Nanopodia - Cep Hareketi ve Intercellular Etkileşimleri Rolleri İnce, Kırılgan Membran Projeksiyonlar

Özet

Nanopodia bir hücrenin ön ön veya arka arka 100 mikron kadar uzanır ve hücresel ortamı anlamda ince ama kırılgan zar kanallardır. 37 ° C'de, hafif bir yıkama, ve etanol, metanol veya aseton gibi bir organik çözücü önlemeyi ve daha yüksek Triton X-100 konsantrasyonları doğrudan tespiti, bu hücresel yapılar gözlemlemek için gereklidir.

Özet

Kültür yapışan hücreler hareketi ve hücreler arası etkileşimleri desteklemek için polarize durumunu korumak. Nanopodia, ince uzun, TM4SF1 (Transmembran-4-L-altı ailenin-1), imüno-lekeleme yoluyla görselleştirilebilir endotel ve kanser hücrelerinde büyük ölçüde F-aktin-negatif zar tahminleridir. 100-300 mikron çapında TMED de TM4SF1 kümeleri 14 kadar bireysel TM4SF1 moleküllere 3 ihtiva eden (TM 4SF1 e mikro d omains nriched). TMED 1 μ m 'başına TMED 3 ve sıkıca matrisine nanopodia çapa düzenli aralıklarla nanopodia boyunca aralıklı olarak düzenlenmiştir. Bu polarize endotel veya tümör hücrelerinin ön ön veya arka arkaya gelen daha 100 μ m uzatmak nanopodia sağlar ve MATR üzerinde geride olmak zar artıkları olurix hücre uzaklaşıyor zaman. TMED ve nanopodia nedeniyle aşırı kırılganlık ve sıcaklık hassasiyeti göz ardı edilmiştir. Rutin yıkama ve tespit yapısını bozabilir. Nanopodia lekelenme% 0.01 Triton X-100 kısa süreli maruz bırakma ve ardından, 37 ° C 'de paraformaldehit (PFA) doğrudan tespit ile korunur. Hücre biyolojisinde yeni ufuklar açmak Nanopodia: algılamak ve bir mesafede diğer hücreleri belirlemek, yakın temas sırasında hücreler arası etkileşimleri başlatabilir ve hareket, çoğalma dahil sinyal mekanizmaları, hücrelerin çevrelerini nasıl hissettiğinin anlayışımızı yeniden şekillendirmek ve hücre için söz veriyorum -hücre iletişimi. TM4SF1 türetilmiş nanopodia çalışmak için geliştirilen yöntemler, klasik tetraspanins, özellikle de her yerde bulunan bir ifade CD9, CD81 ve CD151 vasıtasıyla diğer hücre tiplerinde meydana nanopodia çalışmaları için yararlı olabilir.

Giriş

Hareket için polarizasyon esnasında, hayvan hücreleri filopodia, lamellipodia, geri çekme lifler ve fırfır ¹ de dahil olmak üzere, yüzeyleri dinamik, membran uzantıların, çeşitli uzanır. Son zamanlarda bu listeye eklenir nanopodia, ince bir yeni tanınan tipi (çapı 100-300 mikron), gibi filopodia gibi F-aktin yapılarının uzatılması için membran kanalları sağlamak uzun (en fazla 50-100 mikron uzunluğunda) membran projeksiyon vardı geri çekme ve elyaf ve bu leke pozitif TM4SF1 (Transmembran-4-L-altı family-1) kültürlenmiş endotelyal ve tümör hücreleri içinde ^2,3 ile.

TM4SF1 ilk molekül endotel hücre proliferasyonu ve göçünde ^2,3 önemli bir rol oynayan bir endotelyal hücre biyolojik olan keşfinden önce, bir tümör hücresi antijenine ⁴ olarak bilinen tetraspanin benzeri topolojisi ile bir proteindir. Immünofloresan boyama TM4SF1 perinuc lokalize olduğunu ortaya çıkardılear veziküller ve plazma zarına ve TM 4SF1 e nriched mikro d omains (TMED) içinde zenginleştirilmiştir. TMED çapa Matris nanopodia ve nanopodia 1-3 TMED / um uzunlukta bir düzenli aralıklı bantlı desen mevcut. Nanopodia tipik olarak bir hücrenin gelen ön uzanan ve hareket için hücre polarizasyon esnasında arka arkaya. Nedeniyle TMED bir firma yapışık doğaya, nanopodia uzak hareket olarak hücre içine geri geri edemiyoruz; terk nanopodia artıkları böylece hücresel hareketinin yolunu iz. F-aktin uzatma ve geri çekme için membran kanalları sağlamak ve hücreler arası etkileşim ve iletişimin ^2,3 sitelerdir Nanopodia. Bu özellikler hücresel kutuplaşma, çevre hücresel algılama, hücre hareket yolu ve yön tayini, ve hücreler arası etkileşimler sırasında F-aktin aksamını altında yatan mekanizmaları incelemek için eşsiz bir fırsat sağlayacak nanopodia anlamına birnd iletişimi.

