Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak

11.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51310

⸱

10 Ağustos 2014

 ,  ,  ,  , 
1RG Neuroplasticity, Leibniz Institute for Neurobiology, 2Department of Cell Biology, Utrecht University

Bu makalede

Özet

Biz, hipokampusun CA1 bölgesinde ve dilimin tetanized alan nükleer zenginleştirilmiş kısımların daha sonraki izolasyon Uzun süreli potansiyasyon indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yaklaşım, önemli aktivitesini öğrenme ve hafıza ile hücresel modellerinde bağımlı nükleer protein alma belirlemek için kullanılabilir.

Özet

Öğrenim aktivitesine bağlı protein ekspresyonu, hücre-altı yer değiştirmesi, ya da fosforilasyon sinaptik plastisite altında yatan hücresel mekanizmaların anlaşılması önemlidir. Uzun vadeli potansiyelleri (LTP) ve akut hipokampal dilim bağlı uzun süreli depresyon (LTD) yaygın öğrenme ve hafızanın hücresel modelleri olarak kabul edilir. Etkinlik bağımlı protein dinamikleri görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme veya immünohistokimya yaklaşımları kullanmak birçok çalışma bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemler tek nöronlarda floresan-etiketli proteinlerin immünolojik hücre ya da aşırı dışavurumu için antikorların uygunluğu dayanır. Proteinlerin İmmünoblotting bulguların bağımsız onay veren bir alternatif yöntemdir. Bireysel tetanized hipokampal dilimlerde sub-hücresel fraksiyonları hazırlanmasında ilk sınırlayıcı faktör, malzemenin düşük miktarıdır. İkinci olarak, işleme yöntemi çok önemlidir l, hatta çok kısa bir küçük ve manipülasyon içindilimleri Iving belirli sinyal silsileleri uyarmamaktadır olabilir. Burada fare beyninden akut hippokampüs kesitlerinin CA1 bölgesinde yeterli saflıkta nükleer bakımından zengin kısım için yeterli malzeme elde etmek için bir optimum iş akışını açıklar. Temsili bir örnek olarak, synapto-nükleer protein haberci ERK1 / 2 fosforlu şekli Jacob aktif LTP indüksiyonu üzerine çekirdeğe doğru yer değiştirir ve CA1 nöronlarının bir nükleer bakımından zengin kısım tespit edilebileceğini göstermektedir.

Giriş

Sinaptik N-metil-D-aspartat-reseptörler (NMDARs) sinaptik plastisite ve hücre hayatta kalma ve nörodejenerasyonunun hücre ölümünü nasıl tetikleyebildiği extrasynaptic NMDARs aktivasyonu ise sinyal çok önemli bir rol oynar. Bu değişiklikler sıkı kontrol / düzenlenmiş bir faaliyet bağımlı gen ifadesine bağlı ve böylece aktif sinaps veya dendritler ve nükleus 7 arasında sürekli iletişim gerektirir. MAP ERK1 / 2 sinyalizasyon sinaptik NMDARs alt baş gerçekleştirmekle ve extrasynaptic NMDAR yoluyla sinyalleme yapan hiç ya da ERK1 / 2 aktivitesi 8,11 üzerinde inhibe edici bir etkiye sahiptir, oysa, NMDAR-aktivasyonu ile uyarılan gen sentezlenmesine katılan edilir kinaz.

