Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak

Sinaptik N-metil-D-aspartat-reseptörler (NMDARs) sinaptik plastisite ve hücre hayatta kalma ve nörodejenerasyonunun hücre ölümünü nasıl tetikleyebildiği extrasynaptic NMDARs aktivasyonu ise sinyal çok önemli bir rol oynar. Bu değişiklikler sıkı kontrol / düzenlenmiş bir faaliyet bağımlı gen ifadesine bağlı ve böylece aktif sinaps veya dendritler ve nükleus ⁷ arasında sürekli iletişim gerektirir. MAP ERK1 / 2 sinyalizasyon sinaptik NMDARs alt baş gerçekleştirmekle ve extrasynaptic NMDAR yoluyla sinyalleme yapan hiç ya da ERK1 / 2 aktivitesi ^8,11 üzerinde inhibe edici bir etkiye sahiptir, oysa, NMDAR-aktivasyonu ile uyarılan gen sentezlenmesine katılan edilir kinaz.

Distal dendrit ve çekirdeği arasındaki transfer gösterilmiştir proteinler vardır. Bu proteinlerin çoğu bir nükleer lokalizasyon sinyali içerir ve aktif olarak çekirdeğe bir ^6,9 ve dinein importin bağımlı bir şekilde, mikrotübülün boyunca taşınmaktadır. InterestinglY, belirli bir sinaptik uyarıcıya tepki olarak çekirdeğe Bu taşıyıcı maddelerin bazıları için yalnızca bir geçiş. Örneğin, siklik AMP tepki elemanı bağlayıcı protein 2 (CREB2) retrograd nakil aracı kimyasal LTD, fakat LTp ¹² tarafından indüklenir. Lokalize NMDAR-bağımlı uyarma sinaptik uzun vadeli plastisite hipokampal ⁴ katılır çekirdeği, bir translokasyon süreç içine CREB düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici (CRTC1) tahrik eder. Son zamanlarda protein haberci Jacob hem sonra nükleus, sinaptik ve extrasynaptic NMDAR aktivasyonu için translocates ve CREB'ye bağımlı gen transkripsiyonunu ⁵ düzenler olduğu gösterilmiştir. Sinyalinin sinaptik veya extrasynaptic kökenli Jacob bir sonrası modifikasyon kodlanmıştır. Sinaptik aktivitesi primer hipokampal kültürdeki çekirdeğe translokasyonu açısından daha sonra gerekli bir konumda olan 180 (pJacobS 180) açısından çok önemli bir serin bir Yakup'un ERK1 / 2 bağımlı fosforilasyonunu uyanr. Ayrıca, in CA1 Schaffer kollateral LTP sonra çekirdeğe akut hipokampal dilimlerin pJacobS 180 translocates nöronlar değil ^1,10 LTD. pS180 Jacob plastisite ilişkili genlerin ifadesindeki artışa neden olur ve bu gen ekspresyon sinaptik fonksiyon geri beslenir. Extrasynaptic NMDARs aktivasyon Ser180 fosforilatlanır değildir ve neden çekirdekte farklı bir protein kompleksi ile ilişkili olabilir sonra çekirdeğe translocates tezat, Jacob 'CREB'ye kapatmak' ve sinaptik bağlantıları ¹⁰ bir geri çekilme.