Nedeniyle TMED oldukça hidrofobik doğa ve nanopodia ince ve kırılgan membranöz doğaya, özel bakım TMED ve nanopodia korumak için alınması gerekir. Nanopodia ve ortak laboratuvar yöntemlerle TMED çıkarılması yıkımı sadece altmış üç yayınlar 1986 ¹ yılında ilk keşif beri ve üzerine 100-300 mikron microdomains içinde TM4SF1 zenginleştirme bilgi eksikliği tamamlamak için TM4SF1 çıktı neden olası bir nedeni hücre yüzeyi, 2009 ^2, endotel hücrelerinde TM4SF1 raporu kadar.

Geleneksel immüno-lekeleme yöntemleri yaygın hücreleri düzeltmek ve hücreler ⁵ permeabilize% 0.1 veya daha yüksek bir Triton X-100 konsantrasyonu kullanmak için, etanol, metanol veya aseton gibi organik çözücüleri kullanırlar. (I) 37 ° C% 4 PFA kullanımı ve 37 hücreleri düzeltmek: Burada anlatılan çalışmalar TMED ve nanopodia ortaya çıkarmak için geleneksel yönteme üç büyük değişiklikler uygulanmıştır76, C kuluçka makinesi, (ii) oda sıcaklığında nazik bir PBS yıkama uygulanır, ve (iii) Triton X-100, Triton X-100,% 0.03 'den daha fazla özü gibi, primer antikor ilave edilmeden önce hücreler nüfuz edilebilir kılınması için sadece kısa bir süre için en az% 0.03 oranında kullanmak TM4SF1.

Tüm tetraspanins hücre zarı ⁶ mikro bölgesini oluşturur ve bazı endotelyal ve tümör hücrelerine ^2,3 in TMED ile colocalize. CD9, CD81 ve CD151 gibi tetraspanins her yerde bulunan bir ifade olarak, burada açıklanan boyama protokolü nanopodia fonksiyonunun çalışmalar için TM4SF1 olmayan pek çok farklı hücre tipleri için uzatılabilir.