Distal dendrit ve çekirdeği arasındaki transfer gösterilmiştir proteinler vardır. Bu proteinlerin çoğu bir nükleer lokalizasyon sinyali içerir ve aktif olarak çekirdeğe bir 6,9 ve dinein importin bağımlı bir şekilde, mikrotübülün boyunca taşınmaktadır. InterestinglY, belirli bir sinaptik uyarıcıya tepki olarak çekirdeğe Bu taşıyıcı maddelerin bazıları için yalnızca bir geçiş. Örneğin, siklik AMP tepki elemanı bağlayıcı protein 2 (CREB2) retrograd nakil aracı kimyasal LTD, fakat LTp 12 tarafından indüklenir. Lokalize NMDAR-bağımlı uyarma sinaptik uzun vadeli plastisite hipokampal 4 katılır çekirdeği, bir translokasyon süreç içine CREB düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici (CRTC1) tahrik eder. Son zamanlarda protein haberci Jacob hem sonra nükleus, sinaptik ve extrasynaptic NMDAR aktivasyonu için translocates ve CREB'ye bağımlı gen transkripsiyonunu 5 düzenler olduğu gösterilmiştir. Sinyalinin sinaptik veya extrasynaptic kökenli Jacob bir sonrası modifikasyon kodlanmıştır. Sinaptik aktivitesi primer hipokampal kültürdeki çekirdeğe translokasyonu açısından daha sonra gerekli bir konumda olan 180 (pJacobS 180) açısından çok önemli bir serin bir Yakup'un ERK1 / 2 bağımlı fosforilasyonunu uyanr. Ayrıca, in CA1 Schaffer kollateral LTP sonra çekirdeğe akut hipokampal dilimlerin pJacobS 180 translocates nöronlar değil 1,10 LTD. pS180 Jacob plastisite ilişkili genlerin ifadesindeki artışa neden olur ve bu gen ekspresyon sinaptik fonksiyon geri beslenir. Extrasynaptic NMDARs aktivasyon Ser180 fosforilatlanır değildir ve neden çekirdekte farklı bir protein kompleksi ile ilişkili olabilir sonra çekirdeğe translocates tezat, Jacob 'CREB'ye kapatmak' ve sinaptik bağlantıları 10 bir geri çekilme.

Synapto-nükleer protein haberci nükleer ithalatına En yayınlanan çalışmalar, ayrışmış nöronal primer kültürlerinde yapılmıştır. Nöronal bağlantı ve fonksiyon çok daha iyi korunmuş olduğu, bu nedenle bu bulgular hipokampal dilimleri kullanarak fizyolojik daha uygun koşullar çoğaltılamaz görmek ilginç olacaktır. Burada LTP-de değerlendirmek için optimize edilmiş bir protokol mevcutimünoblotlama protein haberciler nükleer translokasyonunu pendent. Bu yöntem aynı zamanda bu basit bir nükleer fraksiyonda proteinin aktivitesine bağlı fosforilasyonunun analizi için uygundur. Özel olarak, mevcut protokolü akut, CA1, hipokampüse ait kesitler indüksiyonu ve LTP kayıt hazırlanmasını da kapsar. Sonraki CA1 bölgesi mikroskobik uyarılmış bölgeyi izole etmek için disseke edilir. Biz kombine ve Zhao ve arkadaşları 17 tarafından tanıtılan değişiklikler ile CellLytic nükleer Ekstraksiyon Kiti tarafından sağlanan nükleer izolasyonu için protokol değiştirilmiş. Optimize edilmiş prosedür, hücre şişmesi ve çekirdekler salımını sağlayan, hipotonik tampon maddesi içinde kesildi CA1 bölgelerin lızız ışlemını içermektedir. Hücre lizizi, ve çekirdekler morfolojisi mikroskopik inceleme ile tespit edilebilir. Nükleer zenginleştirme kısa bir santrifüjleme adımı ile elde edilir. Neun ve NSE2, nükleer veya sitosolik fraksiyonlar özel markörler, karşı antikorlar ile immunoblotting analizi bu yaklaşım hızlı bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedirve tekrarlanabilir protokolü bu hücrealtı kesirler izole etmek ve protein fosforilasyonu gibi çok kararsız öteleme sonrası modifikasyonları çalışma. Buna ek olarak, bu yöntem, hipokampal dilimler kesilmiştir CA1 bölgelerinden kaynaklanan küçük bir doku numuneleri için avantajlıdır ve hipokampal dilimler immünohistokimya ile kombinasyon halinde de kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yetişkin sıçan beyninde gelen Akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması 1.

