Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi

Özet

Askorbat sadece son yıllarda ışık gelmiş, birçoğu hücre metabolizmasında çok önemli rol oynar. Burada, orta hacmi, hücre kültürü içinde hem de hücre içi ve hücre dışı askorbat belirlenmesi için özel ve pahalı olmayan bir mikro-tahlili tarif eder.

Özet

C Vitamini (askorbat) sadece son yıllarda ışık gelmiş birçoğu hücre metabolizmasında çok sayıda önemli rol oynar. Beyin askorbat homeostasis için çok önemli gibi görünen bir ilişki - Örneğin, beynin içinde, askorbat nöronlar ve komşu astrositlerden arasında askorbat bisiklet içeren bir nöroprotektif ve nöromodülatör şekilde davranır. Ayrıca, ortaya çıkan deliller güçlü askorbat klasik tanınır daha hücresel ve sistemik demir metabolizmasını düzenleyen bir ölçüde genişletilmiş bir role sahip olduğunu göstermektedir. Normal ve kuralsız hücresel ve organizma fizyolojisi askorbat ayrılmaz rolünün artan tanınması son derece pahalı uzman ekipman için gerek olmadan çalıştırılabilir orta verimlilik ve yüksek hassasiyetli analitik teknikleri bir dizi gerektirir. Burada, orta performans için açık talimatlar, bo tayini için özel ve nispeten pahalı olmayan mikro deneyi sağlarHücre kültüründe th içi ve hücre dışı askorbat.

Giriş

1928 1934 ¹ yayımlanan gazetelerde askorbik asit (C vitamini), ve uzun aranan Albert Szent-Györgyi tarafından "anti-iskorbüt hastalığı faktörü", ve diğerleri olarak kimlik kimyasal doğanın keşfi tarihinin önemli olaylar vardı biyokimyası. Nitekim, bu keşifler, Szent-Györgyi 1937 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandıktan. Hayvan ve bitki fizyolojisi askorbat rolleri giderek genişleyen paketi, yanı sıra insan sağlığını katkıda aktif bilimsel konular olmaya devam soruşturma ve tartışma.

L-askorbat bol miktarda fizyolojik bir indirgeme ürünü olan ve memeli sistemlerde enzim kofaktörü ve kollajen hidroksilasyon, karnitin ve norepinefrin biyosentezinin, tirosin metabolizma ve peptid hormonu amidasyonu ² içeren çok iyi tanımlanmış bir enzimatik reaksiyonlar katkıda bulunur. Intriguingly, montaj evidence askorbat gibi hidroksilasyon ile ilgili prolil ve asparaginil hidroksilazları gibi diğer demir bağımlı dioxygenases, uyarıcı ve hipoksiyayla tetiklenebilen faktörleri (HIFs) 1α ve ³ 2α hedeflenmesine bir rol oynadığını göstermektedir. Yeni bir rapor, askorbat, nükleer hidroksilazları, Jumonji C (JmjC) etki proteinlerinin teşvik etmedeki aktivitesi ile kromatin demetilasyonunu etki yoluyla T-hücresi olgunlaşmasında bir rol oynadığını göstermektedir; son olarak adı geçen tam aktivitesi ⁴ askorbat için gerekli gibi görünmektedir. Gerçekten de, askorbat ve bu tür enzimlerin uyarılması HIF ve kollajen hidroksilazları ve askorbat ile uyarılmaya benzer bir mekanizma ile meydana geldiği görülmüştür. Diğer klasik etkileri arasında, askorbat, suda çözünür zincir açan kök sürükleyici ⁵ gibi hücresel antioksidasyon ve plazma membranının geri dönüşüm önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır α-tokoferol w, ⁶ α-tokoferoksil radikalin indirgenmesi ile (vitamin E)hich membran lipid peroksidasyonu ⁷ karşı korunması önemlidir. En memeliler D-glikozdan, askorbat de novo hepatik sentezinin sahip olmasına rağmen Önemli bir şekilde, yüksek primatlar, kobay ve bazı bitler vitamin ⁸ besin kaynağa bağlıdır. Bu gulo geninin inaktivasyonu nedeniyle, etkilenmemiş memelilerde en orthologues ^9-13 oksidaz enzim,-γ-lakton gulono kodlar. Bu enzim, glukoz ^{13 ila} askorbat biyosentezindeki son reaksiyon için gereklidir.

Insanlarda bağırsak lümeninden taşıyıcı aracılı emme sonra, askorbat olarak dolaşım sistemiyle vücutta dağıtılır. Vitamin tipik haliyle (konsantrasyonlar tipik olarak geçerli olan plazma konsantrasyonu ile benzer olan eritrositlerin istisna ile) hücre milimolar konsantrasyonlarda mikromolar ve konsantre onun indirgenmiş formu bulunursaEn çok hücre dışı akışkanlar içinde ^14,15 entrations (örneğin, 50-200 uM).