Protokol

1.. Kollajen Kaplamalı Camlar Diskte Hücre Kültürü

1. Bir cam kavanoz (4 oz) ve diskler sterilize etmek otoklav içinde yer cam disk (çapı 12 mm).
2. Bir 50 ml Falcon tüpü içinde 25 ml% 70 etanol koyun ve bir hücre kültürü kaputu yerleştirin. Çözeltinin seviyesi 20 ml düşene kadar bu çözelti, birden çok kez tekrar edilebilir.
3. Cam disk kolu için kullanmadan önce, 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde bir ekstra ince nokta ile keskin bir forseps yerleştirin.
4. Dikkatlice tüp dışında forseps kaldırmak ve kapağını kapatın, daha sonra yavaşça 2 dakika boyunca hava ile kuruması için tüpün üstüne etanol tedavi forseps yerleştirin. Forseps ucu kaputu şey dokunmak izin vermeyin.
5. Cam kavanoz dışında bir steril cam diski kapmak ve 24-yuvalı hücre kültürü plakasının bir kuyu içine yerleştirmek için steril forseps kullanın. Kuyu istenen sayıda diskler ile doldurulan kadar tekrarlayın.
6. Bovine kolajen çözeltisi 500 ul (koyun50 ng / ml) bir cam disk içeren ve en az 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 _CO2, hücre kültürü yetiştirme cihazı yerleştirmek her kuyuya. Daha uzun bir inkübasyon hiçbir zararı yoktur.
7. Hasat HUVEC (insan göbek damar endothelial hücreleri) ya da daha önce PC3 tripsinizasyon ile 150 mm hücre kültürü plakasında yetişen ve tam kültür ortamı kullanılarak tripsin aktivitesini bloke edilmiştir (prostat tümör hücreleri). Bir 15 ml Falcon tüpü içine hücreleri toplamak.
8. Hücre sayısını ve canlılığı% 90 daha büyük olduğundan emin olun.
9. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 x g santrifüj ile hücreler Pelet Süpernatant kaldırmak.
10. 10 ⁵ hücre / ml olacak şekilde seyreltmek hücreleri için kültür ortamı kullanın. Hücreleri buz üzerinde yerleştirin.
11. Hücre kültürü kaputu kolajen ve yavaşça aspire cam diskler kolajen ile kaplanmış edildiği de her bir hücre süspansiyonu, 500 ul koyun. 24 oyuklu bir plaka içerisinde, 5 x 10 ⁴ hücre / çukur% 60 conf verecekHUVEC ve PC3 hücreleri için% 30 akma luency. Not: yüksek hücre yoğunluğu için daha fazla hücre süspansiyonu ekleyin.
12. Kültür, 37 ° C, 1 saat, 2 saat, 4 saat, 6 saat, ya da nanopodia faaliyetleri ve hücre geçişi izlemek için 24 saat boyunca% 5 _CO2 inkübatörü içinde hücreler. Tipik olarak, hücreler ilk 30 dakika içinde cam disk eklemek, daha sonra Polarize ve ilk bir saat içinde göç başlar ve ilerleyen saatlerde arası etkileşimleri ve hücre bölünmesini gerçekleştirin.

2. Hücre Fixation

1. Her iyi hücrelerini düzeltmek için 500 ul% 4 PFA (paraformaldehid) ihtiyacınız olacak. Ticari olarak üretilen ya da taze% 4 PFA kullanılabilir yapılmış ya. Hazırlanan kuyu sayısına göre gerekli PFA miktarını hesaplayın ve bir 15 ml Falcon tüpüne PFA yerleştirin. DİKKAT: paraformaldehıt bir kanserojen olabilir.
2. 37 ° C inkübatör yerinde zaten bir strafor stand şahin tüp koymak. Savaş için 30 dakika boyunca inkübatör tüpü terk37 ° C'ye kadar PFA m
3. Kültürü kaputu bir ısıtma pedi yerleştirin ve açın.
4. 24-iyi hücre kültürü plakası ve kuluçka prewarmed PFA çıkarın ve ısıtma yastığı üstüne yerleştirin.
5. Bir kuyudan orta aspire bir elinizi kullanın ve hemen sonra hafifçe iyi kenarı boyunca kuyuya 500 ul PFA slayt için diğer elinizi kullanın. Kolay aspirasyonu için, o açıyla istikrarlı olduğunu böylece Strafor standı dayayarak, yaklaşık 45 ° de kültür plaka eğin. Bu, aspirasyon ile kültür içinde hücreleri bozmadan oyuğuna PFA çözeltisi eklenerek kolaylaştıracaktır. Bu hücre faaliyetleri, orijinal hücre yapısını korumak için en önemli adımdır.
6. Bir cam disk ile tüm kuyuları PFA almış kadar işlemi tekrarlayın. Not: kuyudan önceden varolan çözüm değiştirmek için gereken tüm adımlar aynı aspirasyon prosedürleri uygulayacaktır.
7. 5 dakika boyunca 37 ° C 'de plaka koyun.
8. Geri kültürü kaputu plaka almak ve adım 2.5 açıklandığı gibi Strafor karşı yatırın. Nazikçe bir toplama tüpüne kuyudan PFA aktarmak için bir elinizi kullanın; hemen sonra da en az 500 ul oda sıcaklığında PBS yerleştirmek için diğer elinizi kullanın. Tüm çukurlar yıkanıp sonra, geri ve de her bir kere daha PBS yıkama tekrarlayın. Tehlikeli atık kabı içine toplanır PFA boşaltın.
9. PBS,% 2 fetal sığır serumu eklenerek ICC bloke tamponu hazırlayın. % 0.04 sodyum azid (% 20 stok çözeltisinden seyreltilmiş), bir koruyucu madde olarak ilave edilir. DİKKAT: Sodyum azid zehirli bir bileşiktir. Tampon bakteriyel kontaminasyon olmaksızın uzun bir süre için 4 ° C'de saklanabilir.
10. Yine de her iyi PBS kaldırmak için aspire ve hemen sonrasında ICC engelleme tampon 500 ul ekleyerek aracılığıyla döngüsü bir kez, bir stand karşı eğik kültür plaka ile. Hücreler artık immunofloresan boyama için hazır bulunmaktadır. Gerekirse,Sabit hücre TM4SF1 proteinin önemli bir kayıp olmaksızın bir hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında saklanır.