  1. Izofluran ile sıçan anestezisi. DİKKAT: Kapalı bir exicator kullanarak prosedürü uygulayın, izofluran solumamanızı. Hayvan tamamen uyuşturulduktan emin olun.
  2. Hızlı, sıçan başını kesmek beyin izole ve precarbonated (% 95 O 2/5% CO2 gaz karışımı), buz soğukluğunda mM Gey çözeltisi içinde (bileşim bekletmektir: 130 NaCl, 4.9 KCl, 1.5 CaCl2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2, O, 11 MgCI2 · 6H 2, O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8, Na 2 HPO 4 · 7H 2, O, 5 Glükoz · H2O, 25 HEPES, 22 NaHCO3, pH 7.32) 30 dakika boyunca 1,2,10,16.
  3. Entorhinal korteks beyincik ve parçasını çıkarın. Daha sonra medial yüzeyi üzerinde her yarımkürede aşağı yerleştirin, bir mid-sagital kesim ile kortikal hemisferlerdir ayırın. Bundan sonra yapmakHer yarımkürede 13,14 dorsal kenarı boyunca 50-70 ° kesim (50-70 ° enine).
  4. Kesit sistemin dilimleme platformda taze kesilmiş yüzeyi ile her yarımkürede Tutkal. Platform precarbogenated buz soğuk Gey çözümü ile kaplanmış olmalıdır.
  5. Z-ekseni salınımı en aza indirmek için ayarlanmış bir vibratome kullanarak yan posterior anterior 350 mikron 50-70 ° enine dilim kesin. Hipokampal oluşumda, subiküler ve entorinal kortekste gibi hipokampusa Dorsolateral bulunan korteksleri deneyler 13,14 için kullanılan dilimlerin bir parçası olacaktır.
  6. U-şekli ve batırılmış tipte inkübatöre hipokampal dilimler aktarın ve carbogenated yapay serebrospinal akışkan (ACSF mM içeren 32 ° C'de en az 2 saat süreyle inkübe edin: 2H ​​2, O, 1,5 MgSO ^ · 110 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 Glukoz · H 2, O, 27.4 NaHCO 3, pH 7.3) 1,2,10,16.

2. Elektrotların Konumlandırma, Temel Kayıt ve LTP indüksiyonu

  1. Mikroskop altında monte edilmiş bir batırılmış tipte kayıt odasına hipokamp dilim aktarın. 32 ° C'de en az 30 dakika boyunca carbogenated ACSF (6-7 ml / dak) perfüze.
  2. (Uç direnci M? 3-5 olan) ACSF ile dolu cam kılcal Mikroelektronlar hazırlayın.
  3. Uyarımı ve fEPSP için CA1 stratum radiatum kayıt 1,2,10 (Şekil 2) CA1 Schaffer kollateral-liflerde ACSF ile dolu bir cam Mikroelektronlar yerleştirin. Elektrotlar arasındaki mesafe yaklaşık 300 um olmalıdır.
  4. 3-4 V arasındaki bir aralıkta iki fazlı dikdörtgen akım darbelerinin (200 ms / kutup) ile Schaffer kollateral liflerin-uyarılması ile alanını uyancı postsinaptik potansiyeller (fEPSPs) uyandırmak
  5. Inp ölçerek maksimum stimülasyon testi gerçekleştirinut-çıkış ilişkisi ve elde edilen maksimum fEPSP-eğim değerlerinin% 40 olarak uyarım gücünü tanımlamak ve deney boyunca sabit tutun.
  6. Maksimum uyarma testi sonra en az 15 dakika boyunca başlangıç ​​kayıt başlayın. Deney boyunca her dakika uyaranlara test yanıtları ölçün. Düşük frekanslı stimülasyon ile bazal kayıtları gerçekleştirin.
  7. En az 30 dakika boyunca temel kaydedin.
  8. Geç-LTP indüksiyonu için yüksek frekansı 5 dk diziler arası aralık ile 100 Hz üç 1 sn uyaran trenler oluşan 100 Hz tetanization geçerlidir. CA1 bölgesinde 5 uM bicuculline içinde stimülasyon alanını artırmak için tetanization önce, 2 dakika ile yıkanabilir ve hemen geçen tetanization sonra yıkanmalıdır.

