Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An Ex Vivo Yaklaşım

Endositik ticareti bütün zar proteinlerinin çeşitli plazma zarı tanıtımı ince ayar her yerde bulunan bir hücresel mekanizmadır. Endositozdan sonra hücre içi ortamı ¹ için çok önemlidir besin sağlar ve reseptör aktivasyonu ² tepki olarak reseptör sinyallemesini desensitizes. Geri plazma zarına dönüşüm endositik ek olarak hücre yüzeyinde de ³ protein ekspresyon seviyelerini arttırarak hücre sinyali artırabilir. Ayrıca, membran kaçakçılığı tedirginlikler protein endositik ticaretini yöneten moleküler mekanizmalarının araştırılması gerektiğini vurgulayarak, çok sayıda hastalık ve patolojik koşullarda ^4,5 sorumlu tutulmaktadır. Çok protein, son birkaç yıl içinde kanıt montaj klasik klatrin bağımlı içselleştirme mekanizmaları kullanmak da çok klatrin bağımsız endositik mekanizmalar giderek artan bir dizi potansiyel endositik yöneten gösteriyorproteinler ^6,7. Böylece, fizyolojik, ilgili sistemlerin ticareti kolaylaştırıcı endositik mekanizmaları araştırmak için ihtiyacı önemli ölçüde büyüdü.

Beyinde, reseptörler, iyon kanalları ve nörotransmitter nakliyecilerin endositik kaçakçılığı sinaptik plastisite ^8-11 ve sonuçta nöronal heyecanlanabilirliğini ve sinaptik yanıtları etkileyen kötüye ^12-15 ilaçlara yanıt kurulmasında başlıca role sahiptir. Nöronal kaçakçılığı çalışmaların çoğunluğu heterolog ekspresyon sistemleri veya kültür birincil nöronlar ya güveniyor Bugüne kadar, ikisi de güvenilir bir yetişkin nöronların oynayan mekanizmaları yansıtıyor olabilir. Burada, sayısal olarak yetişkin kemirgenlerden türetilen akut beyin dilimleri yüzey proteini seviyelerini ölçmek için yüzey biyotinilasyonunu kullanan bir yaklaşım sunulmuştur. Bu yaklaşımı kullanarak, fare striatal dopamin taşıyıcısı hızla re içselleştirilmesini göstermek veri mevcutforbol ester-kaynaklı protein kinaz C (PKC) aktivasyonu için tepkisi uyarma.

Tüm hayvan taşıma ve doku hasat onaylanan protokol # A1506 (Melikian, PI) ardından, Massachusetts Medical School Kurumsal Hayvan Bakım Kullanım Komitesi Üniversitesi (IACUC) esaslarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Gerekli çözümleri

Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) - günlük taze olun

125 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 1.2 mM NaH ₂ PO _4, 1.2 mM _MgCl2, 2.4 mM _CaCl2, 26 mM NaHCO _3, ve 11 mM glükoz

Not: 10x stok solüsyonu olarak ACSF hazırlayın, NaHCO ₃ ve glikoz hariç. Taze NaHCO ₃ ve glukoz ile tamamlayan, 10x stok günlük 1x çalışan çözümler olun.

Sükroz takviye ACSF (SACSF) - günlük taze olun

250 mM suc, 2.5 mM KCI, 1.2 mM NaH ₂ PO _4, 1.2 mM _MgCl2, 2.4 mM _CaCl2, 26 mM NaHCO ₃ ve 11, mM glukoz gül

Not: 10x stok solüsyonu olarak SACSF hazırlayın, NaHCO ₃ ve glikoz hariç. Taze NaHCO ₃ ve glukoz ile tamamlayan, 10x stok günlük 1x çalışan çözümler olun.

Sülfo-N-hidroksisukkinil-SS-Biotin (sülfo-NHS-SS-biyotin, Pierce Chemical Company)

Stok çözeltileri, DMSO içinde 200 mg / ml olabilir ve birden fazla donma / erime döngüsüne karşı dayanıklı olan gerekir. Alikotlar -20 ° C'de saklanır Sukkinil ester hızla sulu çözelti içinde hidrolize edilir, böylece çalışma çözeltiler önce dilimlerine uygulamadan hemen hazırlanmalıdır.

Dilim Quench Çözüm

ACSF 100 mM glisin ile desteklenmiş

RIPA Liziz Buffer

10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA,% 1 Triton-X-100,% 0.1 SDS,% 1 Na deoksikolat

Proteaz inhibitörleri ile RIPA (RIPA / PI) - günlük taze olun

RIPA 1 uM löpeptin, 1 uM pepstatin, 1 uM aprotinin ve 1 mM fenilmetil sülfonil fluorür ile takviye edilmiştir.