3. Nanopodia arasında TM4SF1 İmmünofloresan boyanması

1. Her bir oyuğa olarak, Triton X-100% 0.01 ihtiva eden yeni bir bloke edici tampon ile 500 ul bloke edici tampon ICC değiştirmek ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. Hücre zarlarından TM4SF1 kaldırmak gibi% 0.03 Triton X-100 daha yüksek kullanmayınız. Boyama hemen başlamak için hazır olup olmadığını PBS adım 2.10 ile yıkanmış hücrelerini doğrudan Triton içeren engelleme tampon taşınmış olabilir.
2. ICC bloke etme tampon maddesi içinde 0.5 ug / ml anti-birincil TM4SF1 (ya da anti-CD9) antikoru seyreltin.
3. Her bir oyuğa olarak, ICC/0.01% Triton tamponunu çıkarın ve anti-TM4SF1-antikor çözeltisi 300 ul ile değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe ya da 4 ° C'de bir gece bekletin
4. En az 500 ul PBS ile daha iyi her yıkayın. 3x tekrarlayın; Her zaman le de vermekinkübasyon süresi ast 5 dak.
5. Ikinci bir antikoru ve phalloidin çözelti hazırlayın ICC bir Alexa 488 etiketli eşek anti-fare ikincil antikoru (2 ug / ml nihai konsantrasyon) 1000 kat dilüsyonu ve Phalloidin 1000 x seyreltme (50 ng / ml nihai konsantrasyon) kullanılarak, blokaj tamponu.
6. PBS çıkarın ve her bir oyuğa, ikincil antikor ve phalloidin çözeltisi 300 ul ilave edin ve 2 saat boyunca inkübe ya da 4 ° C'de bir gece bekletin
7. Yıkama başına en az 5 dakika inkübasyon ile PBS yıkama adımları tekrarlayın. Son yıkamadan olarak, 1 saat boyunca PBS içinde de her bırakın.
8. Bir cam slayt üzerinde anti-solmaya montaj medya tek bir damla (~ 10 ul) bırakın.
9. Bend sert bir yüzeye hafifçe bastırarak şırınga iğnesi, 90 ° 19 G 1 ½ ucu. Bükülmüş iğne tutun ve yavaşça iyi bir cam diski yukarı kaldırın, ve keskin forseps kullanarak diski kavramak için diğer elinizi kullanın tek bir elinizi kullanın.
10. Cam diski Turn &# 160; cam slayt hücre yan kişiyi montaj medya icar yüz aşağı. Yavaşça cam diski yerleştirin ve oda sıcaklığında karanlık bir yerde gece boyunca kurumaya bırakın.
11. Görüntü immünofloresans lekeli nanopodia devam, ya da -20 ° C'de slayt kutuda saklayın slaytlar Slaytlar -20 ° C'de birkaç ay boyunca görüntülenebilir kalacaktır

Sonuçlar

Adım 1 için:

(Örneğin HUVEC'e ve bu çalışmada kullanılan PC3 olarak) hücreler normal büyümek mümkün ise, hücreler numaralı seribaşı sonra, 30 dakika içinde kollajen kaplı disk takmak Polarize ve kısa bir süre sonra mobil olmak ve ileride kendi yolunu nanopodia uzatacak hareketin. Şekil 1A ve 1B, sırasıyla bir polarize ve çoğalan HUVEC. Şekil 2A, bir cep halinde polarize PC3 hücreleri sini göstermektedir.