Synapto-nükleer protein haberci nükleer ithalatına En yayınlanan çalışmalar, ayrışmış nöronal primer kültürlerinde yapılmıştır. Nöronal bağlantı ve fonksiyon çok daha iyi korunmuş olduğu, bu nedenle bu bulgular hipokampal dilimleri kullanarak fizyolojik daha uygun koşullar çoğaltılamaz görmek ilginç olacaktır. Burada LTP-de değerlendirmek için optimize edilmiş bir protokol mevcutimünoblotlama protein haberciler nükleer translokasyonunu pendent. Bu yöntem aynı zamanda bu basit bir nükleer fraksiyonda proteinin aktivitesine bağlı fosforilasyonunun analizi için uygundur. Özel olarak, mevcut protokolü akut, CA1, hipokampüse ait kesitler indüksiyonu ve LTP kayıt hazırlanmasını da kapsar. Sonraki CA1 bölgesi mikroskobik uyarılmış bölgeyi izole etmek için disseke edilir. Biz kombine ve Zhao ve arkadaşları ¹⁷ tarafından tanıtılan değişiklikler ile CellLytic nükleer Ekstraksiyon Kiti tarafından sağlanan nükleer izolasyonu için protokol değiştirilmiş. Optimize edilmiş prosedür, hücre şişmesi ve çekirdekler salımını sağlayan, hipotonik tampon maddesi içinde kesildi CA1 bölgelerin lızız ışlemını içermektedir. Hücre lizizi, ve çekirdekler morfolojisi mikroskopik inceleme ile tespit edilebilir. Nükleer zenginleştirme kısa bir santrifüjleme adımı ile elde edilir. Neun ve NSE2, nükleer veya sitosolik fraksiyonlar özel markörler, karşı antikorlar ile immunoblotting analizi bu yaklaşım hızlı bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedirve tekrarlanabilir protokolü bu hücrealtı kesirler izole etmek ve protein fosforilasyonu gibi çok kararsız öteleme sonrası modifikasyonları çalışma. Buna ek olarak, bu yöntem, hipokampal dilimler kesilmiştir CA1 bölgelerinden kaynaklanan küçük bir doku numuneleri için avantajlıdır ve hipokampal dilimler immünohistokimya ile kombinasyon halinde de kullanılabilir.

Yetişkin sıçan beyninde gelen Akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması 1.

1. Izofluran ile sıçan anestezisi. DİKKAT: Kapalı bir exicator kullanarak prosedürü uygulayın, izofluran solumamanızı. Hayvan tamamen uyuşturulduktan emin olun.
2. Hızlı, sıçan başını kesmek beyin izole ve precarbonated (% 95 O _{2/5% CO2} gaz karışımı), buz soğukluğunda mM Gey çözeltisi içinde (bileşim bekletmektir: 130 NaCl, 4.9 KCl, 1.5 _CaCl2 · 2H ₂ O , 0.3 MgSO ₄ · 2H _2, O, 11 _MgCI2 · 6H _2, O, 0.23 KH ₂ PO _4, 0.8, Na ₂ HPO ₄ · 7H _2, O, 5 Glükoz · _H2O, 25 HEPES, 22 _NaHCO3, pH 7.32) 30 dakika boyunca ^1,2,10,16.
3. Entorhinal korteks beyincik ve parçasını çıkarın. Daha sonra medial yüzeyi üzerinde her yarımkürede aşağı yerleştirin, bir mid-sagital kesim ile kortikal hemisferlerdir ayırın. Bundan sonra yapmakHer yarımkürede ^13,14 dorsal kenarı boyunca 50-70 ° kesim (50-70 ° enine).
4. Kesit sistemin dilimleme platformda taze kesilmiş yüzeyi ile her yarımkürede Tutkal. Platform precarbogenated buz soğuk Gey çözümü ile kaplanmış olmalıdır.
5. Z-ekseni salınımı en aza indirmek için ayarlanmış bir vibratome kullanarak yan posterior anterior 350 mikron 50-70 ° enine dilim kesin. Hipokampal oluşumda, subiküler ve entorinal kortekste gibi hipokampusa Dorsolateral bulunan korteksleri deneyler ^13,14 için kullanılan dilimlerin bir parçası olacaktır.
6. U-şekli ve batırılmış tipte inkübatöre hipokampal dilimler aktarın ve carbogenated yapay serebrospinal akışkan (ACSF mM içeren 32 ° C'de en az 2 saat süreyle inkübe edin: 2H _​​2, O, 1,5 MgSO ^ · 110 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 _{CaCl2 4} · 2H ₂ O, 1.24 KH ₂ PO _4, 10 Glukoz · H ₂, O, 27.4 NaHCO _3, pH 7.3) ^1,2,10,16.

