Method Article

Pre-mRNA Substratlarm 3 'End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi In vitro

DOI:

10.3791/51309

⸱

May 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemistry, City College of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA polimeraz II olgun mRNA'nın 3 'ucunun ötesine uzanan bir ön-madde RNA sentezler. Olgun RNA uç yarılma kompleksinin endonükleaz etkinliği ile, RNA dizileri tarafından dikte bir bölgede, cotranscriptionally oluşturulur. Burada, detay in vitro bölünme reaksiyonları çalışma yöntemi biz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli mRNA'ların 3 'ucu RNA polimeraz II (RNPII) ile transkripsiyonun sonlandırılması ile ani oluşmuş değildir. Bunun yerine, RNPII olgun RNA'lar ötesinde ön-mRNA sentezler ve endonükleaz aktivitesi olan bir süreç belirli bir site gereklidir. Öncü RNA bölünmesi normalde CA dinükleotidleri sonra konsensüs polyA bölgesi (AAUAAA) aşağı nt 10-30 oluşur. Yarılma kompleks, yaklaşık olarak 800 kDa'lık çok faktörlü bir protein kompleksi, ikinci proteinler, bu özel nükleaz aktivitesi gerçekleştirmek. Belirli RNA sekansları, yukarı akış ve poliA site alt bölünme kompleksinin işe kontrol eder. Hemen bölünmesinden sonra, pre-mRNA stabil olgun RNA mesajları üretmek için poli A polimerazı (PAP) ile poliadenile edilmiştir.

Bir RNA transkriptinin 3 'ucunun radyo-etiketli RNA Processing özel alt-tabakalar ile hücre nükleer özler kullanılarak incelenebilir. Özetle, uzun bir 32 </ Sup> P-etiketli Parçalanmamış öncü RNA, in vitro olarak nükleer ekstreler ile inkübe edilir, ve bölünme jel elektroforez ve otoradyografi ile değerlendirilir. Uygun bölünme oluştuğunda, 5 'kısa bir ürün olarak algılanır ve ölçülür ayrıldı. Burada, bir örnek olarak, kullanılarak ayrıntılı olarak HIV-1 mRNA'ların 3 'ucu işleme bölünme tahlili tarif eder.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En olgun ökaryotik mesajı RNA'lar (mRNAlarının) biyosentezi gibi kapatma, yapıştırma ve poliadenilasyonun gibi çeşitli transkripsiyon sonrası değişiklikler gerektirir. Bu değişiklikler genel olarak doğru işlem 1 yürütülmesini sağlamak ve güçlü bir mRNA'nın stabilitesini arttırmak kuple edilir.

3 ', memeli ön mRNA uç oluşumu 5'e adenilat tortularının ilave edildi ve ardından yeni oluşan RNA endonükleolitik yarılmasıyla üretilir' poly (A) polimeraz (PAP) 2-4 ürünü ayrıldı. Memelilerde, bölünme özel ön-RNA dizileri üzerinde toplanır, yaklaşık 800 kDa, ve, bir çok-bileşenli protein kompleksi ile gerçe....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Süspansiyon içine yapışan hücreler 1. İntibak

(Bu, isteğe bağlı bir adımdır. Süspansiyon hücreleri genel olarak, ancak plakalar içinde yetişen hücreler de kullanılabilir daha iyi nükleer özler olun.)