LTP ve Yapış Donma İndüksiyonunun sonra Dilimleri 3. Koleksiyonu

  1. Dur LTP 2 dakika ya da Geç-LTP uyaran tetanik stimülasyon üç trenlerin 30 dakika sonra kayıt.
  2. elektrotlar ve hızlı bir şekilde kuru buz üzerinde yerleştirilmiş metal bir platform üzerine precold dilim aktarın. U-şekilli inkübatör tutulan bir kontrol dilim için prosedürü tekrarlayın. DİKKAT: eldiven kullanın kuru buz ile çalışırken.
  3. -80 ° C de, 1.5 ml tüp ve mağaza her dilim toplayın.

Hippocampus CA1 Bölgesi'nden Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler 4. İzolasyonu

  1. -80 ° C donmuş dilimleri, 1.5 ml'lik Eppendorf tüpleri çıkarın ve buz üzerinde tutun.
  2. Ekleme tüpüne taze soğuk TBS tampon çözeltisi ihtiva eden bir proteaz (PI) ve fosfataz (PS) inhibitörleri, 0.5 mi. 2-3 dakika inkübe ve stereomicroscope transfer. DİKKAT: koruyucu eldiven kullanın ve PI ve PS ile çalışırken bir laboratuvar önlüğü.
  3. Iki iğne kullanılarak hipokampusun CA1 stratum radiatumdan, pyramidale bölgesini ayır. Stereomikroskop ve CA1 alanı kesmek için ikinci bir iğne altında tutulması için bir dilim iğne kullanın.
  4. Disseke CA toplayın50 ul liziz tamponu ihtiva eden yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine (her bir grup için) 5 kesitlerden 1 bölgeleri (mM olarak içeren hipotonik liziz tamponu 1x: 10 HEPES, 1.5 MgCl2, 10 KCI, PI ve PS ile pH 7.9). Bu malzeme miktarı 2-3 imünoblotlarının çalıştırmak için yeterli olacağını unutmayın.
  5. Aşağı dikkatli pipetleme up ve tarafından toplanan doku homojenize. 200 ul pipet kullanın. Hücre şişer izin vermek için 5-7 dakika boyunca buz üzerinde inkübe lizat.
  6. , Lizatının 2 ul alır mikroskobik bir slayt üzerinde açılan ve parlak bir alan mikroskobu altında hücrelerin şişmesine görselleştirmek. Hücrelerin doğru şişmesi ile çekirdekler gibi yuvarlak sağlam yapıları görünür.
  7. 'Homojenat fraksiyon "olarak yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine 20 ul numune toplayın. 4 x SDS numune tamponu denatüre 8 ul ilave edin.
  8. 1 dakika boyunca 11,000 rpm'de santrifüje kalan lizatları.
  9. Dikkatle, tr üst ('Sitosolik kısım, M') 'süpernatan toplamakansfer yeni bir tüpe ve 4x numune tamponu 20 ul ekle.
  10. , Hipotonik tampon maddesi, 60 ul pelletini ve 4x numune tamponu 20 ul ekle. Bu fraksiyon bir nükleer bakımından zengin kısım "olarak adlandırılır.
  11. Homojenat, sitosolik, nükleer veya zenginleştirilmiş kısımlar, daha sonra -80 ° C bağışıklık boyama için -20 ° C'de saklanabilir.