2. Elektrotların Konumlandırma, Temel Kayıt ve LTP indüksiyonu

1. Mikroskop altında monte edilmiş bir batırılmış tipte kayıt odasına hipokamp dilim aktarın. 32 ° C'de en az 30 dakika boyunca carbogenated ACSF (6-7 ml / dak) perfüze.
2. (Uç direnci M? 3-5 olan) ACSF ile dolu cam kılcal Mikroelektronlar hazırlayın.
3. Uyarımı ve fEPSP için CA1 stratum radiatum kayıt ^1,2,10 (Şekil 2) CA1 Schaffer kollateral-liflerde ACSF ile dolu bir cam Mikroelektronlar yerleştirin. Elektrotlar arasındaki mesafe yaklaşık 300 um olmalıdır.
4. 3-4 V arasındaki bir aralıkta iki fazlı dikdörtgen akım darbelerinin (200 ms / kutup) ile Schaffer kollateral liflerin-uyarılması ile alanını uyancı postsinaptik potansiyeller (fEPSPs) uyandırmak
5. Inp ölçerek maksimum stimülasyon testi gerçekleştirinut-çıkış ilişkisi ve elde edilen maksimum fEPSP-eğim değerlerinin% 40 olarak uyarım gücünü tanımlamak ve deney boyunca sabit tutun.
6. Maksimum uyarma testi sonra en az 15 dakika boyunca başlangıç ​​kayıt başlayın. Deney boyunca her dakika uyaranlara test yanıtları ölçün. Düşük frekanslı stimülasyon ile bazal kayıtları gerçekleştirin.
7. En az 30 dakika boyunca temel kaydedin.
8. Geç-LTP indüksiyonu için yüksek frekansı 5 dk diziler arası aralık ile 100 Hz üç 1 sn uyaran trenler oluşan 100 Hz tetanization geçerlidir. CA1 bölgesinde 5 uM bicuculline içinde stimülasyon alanını artırmak için tetanization önce, 2 dakika ile yıkanabilir ve hemen geçen tetanization sonra yıkanmalıdır.

LTP ve Yapış Donma İndüksiyonunun sonra Dilimleri 3. Koleksiyonu

1. Dur LTP 2 dakika ya da Geç-LTP uyaran tetanik stimülasyon üç trenlerin 30 dakika sonra kayıt.
2. -80 ° C de, 1.5 ml tüp ve mağaza her dilim toplayın.

Hippocampus CA1 Bölgesi'nden Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler 4. İzolasyonu

1. -80 ° C donmuş dilimleri, 1.5 ml'lik Eppendorf tüpleri çıkarın ve buz üzerinde tutun.
2. Ekleme tüpüne taze soğuk TBS tampon çözeltisi ihtiva eden bir proteaz (PI) ve fosfataz (PS) inhibitörleri, 0.5 mi. 2-3 dakika inkübe ve stereomicroscope transfer. DİKKAT: koruyucu eldiven kullanın ve PI ve PS ile çalışırken bir laboratuvar önlüğü.
3. Iki iğne kullanılarak hipokampusun CA1 stratum radiatumdan, pyramidale bölgesini ayır. Stereomikroskop ve CA1 alanı kesmek için ikinci bir iğne altında tutulması için bir dilim iğne kullanın.
4. Disseke CA toplayın50 ul liziz tamponu ihtiva eden yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine (her bir grup için) 5 kesitlerden 1 bölgeleri (mM olarak içeren hipotonik liziz tamponu 1x: 10 HEPES, 1.5 _MgCl2, 10 KCI, PI ve PS ile pH 7.9). Bu malzeme miktarı 2-3 imünoblotlarının çalıştırmak için yeterli olacağını unutmayın.
5. Aşağı dikkatli pipetleme up ve tarafından toplanan doku homojenize. 200 ul pipet kullanın. Hücre şişer izin vermek için 5-7 dakika boyunca buz üzerinde inkübe lizat.
6. , Lizatının 2 ul alır mikroskobik bir slayt üzerinde açılan ve parlak bir alan mikroskobu altında hücrelerin şişmesine görselleştirmek. Hücrelerin doğru şişmesi ile çekirdekler gibi yuvarlak sağlam yapıları görünür.
7. 'Homojenat fraksiyon "olarak yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine 20 ul numune toplayın. 4 x SDS numune tamponu denatüre 8 ul ilave edin.
8. 1 dakika boyunca 11,000 rpm'de santrifüje kalan lizatları.
9. Dikkatle, tr üst ('Sitosolik kısım, M') 'süpernatan toplamakansfer yeni bir tüpe ve 4x numune tamponu 20 ul ekle.
10. , Hipotonik tampon maddesi, 60 ul pelletini ve 4x numune tamponu 20 ul ekle. Bu fraksiyon bir nükleer bakımından zengin kısım "olarak adlandırılır.
11. Homojenat, sitosolik, nükleer veya zenginleştirilmiş kısımlar, daha sonra -80 ° C bağışıklık boyama için -20 ° C'de saklanabilir.