Adım 2:

Tartışma

Nanopodia sıkıca TMED aracılığıyla Matris takmak ve ortamı duygusu ve hücreler arası etkileşimleri ^2,3 aracılık için polarize mobil hücreden fazla 100 mikron uzatabilirsiniz ince hücresel membran kanalları vardır. Bu yüzden sıkıca kalıntıları uzak hücre hamle olarak geride kaldığını matrix uymak Nanopodia (Şekil 1 ve 2). Nanopodia böylece bizi hücrelerin çevrelerini nasıl hissettiğinin çalışma ve hücre hareketin yolunu belirlemek için, izin ve nasıl gen ifadesi ya da ilaç ted...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cam diskler	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm çaplı
Cam kavanoz	Fisher Scientific	02-912-310	Sertifikalı Temiz Şeffaf Cam Düz Taraflı Kavanozlar, 4 oz
Cam slayt	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Düz Cam Mikroskop Slaytları
50 ml Falcon tüpü	BD Falcon	352070	50 ml yüksek berraklıkta polipropilen konik santrifüj tüpü, 16.000 RCF derecesi. Steril.
Strafor raflı 15 ml Falcon tüpü	Corning	430790	Corning 15 ml PP Santrifüj Tüpleri
Keskin forseps	Fisher Scientific	13-812-42	Diseksiyon Ekstra İnce Sivri Kıymık Forseps
24 oyuklu Hücre kültürü plakası	BD Bioscience	353047	24 oyuklu Hücre Kültürü Plakası
150 mm Hücre kültürü plakası	BD Bioscience	353025	150 mm hücre kültürü plakası
19 G 1 ve frak12; Şırınga iğnesi	BD Bioscience	309635	19 G 1 & frac12;
Etanol	Decon Laboratuvarları, Inc.	2701	Decon'un Saf Etanol 200 Korumalı
Kollajen çözeltisi	BD Bioscience	354249	Kollajen I, Yüksek Konsantrasyon, sıçan kuyruğu, 100 mg
Tripsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	%0.25 Tripsin-EDTA 1x
DMEM	Yaşam Teknolojileri	11965-092	DMEM yüksek glikoz (1x), sıvı, L-glutaminli, sodyum piruvat içermeyen
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Çözelti, pH 7.4
PFA (paraformaldehit)	Affymetrix	19943	PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Sığır Serumu
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Bazal Ortam 500 ml ve EGM-2 SingleQuot Kit Takviyesi & Büyüme Faktörleri
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3< / sub>	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Suda çözünür. % 4 stok çözeltisi ve çalışma konsantrasyonu% 0.4'tür.
Fare anti-insan TM4SF1 antikoru	Millipore MAB3127		Epitop, hücre dışı alanda
bulunur Fare anti-insan CD9 antikoru	BD Bioscience	555370	Epitop hücre dışı alanda bulunur
Alexa Fluor 488 Eşek anti-fare 2. antikor	Yaşam Teknolojileri	A-21202	Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Fare IgG (H + L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine konjuge Phalloidin
Anti-solmaya karşı montaj ortamı	Yaşam Teknolojileri	P-36931	ProLong DAPI %70 Etanol İçeren Altın Antifade Reaktifi
			17.5 ml etanol (200 kanıt) 7.5 ml çift deiyonize su
10x PBS (200 ml yapın)			20 ml 10x PBS 180 ml çift deiyonize su
%20 Triton X-100 (20 ml yapın)			4 ml Triton X-100 16 ml çift deiyonize su
%4 NaN3 (25 ml yapın)			1 g NaN3 25 ml çift deiyonize su
50 ng/ml PBS'de sığır kollajen solüsyonu (5 ml yapın)			50 &mu stok solüsyonu; g/ml (50 ml) 830 μ l Kollajen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Bloke Edici Tampon (50 ml)			49 ml PBS %2 FBS (1 ml ekleyin) %0.04 NaN3 (100 &mu ekleyin; l% 4 NaN < alt > 3 < / alt >)
ICC Engelleme Tamponu /% 0.01 Triton X-100 (50 ml yapın)			50 ml ICC Engelleme Tamponu 25 & mu; l% 20 Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Hücre kültürü davlumbazı	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Seri 60) Biyolojik Güvenlik Kabini
37 & derece; C,% 5 CO2< / sub> Hücre kültürü inkübatörü	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Su Ceketli İnkübatör
Isıtma yastığı	K & H İmalat	1020	K & H Lectro Kennel Serbest Polar Kapaklı Isıtmalı Ped (www.amazon.com)
Santrifüj	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Masaüstü Santrifüj
Hemositometresi	Sigma-Aldrich	Z359629	Parlak Çizgi Hemositometresi