Synapto nükleer proteinlerin yarı kantitatif 5. Bağışıklık

  1. Örnekleri Defreeze ve 95 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatın.
  2. Her parçadan 5 ul alın ve amido siyah testi veya BCA testi ile protein konsantrasyonu belirlemek.
  3. SDS-PAGE üzerinde homojenattan protein örneklerinin eşit miktarda, sitoplazmik ve nükleer zenginleştirilmiş kısımlar yükleyin. Ve kontrol LTP kesitlerden örnekler doğrudan bir karşılaştırma için, aynı jel üzerine yerleştirilmelidir.
  4. Standart Batı-kurutma işlemini gerçekleştirin (ıslak transferi önerilir).
  5. T membranlar Probeo seçenek antikor. Nörona özgü enolase2 (NSE2) ve nükleer işaretleyici - - Neun bir yükleme kontrolü olarak bir p-aktin antikor daha sonra aynı blotlar (veya aynı anda paralel ölçüm), sitoplazmik bir işaretleyici ile problanabilir.

6. Veri Analizi

  1. LTP indüksiyon Verimliliği Clampfit yazılım ile analiz edilebilir. Bazal kayıtların ortalama eğim tetanization sonra yamaçları iki yönlü ANOVA, p kullanılması ile karşılaştırıldığında <0.05 anlamlı farklılık olarak kabul edildi. FEPSP eğim değerleri ortalama ± SEM olarak şemalarda tasvir edildi
  2. Immunoblotların ölçümü için, bir film ya da otoradyografik tarar ve bir Licor sistemi ile ImageJ veya flüoresan gruplar tarafından protein bantlarının yoğunluğu analiz entegre. Immunorekatif bantlar Değerleri yükleme ve kurutma kontrolü için normalize edilmelidir. Kontrolü karşılaştırması ve LTP gruplar için nonparametrical Mann-Whitney U-Testi kullanılmış olabilir.
Tamponun Adı Reaktif Konsantrasyon (mM) Tutar Yorumlar / Açıklama
Gey çözeltisi (pH: ~ 7.4 7.3) NaCl 130 7.6 gr steril filtrasyon
1000 mi KCl 4.9 0.37 gr
CaCl2 · 2H 2 O 1.5 0.22 gr
MgSO 4 · 2H 2 O 0.3 0.0739 g
MgCI2 · 6H 2 O 11 2.24 g
KH 2 PO 4 0.23 0.0313 g
Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 0.8 0,2145 g
Glukoz · H2O 5 0,9909 g
Hepes 25 5.96 gr
NaHCO3 22 1.85 g
ACSF (pH: ~ 7.4 7.3) NaCl 110 6.428 g steril filtrasyon
1000 mi KCl 2.5 0,1865 g
CaCl2 · 2H 2 O 2.5 0.368 g
MgSO 4 · 2H 2 O 1.5 0.370 g
KH 2 PO 4 1.24 0.169 gr
Glukoz · H2O 10 1,9817 g
NaHCO3 27.4 2,3 g
1x Hipotonik tamponu (pH: 7.9) Hepes 10 0.23 g
100 mi MgCI2 · 6H 2 O 1.5 0.0304 g
KCl 10 0,07455 g