1.. Beyin Dilimleri hazırlayın

1. Taze 1x SACSF ve 1x ACSF olun
2. Küçük bir beher buz üzerinde SACSF Chill. Bu durum, taze hasat edilmiş fare beyin tutmak için kullanılacaktır.
3. % 95 /% 5 O ₂ / CO _2, buz üzerinde 20 dakika ile köpüren tarafından oksijen ile ACSF ve SACSF doyurun.
4. P30-38 farenin en uygun doku yaşam için kullanılmalıdır. Servikal dislokasyon ve başları kesilerek hayvanların Kurban ve hızla önceden soğutulmuş, oksijenli SACSF içine beyinleri kaldırın.
5. Bir titreşimli mikrotom kullanılarak, ilgi bölgesinde 300 mikron beyin bölümleri yapmak.
6. Eğer istenirse, dilimleri başka özel beyin bölgeleri veya ayrı sağa sırasıyla, kontrol ve deney dilimleri olarak kullanmak için sol hemisfer zenginleştirmek için önce toparlanmaya disseke edilebilir.
7. Bir ateş cilalı Pastör pipeti kullanarak, 24-yuvalı plakalar içine yerleştirilmiş odaları tabanlı bir örgü dilimleri aktarın.
8. Dilimleri sürekli, yumuşak kabarcıklarla, oksijenli ACSF, 40 dakika boyunca 31 ° C geri izin verin.

2. İlaç Tedavisi (uygunsa) ve Dilim Biyotinilasyonu

1. Düzelmesinin ardından, önceden ısıtılmış (37 ° C), oksijenli ACSF köpüren sürekli% 95 /% 5 O ₂ / CO ₂ dilim yıkayın 3x.
2. Test bileşikleri ekleyin ve sürekli oksijenasyonu ile kuluçkaya yatmaktadır.
   1. Kolaylık sağlamak için, 10x konsantre ilacın 1/10 ^th ses eklemek, ve hafifçe ters çevirerek karıştırın.
   2. Yavaşça istenen sıcaklıkta bir su banyosu içinde plakalar çalkalayın.
3. Ardından ilaç tedavisi, hızlabuz soğuk ACSF 3x yıkayarak soğuk dilimleri.

3. Biotinylate Yüzey Proteinleri

1. Hemen önce etiketlenmesi için buz gibi soğuk ACSF hazırlanması 1.0 mg / ml sülfo-NHS-biyotin-SS.
2. Dilimlerine sülfo-NHS-SS-biotin 0.75 ml ekleyin ve buz, 45 dakika dilimleri kuluçkaya yatmaktadır.
3. Buz üzerinde buz soğuk ACSF 10 dakika boyunca inkübe edilir, daha sonra buz soğukluğunda ACSF ile hızlı bir şekilde dilimleri üç kez yıkayın.
4. Buz dilim söndürme tamponu ile dilimleri üç kez yıkayın ve ücretsiz sülfo-NHS-SS-biotin gidermek için 0.75 ml dilim söndürme tamponu ile buz üzerinde iki kez, 25 dakika, kuluçkaya yatmaktadır.

4. Doku hazırlanması lizatları

1. Buz soğuk ACSF dilimleri üç kez yıkayın ve bir yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak bir mikro tüp her dilim aktarmak.
2. Yavaşça 200 xg, 1 dakika ve dikkatle aspire kalan ACSF santrifüj edilerek pelet dilim.
3. 400 ul buz gibi soğuk RIPA / PI ekleyin ve yukarı pipetleme dokusu kırmak ve aşağı bir kez P200 pip aracılığıylaette.
4. Aktarım, yeni bir tüpe dilim / RIPA liziz ayrılmış ve tamamlamak için, döndürme, 30 dak, 4 ° C inkübe edin.
5. Santrifüj ile hücre yıkıntıları pelet haline, 18,000 xg, 15 dakika, 4 ° C
6. , Bir standart olarak sığır serum albümini (BSA) ile BCA protein deneyi kullanılarak lisatı, protein konsantrasyonları belirler.