  1. Penisilin-streptomisin:% 5-10 yeni doğmuş buzağı serumu ve fetal inek serumu ve% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş Joklik değiştirilmiş MEM kullanılarak süspansiyon içinde büyüme için yapışkan hücreler uyum. % 8 CO2 ile 37 ° C 'de bir filtre kapak ile döndürücü şişelere hücreleri yayma.
  2. Hücreler adapte olduğunda, 500 ml spinner flask içinde 100 ml ile başlar. Minimum 0,3 x 10 6 hücre / ml korumak ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA poli (A) HIV-1 siteleri (Şekil 2) bir bölünme tahlili temsil edici sonuçları. Bu jelin üstünde yavaş göç eden bir bant Parçalanmamış RNA alt tabakanın, gözlemleyebiliriz. Belirli ürün, daha hızlı parçalanan beklenen boyutta jelde çalışan en yoğun kısa fragman bandı, ve poliA sekansı (mutPolyA) RNA, bir nokta mutasyon ihtiva mutpoly (A) kontrolü yarılma tahlilinden özellikle yoktur alt-tabaka. Giriş substratın degradasyon ürünleri, bazen gözlemlenebilir. Yarılma aktivitesi miktar tayini Parçalanmamış.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HeLa hücre nükleer özütlerinde veya bu ekstrelerden parçalandı bölme faktörleri ile gerçekleştirilen in vitro pre-mRNA 3 'bölünme reaksiyonu, çekirdek bölünmesi faktörler ve ana komplekslerinin 16-21 tanımlanmasını sağladı. Bu faktörlerle ilişkili daha birçok proteinlerin son zamanlarda 22 tespit edilmiştir ve in vitro reaksiyon bu proteinlerin reaksiyonu nasıl katkıda ışık tutacak devam edebilir. In vivo reaksiyon cotranscriptional 23 gibi görünüyor, ya da.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SV NIH K22AI077353 ve Landenberger Vakfı'nın finansman desteği için minnettar olduğunu. KR minnetle NIH (5SC1GM083754) fon kabul eder.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 L Celstir şişesiWheaton356884Farklı boyutlar mevcuttur
4 konumlu yavaş hızlı karıştırıcıVWR12621-076
Sallanan kova santrifüjüBeckman CoulterAllegra x-15R, SX4500 Rotorlu
UltrasantrifüjBeckman CoulterOptima L-100 XP Ultra, SW41 Rotorlu
Masa üstü santrifüj 5417REppendorfBuzdolabı
Termomikser inkübatörüEppendorf
250 ml konik tüplerCorning430776
50 ml konik tüplerBD Falcon352098
Ultraclear santrifüj tüpleriBeckman Coulter344059
JOKLIK modifiye MEMLonza04-719Q
Fetal sığır serumuAtlasF-0500-AIsı ile etkisiz hale getirilmiş
L-glut:kalem:strepİkizler Biyo-Ürünler400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0Mediatech46-031-CM
Magnezyum klorürFisherBP214-500
Potasyum klorürMP Biyomedikal194844
HEPESFisherBP310-500
DTTAlexis Biyomedikal280-001-G-010
GliserolFisherBP229-4
5 M sodyum klorür çözeltisiMediatech46-032-CV
EDTA 0.5 M çözeltisiSigma-AldrichE7889-100ml
EDTAFisherBP120-500
PMSFTermo Bilimsel36978
Amonyum sülfatFisherA702-500
Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyl tabletleriRoche04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Diyaliz Kasetleri KitiThermo Scientific66372MWCO 7.000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce doku öğütücü setiSigma-AldrichD9938-1SETboyutlar mevcuttur
Yüksek kaliteli PCR kitini genişletinRoche11 732 650 001
10 mM dNTP MixInvitrogenY02256her nükleotid 10 mM
MaxiScript SP6/T7 kitiAmbionAM1322
m7G(5 ')ppp (5') G RNA kapağıNew England BiolabsS1404S
Yüzyıl İşaretleyici Şablonu ArtıAmbionAM7782
Easytides UTP [&alfa;-32P] 250 μ CiPerkin ElmerBLU507H250UC
Jel yükleme tamponu IIAmbion8546G
DEPC arıtılmış suAmbionAM9906
10x TAEFisherBP13354
10x TBEAmeresco Yaşam Bilimleri0658-4L
10x PBSFisherBP399-20
ÜreBalıkçısıBP169-212
Amonyum persülfatBio-Rad161-0700
TEMEDFisherBP150-20
Amonyum asetatFisherA637-500
%40 19:1 Akrilamid:Bis-AkrilamidBio-Rad161-0144
GlikojenRoche10 901 393 001
%100 mutlak etanol 200 kanıtAcros61509-0040
Asit fenol: kloroformAmbion9720RNA
Scintilasyon sıvısıiçin FisherSX18-4
Rnaz inhibitörüPromegaN261B
Polivinil alkol- PVASigma-AldrichP8136-250G
Kreatin fosfatCalbiochem2380
100 mM dATPFisherBP2560-4
SDSAcros23042-5000
Proteinaz KFisherBP1700-100
Ayarlanabilir dizileme ünitesiSigma-AldrichZ351881-1EA
Bağlayıcı klipslerOfis Deposu838-056
20 cm x 42 cm cam plakalarSigma-AldrichZ3525431 TAKIM
20 cm x 22 cm cam plakalarSigma-AldrichZ35252-71 TAKIM
20 cm x 42 cm alüminyum soğutma plakalarıSigma-AldrichZ3526671 EA
0,4 mm x 22 cm ara parçalarSigma-AldrichZ35230-61 SET
0,4 mm x 42 cm ara parçalarSigma-AldrichZ352314-11 SET
8 kuyulu tarakSigma-AldrichZ35195-41 EA
16 oyuklutarak Sigma-AldrichZ3519621 EA
32 oyuklu tarakSigma-AldrichZ3519701 EA
Jel itici kaplamaC.B.S. ScientificSGR-0401veya SGR-0101 bireysel şişe için
Jel yükleme ipuçlarıRaininGT-10-40.1-10 &; l
Sıralama PowerPac HVBio-RadPowerPac HV5.000 V/500 mA/400 W
Jel Kurutucu Model 583Bio-RadModel 583
Jel kurutucu için Hydrotech vakum pompasıBio-Rad
Glogos II Karanlıkta parlayan kalemlerAgilent420201
Film 8 x 10MidsciBX810
Film 14 x 17PhoenixF-BX1417
Otoradyografi kasetiFisherFBCA 14178 x 10 boyutu mevcut
Farklı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
  2. Wahle, E., Ruegsegger, U. 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
  3. Colgan, D. F., Manley, J. L.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Processing3 End CleavageNuclear Extract PreparationIn Vitro TranscriptionGel PurificationRadioactive Gel ElectrophoresisAutoradiographyPolyadenylation AssayHIV 1 mRNACell Free Systems

Related Articles