Synapto nükleer proteinlerin yarı kantitatif 5. Bağışıklık

1. Örnekleri Defreeze ve 95 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatın.
2. Her parçadan 5 ul alın ve amido siyah testi veya BCA testi ile protein konsantrasyonu belirlemek.
3. SDS-PAGE üzerinde homojenattan protein örneklerinin eşit miktarda, sitoplazmik ve nükleer zenginleştirilmiş kısımlar yükleyin. Ve kontrol LTP kesitlerden örnekler doğrudan bir karşılaştırma için, aynı jel üzerine yerleştirilmelidir.
4. Standart Batı-kurutma işlemini gerçekleştirin (ıslak transferi önerilir).
5. T membranlar Probeo seçenek antikor. Nörona özgü enolase2 (NSE2) ve nükleer işaretleyici - - Neun bir yükleme kontrolü olarak bir p-aktin antikor daha sonra aynı blotlar (veya aynı anda paralel ölçüm), sitoplazmik bir işaretleyici ile problanabilir.

6. Veri Analizi

1. LTP indüksiyon Verimliliği Clampfit yazılım ile analiz edilebilir. Bazal kayıtların ortalama eğim tetanization sonra yamaçları iki yönlü ANOVA, p kullanılması ile karşılaştırıldığında <0.05 anlamlı farklılık olarak kabul edildi. FEPSP eğim değerleri ortalama ± SEM olarak şemalarda tasvir edildi
2. Immunoblotların ölçümü için, bir film ya da otoradyografik tarar ve bir Licor sistemi ile ImageJ veya flüoresan gruplar tarafından protein bantlarının yoğunluğu analiz entegre. Immunorekatif bantlar Değerleri yükleme ve kurutma kontrolü için normalize edilmelidir. Kontrolü karşılaştırması ve LTP gruplar için nonparametrical Mann-Whitney U-Testi kullanılmış olabilir.

Tablo 1. Tamponlar.

Daha önce synapto-nükleer protein haberci Jacob LTP indüksiyonu değil, LTD 1 Aşağıdaki çekirdekte birikmektedir göstermiştir. Ayrıca, sinaptik stimülasyonu sonrası Yakup'un translokasyon Ser180 (Şekil 1) MAPK ERK1 / 2 aktivasyonunu ve Yakup'un fosforilasyonu gerektirir. Fosforile edilmiş Jacob bir importin bağımlı bir şekilde çekirdeğe doğru yer değiştirir ve fosforile durum 15 αinternexin ara filaman ile birlikte (Şekil 1) uzun süreler boyunca muhafaza edilebilir. Jacob, fosfo-durum aktivite bağımlı gen ve hücre canlılığının ifadesi için önemlidir. İlginç bir şekilde, extrasynaptic NMDARs aktivasyonu da çekirdeğin içine Jacob sürücüler ancak bu durumda Jacob Ser180 Fosforile değildir ve nükleer birikimi CREB indükleyen 5,10 'kapatma'. Yukarıda açıklanan sonuçlar elde edilmiştir ProtocoBizim son çalışmada kurulan ls (bakınız Karpova ve ark. 10 modelinin ayrıntılı bilgi için).

Jacob LTP indüksiyonu sonrasında çekirdek içine kanıtlamak için, (Şekil 2 ve 3). Kaynaklı akut ve hipokampal dilimlerde Schaffer kollateral fEPSP potensiyasyonun uyarılmasını ölçülür ve daha sonra CA1 nöronlarının nöronal çekirdek izole Bu yüksek frekanslı uyarım uygulama (2 dakika ve 30 dakika sonra), iki farklı zaman noktasına göre ve daha sonra nükleer izolasyon ve Batı lekeleme için işlenmiştir her kesiti için, LTP * nin yüklenmesini kaydedildi (Şekil 2 ve 3). Sitosolik işaretleyici nörona özgü enolase2 (NSE) lize c santrifüj işlemi sonrasında elde edilen yüzer tabaka fraksiyonunda daha çok mevcut ise nöronal nükleer belirteç Neun zenginleştirilmesi, kesilmiş CA1 bölgesinde hazırlanan nükleer bakımından zengin kısım görülebilirarşın (Şekil 4A). (Bilgilerini Karpova ve arkadaşları için bkz. 10) pS180 Jacob antikorun özelliği, daha önce karakterize edilmiştir. pS180 Jacob düzeyleri total CA1 protein homojenatlarda ve tetanization (Şekil 4B) sonra nükleer zenginleştirilmiş fraksiyon 2 dakika içinde değişmeden kaldı, ama biz Jacob teyit, 30 dakika LTP (Şekil 4C) indüksiyon sonrası pJacobS 180 imünoreaktiviteye önemli bir artış bulundu Bu hücresel plastisite modelinde çekirdek translokasyonunu Ser180 fosforilatlandığında.