Tablo 1. Tamponlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Daha önce synapto-nükleer protein haberci Jacob LTP indüksiyonu değil, LTD 1 Aşağıdaki çekirdekte birikmektedir göstermiştir. Ayrıca, sinaptik stimülasyonu sonrası Yakup'un translokasyon Ser180 (Şekil 1) MAPK ERK1 / 2 aktivasyonunu ve Yakup'un fosforilasyonu gerektirir. Fosforile edilmiş Jacob bir importin bağımlı bir şekilde çekirdeğe doğru yer değiştirir ve fosforile durum 15 αinternexin ara filaman ile birlikte (Şekil 1) uzun süreler boyunca muhafaza edi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıdaki protokolün açıklanan adımlar, hipokampus akut genç ya da yetişkin farelerin dilimlenmiş hazırlamak dilim uyarılmış alanı neden ve kayıt LTP, hızla teşrih ve aktivite bağımlı protein dinamikleri incelemek için nükleer zenginleştirilmiş kısmını hazırlamak için nasıl rehberlik sağlamak. Bu yaklaşım, her biri birbirinden bağımsız bir şekilde kullanılan birçok farklı yöntemlerin kombinasyonu kaynaklanmaktadır. Biz bir iş akışını optimize edilmiş ve LTP indüksiyonu üzerine proteinlerin hücre içi yeniden dağıtılması...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP hibesi (MRK), AB FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Davranışsal Beyin Bilimleri Merkezi (CBBS, Şahsen-Anhalt), (AK ve SB) tarafından finanse edilmiştir, MM, Avrupa Moleküler Biyoloji Organizasyonu (EMBO) Uzun Süreli Bursu (EMBO ALTF 884-2011) ve Marie-Curie IEF sahibidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Equipment
CED 1401 AD/DA dönüştürücüCambridge Electronics Design, İngiltere
a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">StereomikroskopLeica S4E, Almanya
VibrotomLeica VT1000S, Almanya
İzole nabız stimülatörüA-M Sistemler, ABDModel 2100
SantrifüjThermo Scientific
SDS-PAGE sistemiBiorad
SoğutucuJulabo
Parlak alan MikroskobuNikon Eclipse TS100
Hücre kültürü inkübatörüThermo Electron Corporation
Luigs & Neumann, SM-5, Almanya
Kurutma odası ve elektrik enerjisi tedarikçisiHoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA
Batık tip kayıt odasıözel yapım
U-şekilli ve batık tip inkübatör ısmarlama
Küçük cerrahi makas
Neşter
İnce spatula
Plastik Pastör pipeti
Plastik kültür kabı  
Bunsen beher
Şırınga
Reagents
NaClRothArt.-Nr.3957.1≥ %99,5, pa, ACS, ISO
KClRoth Art.-Nr.6781.1≥ % 99,5, pa, ACS, ISO
CaCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; 2H < alt > 2 < / alt >OMerck1.02382.0500pro analizi
MgSO 4< / alt > ve orta nokta; 2H2OMerck5886.05pro analizi
MgCl2· 6H2OAppliChemCAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:Moleküler biyoloji için
2320946 KH2< / sub>PO < sub>4< / sub>Merck12034.025moleküler biyoloji için
Na2< / sub>HPO4< / sub> ve orta nokta; 2H2OMerck1.06574.1000ekstra saf
Glikoz ve orta nokta; H2ORothArt.-Nr.6887.1moleküler biyoloji için
HEPESRothArt.-Nr.9105.4PUFFERAN, ≥ %99,5, yıllık
NaHCO3Merck1.06329.1000pro analizi
Proteaz inhibitörü kokteyliRoche
FosfostopRoche
BicucullineTocris Bioscience
IsofluranBaxter
Antikorlar
Birincil antikorlarŞirketKatalogNumarası Tür
pJac-s180 Biogenestavşan (1:100 seyreltilmiş)
NeuNMiliporeMAB377fare (1:1.000 seyreltilmiş)
NSEHücre SinyaliD20H2tavşan (1:1.000 seyreltilmiş)
Beta-aktinSigmaA-5441fare (1:5.000 seyreltilmiş)
İkincil antikorlarŞirketKatalog NumarasıTür:
IgG HRP konjugeDAKOkeçi anti-fare (1:5,000)
IgG HRP konjugeNEBkeçi anti-tavşan (1:5,000)
< Mikromanipülatör

Kaynaklar

  1. Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276(2011).
  2. Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).
  3. Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
  4. Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
  5. Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34(2008).
  6. Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
  7. Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
  8. Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
  9. Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
  10. Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
  11. Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
  12. Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
  13. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
  14. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).
  15. Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
  16. Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
  17. Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ekirdek e Zenginle tirilmi FraksiyonCA1 B lgesiLTP nd ksiyonuWestern Blot AnaliziSinapto n kleer ProteinFosforile Jacob TespitiHipotonik Lizis TamponuDoku DiseksiyonuProtein Translokasyonu
Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.