP001
BaytrilCentravetBAY001
DeksmedetomidinCentravetDEX010
AtipamezolCentravetANT201
Betadine çözeltisiCentravetVET002
İzofluranCentravetVET066

Kaynaklar

  1. Frankel, H. L., et al. Long-term survival in spinal cord injury: a fifty year investigation. Spinal Cord. 36, 266-274 (1998).
  2. Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research - a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38, 449-472 (2000).
  3. Zimmer, M. B., Nantwi, K., Goshgarian, H. G. Effect of spinal cord injury on the respiratory system: basic research and current clinical treatment options. J Spinal Cord Med. 30, 319-330 (2007).
  4. Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Neuromuscular adaptations to respiratory muscle inactivity. Respir Physiol Neurobiol. 169, 133-140 (2009).
  5. Goshgarian, H. G. The crossed phrenic phenomenon and recovery of function following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 85-93 (2009).
  6. Nantwi, K. D. Recovery of respiratory activity after C2 hemisection (C2HS): involvement of adenosinergic mechanisms. Respir Physiol Neurobiol. 169, 102-114 (2009).
  7. Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
  8. Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D., Reier, P. J. Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 123-132 (2009).
  9. Seeds, N. W., Akison, L., Minor, K. Role of plasminogen activator in spinal cord remodeling after spinal cord injury. Respir Physiol Neurobiol. 169, 141-149 (2009).
  10. Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
  11. Vinit, S. Cervical spinal cord injuries and respiratory insufficiency: a revolutionary treatment. Med Sci (Paris. 28, 33-36 (2012).
  12. Kastner, A., Gauthier, P. Are rodents an appropriate pre-clinical model for treating spinal cord injury? Examples from the respiratory system). Exp Neurol. 213, 249-256 (2008).
  13. Vinit, S., Lovett-Barr, M. R., Mitchell, G. S. Intermittent hypoxia induces functional recovery following cervical spinal injury. Physiol Neurobiol. 169, 210-217 (2009).
  14. Porter, W. T. The Path of the Respiratory Impulse from the Bulb to the Phrenic Nuclei. J Physiol. 17, 455-485 Forthcoming.
  15. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
  16. Goshgarian, H. G. The crossed phrenic phenomenon: a model for plasticity in the respiratory pathways following spinal cord injury. J Appl Physiol. 94, 795-810 (2003).
  17. Vinit, S., Gauthier, P., Stamegna, J. C., Kastner, A. High cervical lateral spinal cord injury results in long-term ipsilateral hemidiaphragm paralysis. J Neurotrauma. 23, 1137-1146 (2006).
  18. Fuller, D. D., Johnson, S. M., Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Chronic cervical spinal sensory denervation reveals ineffective spinal pathways to phrenic motoneurons in the rat. Neurosci Lett. 323, 25-28 (2002).
  19. Dougherty, B. J., Lee, K. Z., Lane, M. A., Reier, P. J., Fuller, D. D. Contribution of the spontaneous crossed-phrenic phenomenon to inspiratory tidal volume in spontaneously breathing rats. J Appl Physiol. 112, 96-105 (2012).
  20. Jou, I. M., et al. Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge. J Appl Physiol. 89, 1766-1770 (2000).
  21. Fuller, D. D., et al. Graded unilateral cervical spinal cord injury and respiratory motor recovery. Respir Physiol Neurobiol. 165, 245-253 (2009).
  22. Vinit, S., Windelborn, J. A., Mitchell, G. S. Lipopolysaccharide attenuates phrenic long-term facilitation following acute intermittent hypoxia. Respir Physiol Neurobiol. 176, 130-135 (2011).
  23. Ahmad, F., Wang, M. Y., Levi, A. D. Hypothermia for Acute Spinal Cord Injury-A Review. World Neurosurg. , (2013).
  24. Lovett-Barr, M. R., et al. Repetitive intermittent hypoxia induces respiratory and somatic motor recovery after chronic cervical spinal injury. J Neurosci. 32, 3591-3600 (2012).
  25. Minor, K. H., Akison, L. K., Goshgarian, H. G., Seeds, N. W. Spinal cord injury-induced plasticity in the mouse--the crossed phrenic phenomenon. Exp Neurol. 200, 486-495 (2006).
  26. Baussart, B., Stamegna, J. C., Polentes, J., Tadie, M., Gauthier, P. A new model of upper cervical spinal contusion inducing a persistent unilateral diaphragmatic deficit in the adult rat. Neurobiol Dis. 22, 562-574 (2006).
  27. Golder, F. J., et al. Breathing patterns after mid-cervical spinal contusion in rats. Exp Neurol. 231, 97-103 (2011).
  28. Lane, M. A., et al. Respiratory function following bilateral mid-cervical contusion injury in the adult rat. Exp Neurol. 235, 197-210 (2012).
  29. Vinit, S., et al. Axotomized bulbospinal neurons express c-Jun after cervical spinal cord injury. Neuroreport. 16, 1535-1539 (2005).
  30. Guenther, C. H., Windelborn, J. A., Tubon, T. C., Yin, J. C., Mitchell, G. S. Increased atypical PKC expression and activity in the phrenic motor nucleus following cervical spinal injury. Exp Neurol. 234, 513-520 (2012).
  31. Mantilla, C. B., Gransee, H. M., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Motoneuron BDNF/TrkB signaling enhances functional recovery after cervical spinal cord injury. Exp Neurol. 247, 101-109 (2013).
  32. Vinit, S., Darlot, F., Aoulaiche, H., Boulenguez, P., Kastner, A. Distinct expression of c-Jun and HSP27 in axotomized and spared bulbospinal neurons after cervical spinal cord injury. J Mol Neurosci. 45, 119-133 (2011).
  33. Windelborn, J. A., Mitchell, G. S. Glial activation in the spinal ventral horn caudal to cervical injury. Respir Physiol Neurobiol. 180, 61-68 (2012).
  34. Vinit, S., Stamegna, J. C., Boulenguez, P., Gauthier, P., Kastner, A. Restorative respiratory pathways after partial cervical spinal cord injury: role of ipsilateral phrenic afferents. Eur J Neurosci. 25, 3551-3560 (2007).
  35. Dougherty, B. J., et al. Recovery of inspiratory intercostal muscle activity following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 183, 186-192 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Frenik Sinir AktivitesiDiyafram HemiparalizisiC2 Vertebra YaralanmasCerrahi HemilaminektomiKemirgen Ventilat r Kullan mHistolojik TekniklerSinir Kas Kay tlarapraz Frenik Yolak