Yöntem makalesi

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

DOI:

10.3791/51306

⸱

3 Kasım 2014

 ,  , 
1Integrated Department of Immunology and Integrated Center for Genes, Environment, and Health, National Jewish Health and University of Colorado School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, Amaxa Nucleofector 96 kuyulu Mekik Sistemini kullanarak murin makrofaj hücre hatlarını siRNA'larla verimli bir şekilde transfekte etmek, makrofajları lipopolisakkarit ile uyarmak ve inflamatuar sitokin üretimi üzerindeki etkileri izlemek için yöntemler açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar anahtar fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir. Makrofajlar bir patojenle karşılaştıklarında, patojeni öldürmek için antimikrobiyal proteinler ve bileşikler üretirler, diğer bağışıklık hücrelerini işe almak ve uyarmak için çeşitli sitokinler ve kemokinler üretirler ve adaptif bağışıklık tepkisini uyarmak için antijenler sunarlar. Bu nedenle, RNA-interferans (RNAi) gibi tekniklerle makrofajları verimli bir şekilde manipüle edebilmek, bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücresini araştırma yeteneğimiz için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, makrofajların transfekte edilmesi teknik olarak zor olabilir ve verimsiz RNAi kaynaklı gen yıkımı sergileyebilir. Bu protokolde, Amaxa Nükleofektör 96 oyuklu Mekik Sistemini kullanarak iki fare makrofaj hücre hattını (RAW264.7 ve J774A.1) siRNA ile verimli bir şekilde transfekte etmek için yöntemleri açıklıyoruz ve siRNA'nın gen yıkımı üzerindeki etkisini en üst düzeye çıkarmak için prosedürleri açıklıyoruz. Ayrıca, açıklanan yöntemler 96 kuyulu formatta çalışacak şekilde uyarlanarak orta ve yüksek verimli çalışmalara olanak tanır. Bu yaklaşımın faydasını göstermek için, lipopolisakkarit (LPS) ile indüklenen sitokin üretimini düzenleyen genleri inhibe etmek için RNAi'yi kullanan deneyleri açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, biz siRNA'ları kullanarak fare makrofaj hücre hatlarında genleri inhibe ve doğal immün yanıt üzerindeki bu tedavilerin etkilerinin izlenmesi için etkin yöntemler açıklanmaktadır. Bu prosedürler, orta ya da yüksek verimli bir şekilde RNAi ekranlar için izin veren, 96-kuyu formatında gerçekleştirildi.

Enfeksiyona yanıt olarak, insanlar hemen doğuştan gelen bağışıklık tepkisini daha yavaş olan ancak daha özel bir uyum sağlayıcı bağışıklık tepkisi. Bu hızlı doğal immün yanıt makrofajlar 1 olmak üzere fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri toplanmasını ve aktivasyonunu içerir. Klasik olarak aktif makrofajlar,....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofaj Hücre Hatları 1. Bakım

  1. RAW264.7 Büyüme ve DMEM içinde J774A.1 hücre hatları,% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. , Kısırlık korumaya yardımcı (bu kesinlikle gerekli olmasa da) medyaya% 1 penisilin / streptomisin (pen / strep) ekleyin.
  2. Kritik adım: makrofajlar verimli nakil ve siRNA kaynaklı gen demonte için sağlıklı bir durumda büyüyen emin olun. Bu makrofaj soylarında altında en iyi transfeksiyon verimi sergiler ve bu aşamada sağlam post-transfeksiyon yaşamının devam taze, çözüldükten sonra geçitler 3 ve 10 arasında hücreleri kullanmak; de büyük ölçüde azalır d....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yaklaşımı kullanarak transfeksiyon etkinliğini göstermek için, bir akış sitometresi (Şekil 1) kullanılarak, FITC-işaretli siRNA'nın alımını izlenir.

Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı izlemek için bir yaklaşım kullanışlılığını tasvir etmek için, biz, RAW264.7 makrofaj hücre hattı bilinen doğuştan gelen bağışıklık düzenleyici genler hedef siRNA'lar transfekte LPS ile stimüle edilen hücreler, daha sonra pro-enflamatuar sitokinlerin üretimini takip IL 6 ve TNFa. TLR3 <.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok sayıda çalışma, burada tek tek genler sıçangil makrofaj siRNA tarafından hedef alınmıştır yayınlanmıştır. Lipit aracılı transfeksiyon bireysel olarak makrofaj hücre hatlarına siRNA teslim etmek için kullanılmış olsa da, bu yöntemler, bir genden genine canlılığı, sınırlı gen demonte ve değişkenlik olası etkileri muzdarip. Orta veya yüksek verimli bir şekilde genlerin hedeflenmesi için kullanılabilecek daha sert tahlilleri geliştirmek için, gen demonte içinde daha fazla kıvam ve yaşamlarını sürdürmeleri üzerindeki etk.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim. Bu makale Lonza'nın, Inc. tarafından sponsor oldu

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazmasında açıklanan tekniklerden bazılarını optimize etmedeki yardımı için Brad Lackford'a teşekkürler.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amaxa nükleofektör 96 oyuklu mekik sistemiLonzaAAM-1001S
Amaxa SF hücre hattı 96 kuyulu nükleofektör kitiLonzaV4SC-2096
RAW264.7 fare makrofaj hücre hattıATCCTIB-71
J774A.1 fare makrofaj hücre hattıATCCTIB-67
siGenome smartpool siRNADharmaconbağlı olarak değişir gen
Hedeflemeyen kontrol siRNA havuzuDharmaconD-001206-13-20
Elektroporasyon için Block-iT floresan oligoInvitrogen13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPSListesi Biyolojik Laboratuvarlar421
DMEM, yüksek glikozInvitrogen11995-065
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Penisilin-streptomisin çözeltisi (Pen/Strep)FisherSV30010
%0.25 Tripsin-EDTAInvitrogen25200072
96 oyuklu doku kültürü plakalarıFisher07-200-89  
96 kuyulu yuvarlak tabanlı steril plakalar (kaplanmamış)Fisher07-200-745
Fare IL-6 Duoset ELISA kitiR& D BiosystemsDY406
Fare TNF ve alfa; Duoset ELISA kitiR& D BiosystemsDY410
Floresein diasetatSigma-AldrichF7378
RLT tamponuQiagen79216
RNeasy mini kitiQiagen74134
Vybrant Fagositoz Test KitiInvitrogenV-6694
üzerinde

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
  2. Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
  3. Fujiwara, N., Kobayashi, K.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Amaxa NucleofectorsiRNA TransfeksiyonuLPS Stim lasyonuSitokin retimiAk SitometrisiELISA AnaliziGen Susturma

İlgili makaleler