Jacob S180 fosforile Şekil 1. NMDARs sinyallerinin sinaptik kaynağını kodlar. Hipokamp Schaffer kollateral elyaflar sonuç Tetanik uyarılması sinaptik NMDARs ve MAPK'nın sonraki aktivasyonu aktivasyonundaERK1 / 2 kaskad sinyalizasyon. Aktif ERK1 / 2 bağlanan ve serin 180 Jacob fosforilleyen ve Jacob-ERK1 / 2 kompleksi çekirdeğe doğru yer değiştirir ve bu geliştirilmiş CREB aktivite ve plastikliği ilgili gen ifadesi aktivasyonu ile ilişkilidir.

Şekil 2. aletler ve LTP indüksiyonu için kullanılan ve hipokampal gelen CA1 bölgeyi diseksiyon. 3 - mikromanipulatöre perfüzyon sistemi, 4 - Yeniden Kodlama elektrot, 5 - uyarılması elektrot, 6 - Su objektif lens - Vibratome) B1-2) Elektrofizyoloji ve görüntüleme kurulumu (2 - Mikroskop A), akut Vibratome hipokampal dilimler (1 'in hazırlanması için kullanılan , 7 - hipokampal dilim dilim tutucu) C) hipokampal dilimlerde CA1 bölgesinde diseksiyonu için kullanılan ekipmanlar (8. Stereomicroscope; 9 - iğnelerle İnsülin şırınga; 10 - Küçük cerrahi makas; 11 - Neşter; 12 - Plastik Pasteur pipeti; 13 - İnce spatula; dilimleri diseksiyonu için kullanılan buz-su ile dolu 14-100 mm plastik kültür çanak ve 40 mm plastik kültür çanak.

Şekil 3. Karikatür deneysel prosedürünü gösteren. Numaraları protokolde adımlarını gösterir. 2,1-2,8) Schaffer kollateral-CA1 sinapslar potansiyasyonu için stratum radiatum yerleştirilen cam elektrodlar ile batık odasında bir akut hipokampal dilim. Içerlek yatay çubuk 5 msn'den gösterir ve dikey çubuk 0.5 mV gösterir, örnek fEPSP analog izlerini temsil eder. 3.3) • Dilimler sonra 1.5 ml tüpler içinde toplandıLTP kayıt ve donduruldu. 4.3) yetişkin sıçan hipokampal dilimlerde CA1 bölgesinde diseksiyonu. 4.4-4.5) CA1 bölgeleri hücreleri ve çekirdekleri serbest ozmotik şişmesine neden olur hipotonik lizis tamponu, içinde homojenize. 1 dakika boyunca 11,000 rpm'de lizatlarının 4.8) Santrifüj. Bağışıklık boyama için sitoplazmik ve nükleer zengin fraksiyonların 4.10) toplanması. SDS-PAGE ve daha sonra standart Batı-lekeleme ile sitoplazmik ve nükleer zengin fraksiyonlar, 5.3) Yükleme.

CA1 LTP indüksiyonu Şekil 4. çekirdekte pJacS180 birikimine yol açar. Indu sonra sitosolik, nükleer işaretleri b.) Homojenat, 2 dakika içinde pJac-S180 seviyesinin bağışıklık beneklenme analizi, ve 30 dakika süre ile problanmış homojenatı, sitosolik ve CA1 lizatının nükleer zenginleştirilmiş fraksiyon için A), bağışıklık beneklenmetetanization. C'nin ölü m) tetanization sonra nükleer zenginleştirilmiş fraksiyon, 2 dakika ile dk pJacS180 seviyesinin bağışıklık beneklenme analizi. Bu sonuçlar, 10 Karpova et al yayınlanan ölçüm grafiğinin bir parçasıdır. Bu temsili bağışıklık lekeleriyle daha özgün yayını dahil değildir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.