5. Biyotinilat Proteinler izole

1. Boncuk / total protein oranını optimize.
   Not: Bireysel protein ekspresyon düzeyleri farklı beyin bölgeleri arasında yaygın olarak değişebilir. Doku lisat belirli bir miktarda biyotinile protein her yakalanır sürece, doğru bir yüzeyi ifade herhangi bir potansiyel değişiklikleri tespit etmek mümkün değildir. Bu nedenle, ampirik önce yeni bir dilim biotinilasyon çalışmaya girişmeden belirli bir protein / beyin bölge için en uygun boncuk / total protein oranını tespit etmek zorunludur.
   1. Artan miktar 25 ul streptavidin agaroz boncuklar inkübe, yıkama ve elüsyon adımları bağlanma için, aşağıda tarif edildiği gibi doku lisatı (yaklaşık 25-200 ug) ve bir s devam edin.
   2. Ortaya çıkan immünoreaktif bantlar sayısal olarak ve artan ya da protein ya da azalmış yüzey ifadesi de doğru olarak izin verecek bağlayıcı doğrusal aralığı içinde bir boncuk / lizat oranını seçmek.
2. Streptavidin-agaroz taneleri hazırlanması
   1. Bütün numuneler için gerekli toplam boncuk hacim belirler. 25 ul / numune = 100 ul boncuk + ekstra = 125 ul boncuk bir miktarı için yeterli bir boncuk hacmi artı bir ilave (yani 4 örnekleri hazırlayın.
   2. Vortex Streptavidin boncuk stok ve pipet dışarı hacmi istenen. P200 pipet kullanarak ederse, tıkanıklık veya boncuk zarar görmesini önlemek için ucu ucuna kesti.
   3. Oda bir öfke, 18.000 xg, 1 dakika santrifüj edilerek koruyucu, her RIPA eklenmesinden sonra vorteks ve yıkamalar arasında toplama boncuk kaldırmak için 0.5-1.0 ml RIPA / PI boncuk 3 kere yıkayınfaktöörlere.
   4. Bir vakum şişeye bağlı bir cam Pasteur pipet kullanılarak yıkamalar arasında tampon aspire. Aspire cam Pasteur pipet ucuna takılı plastik P200 ucu ince kontrol sağlar. Bu pipet içine aspirasyon boncuk risk gibi, ilk iki yıkama için kesinlikle bütün tampon kaldırmak için gerekli değildir. Son yıkamadan sonra, boncuklar aspire olmadan mümkün olduğu kadar fazla tamponunu çıkarın.
   5. Ve tekrar süspansiyon aşağı yukarı pipetleme, geri orijinal hacmi boncuk getirmek RIPA / PI ekleyin. Boncuklar boru duvarına sopa gibi, bu noktada vorteks kaçının.
   6. Ucu ile bir P200 kullanarak mikrosantrifüj tüpler içine kısım boncuk kesti. Boncuk eşit askıya ve tüpler arasında dağınık kalmasını sağlamak için aşağı örnekleme arasında birkaç kez yukarı pipet ve.
3. Streptavidin boncuk Bağlama biyotinile edilmiş proteinler
   1. Agaroz boncuklar içeren tüplere hücre lizatları dağıtın. Deneyleri için whe Birden çok numune karşılaştırılan yeniden doğru karşılaştırmalar için, her numune için protein aynı miktarda kullanmak için emin olun.
   2. 200 ul minimum hacme örnekleri getirmek ilave RIPA / PI ekleyin. Bu örnekler inkübasyon sırasında yeterince karıştırmak ve aynı zamanda örnekleri arasında, protein konsantrasyonları birleştiren garanti eder.
   3. Bir boru rotator tüpler koyun ve 4 ° C'de gece boyunca karıştırın
   4. Ayrı tüpler içinde, her bir numune için kullanılan toplam lizat hacmi bir eşdeğerine dağıtmak. Numune hacimleri yüksek, alternatif olarak, toplam lizat hacmi bir kısmı SDS-PAGE jelleri üzerinde maksimum yük birimleri yerleştirmek için, bunun yerine ayrılmış olabilir. Bunlar toplam protein miktarı yüzey ekspresyonunu normalize etmek için kullanılacaktır.
   5. Eşit 2X hacim veya 6x, SDS-PAGE örnek tamponu içinde 1/5 hacim ve ya örnekleri analiz edilinceye kadar -20 ° C'de boncuk numuneleri ya da mağaza paralel olarak, 4 ° C de inkübe ya ekleyin.

1. Oda sıcaklığında, 18,000 xg, 2 dakika santrifüjleme ile boncuk Pelet.
2. Aspire yüzenler ve yıkama boncuk 0.75 ml RIPA'da ile üç kez. Boncuk kaybını en aza indirmek için, yıkamalar arasında boncuk yukarıdaki tampon küçük bir baş hacmini bırakın. Son yıkamadan sonra, boncuk pelet bozmadan, mümkün olduğunca RIPA çıkarın.
3. Disülfid bağı azaltarak streptavidin biyotinile edilmiş proteinler boncuklardan Zehir. Örnek tampon, vorteks de azaltarak 25 ul 2x SDS-PAGE ekleyin ve numuneleri 30 dakika, oda sıcaklığını döndürün.
   Not: Birçok zar proteinleri ciddi şekilde zarar elektroforetik hareketlilik, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde kaynatılmış zaman toplamak için bir yüksek eğilimi vardır. Bu araştırılmaktadır protein için durum ise, ısıtma örnekleri engellemek ve bunun yerine, oda sıcaklığında yavaşça elute. Kaynar (paralel değerlendirilen bir başka protein kaynamasını gerektiriyorsa örneğin) kesinlikle gerekli ise, SAMPLe tampon toplanmasını en aza indirmek için 2 M üre (nihai konsantrasyon) ile takviye edilebilir. Bazı durumlarda toplama azaltılmasında etkili olsa da, üre genellikle grup görünüşe uzlaşma.
4. Immunoblot'da örnekleri analiz.
5. Toplam lizat örnekleri çözülme ve boncuk numuneleri, 30 dakika, oda sıcaklığı ile paralel olarak döner.
6. SDS-PAGE jelleri üzerinde ayrı proteinler.
7. Immünolojik işaretleme ile ilgilenilen protein (ler) belirlenmesi.
   1. Bantları uygun miktar tespiti için lineer aralığında tespit emin olun.
   2. Biyotinilasyon reaktif hasarlı / tehlikeye hücreler yoluyla hücre içi proteinlerin erişim elde olmadığını temin etmek. Bu en iyi araştırılan hücre tipine özel bir hücre içi protein için paralel olarak immünolojik işaretleme ile gerçekleştirilir.
   3. Bant yoğunluğu ölçmek, toplam protein ekspresyon seviyesinin bir yüzdesi olarak görece protein yüzey yoğunluğunu hesaplamak.

Nöronal dopamin taşıyıcı hücre hatları 16-20 PKC aktivasyonuna karşılık olarak yerleştirilebilir. Hücre dizileri ve ifade sistemlerinin çeşitli kaynaklı PKC DAT yüzey kayıp gösteren çok sayıda raporlara rağmen, bu kültüre, dopaminerjik nöronların 21-23, bu bulguyu teyit etmek zor olmuştur. Biz doğrudan DAT yetişkin dopaminerjik nöronlarda PKC aktivasyonuna karşılık olarak içselleştiren olup olmadığını test etmek için fare striatal dilimleri kullanılır. Dilim hazırlandıktan sonra, dilimler aynı düzlemde olan orta hatta ve dilimler boyunca hemisected 37 ° C'de, 30 dakika boyunca 1 uM forbol miristat 13-asetat (PMA) ± tedavi edildi Dilimler hızla soğutulmuş ve yüzey proteini, biyotinile edilmiş ve Protokol tarif edildiği gibi izole edilmiştir. Muafiyet benekleri DAT için sondalandı ve aynı zamanda tirosin hidroksilaz (TH) için olan, paralel olarak, biyotinilasyon reaktif dopaminerjik nöronların herhangi bir hücre içi erişim elde olmadığını ölçmek için. Görüldüğü gibiŞekil 1 (en iyi), biz hücre yüzeyinde toplam DAT 81.4 ±% 5.8 ile, bazal (araçla tedavi edilmiş) koşullar altında fare striatumunda sağlam DAT yüzey ekspresyonunu tespit edildi. 1 uM PMA, 30 dakika, 37 ° C ile PKC aktivasyonu önemli ölçüde plazma zarından DAT% 30 kayıp ~ karşılık 60,8 ± 5,2%, toplam DAT, DAT yüzey ekspresyonunu azalmıştır. Aksine, toplam TH sadece 1.6 ±% 0.4, hücre içi lokalizasyonu ve biyotinilasyon reaktif dopaminerjik nöronların hücre içi dışında olduğunu teyit ile tutarlıdır (Şekil 1, alt), biyotinile edildi.

Şekil 1. Akut PKC aktivasyonu yetişkin striatal nöronlar, dopamin taşıyıcı yüzey düzeylerini azaltır. Fare Striatal Dilim Biotinylation. Akut fare striatal dilim Protokolü de tarif edildiği gibi hazırlandı ve ± 1 uM PMA, 30 dak, 37 ° C'yi tedavi edildi Yüzey proteinleri, kovalent olarak biyotin ile birleştiirlebilir ve toplu streptavidin kromatografi ile izole edilmiştir. Örnekler, anti-sıçan DAT ve fare anti-TH antikorları ile SDS-PAGE ve immunoblotting uygulandı. Reaktif bantlar nonsaturating gruplardan bir VersaDoc CCD kamera görüntüleme istasyonu ve yoğunlukları ile yakalanan Miktar Bir yazılımı kullanılarak ölçüldü. Top: belirtilen tedavilerin aşağıdaki biyotinilatlı ve toplam DAT ve TH görüntüleme Temsilcisi immünoblot. Bottom: Ortalama veri. Biyotinilat protein sinyal% toplam kontrolden önemli derecede farklı SEM * ± protein, Student t testi, p <0.03, n = 6 olarak ifade edilir.

Yazarlar finansal ilgilendiriyor bu çalışma ile bu çatışma var.