Fizyolojik koşullar altında, genellikle askorbat askorbil serbest radikali tersine çevrilebilir bir elektron oksitlenme geçirmektedir (AFR, aynı zamanda ya da monodehydroascorbate semidehydroascorbate olarak da bilinir). AFR geri askorbat için hızla bir elektron enzimatik azalma yokluğunda, nispeten kararlı bir radikal ¹⁶ iken, iki AFRS bir askorbat ve bir dehydroascorbate (DHA) ^9,13,17 için dismutate daha fazla olabilir. Hücresinin iç içinde, askorbat, DHA iki elektron oksidasyon ürünü, hızlı bir şekilde ve glutation-NAD (P) H-bağımlı enzimatik ve enzimatik olmayan reaksiyonları ¹³ geri askorbat indirgenebilir.

Bu klasik demir metabolizması askorbat tek önemli rolü olmayan heme demir ¹⁸ diyet emilimini teşvik etmek olduğunu kabul ederken, biz ve diğerleri kanıt s sağladıtrongly bu askorbat düşündüren bu metal metabolizmasında büyük ölçüde genişletilmiş bir rol oynar. İlk olarak, askorbat-dolu hücreler tarafından salınır askorbat hücreleri ^19,20 ile transferrine bağlanan demir alımını modüle edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır ve çok son kanıtlar askorbat da transferrin bağlı demir alımını modüle olduğunu gösterir gibi görünmektedir hücreleri ²¹ ile, ve ikinci bir ana fizyolojik demir alım yol ²² karşılık gelir.

Askorbat memelilerde ^23,24 normal merkezi sinir sistemi fonksiyonu için gereklidir. Birlikte adrenal korteks, hipofiz bezi, timus, retina ve korpus luteum ile, beyin diğer vücut dokularında ^23,25-27 askorbat göreli yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Buna ek olarak, ^28,29 ve nöron astrosit-benzeri hücreler glutamata ³⁰ hem de maruz ascorbat hücre dışı alanı, içine askorbat salınmasını tetiklemek için bilinire glutamat kaynaklı nöronal disfonksiyon ³¹ karşısında nöronların korunması için düşünülmektedir. Astrositlerden glutamat kaynaklı askorbat serbest mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte, son zamanlarda astrocyte glutamat ve aspartat taşıyıcı (Glast tarafından glutamat alımı nedeniyle şişlik hücrenin katılımını gösteren kanıt sağladı, aynı zamanda bilinen uyarıcı amino asit taşıyıcı izoformdur 1 [EAAT1 ] insanlarda) ve bu askorbat ³² gibi küçük organik anyonları geçiren hacim duyarlıdır osmolite ve anyon kanalları (VSOACs) bunun sonucunda aktivasyonu. VSOAC oluşumunda rol plazma membran borularının ^33,34 moleküler kimlikleri tespit edilmesi gerekmektedir.

Birçok deneyler, spektrofotometrik fluorometrik tahliller ve kromatografik ^35,36 dahil biyolojik numunelerde askorbat tayini için geliştirilmiş olmasına rağmen, seçicilik, hassasiyet, interferenc çok değişkenlik mevcutturkimyasal madde, etkili lineer aralığı ve son nokta analitin stabilite, e. Ayrıca, tahlil seçimini de etkileyecektir diğer önemli faktörleri hız, kullanım kolaylığı ve bu gibi bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) aygıtı nispeten özel ekipmanlara erişimi.

Burada kültürlenmiş hücrelerde hücre içi askorbat belirlenmesi yanı sıra, kültürlenmiş hücrelerden askorbat-efflux tayini için ayrı bir tahlili için basit ve son derece spesifik mikro kolorimetrik deneyi mevcut. İkinci tahlil nedeniyle sodyum-bağımlı askorbat nakliyecilere (SVCTs) tarafından yayımlanan askorbat hızla yeniden alım hücrelerden askorbat serbest ardı sorunu aşmak için amaçlamaktadır. Bu yöntemlerin her ikisi de önceki yayınlarda ^{19,20,32,37,38} bazı ortaya çıkmış olsa da, bu el yazması talimatları ve etkin yürütülmesi için kurallar açık bir kümesi sağlar.

Protokol

1.. Kültür Hücreleri Hücre içi askorbat belirleyin

1. Hücre kültürü ve hasat
   1. Standart kültür prosedürler ^19-21,32,38 kullanılarak süspansiyon (örneğin insan eritrolösemi, K562) veya yapışık hücreleri (primer astrositlere) büyür. Not: hücreler, askorbat içeren askorbat ya da askorbat veya DHA ile ^33,39 gibi kültür hücreleri yük sağlamak.
2. Bir askorbat içeren hücresel özü oluşturun
   1. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanmış ve süspansiyon buz gibi soğuk hücre Permeabilization Tamponu [CPB 450 ul ile yapışan hücreler bir uygun sayıda inkübe et; PBS içinde% 0.1 (ağ / hac) bir saponin; 4 ° C]. Not: deneysel olarak son kullanıcı tarafından (aşağıya bakınız) deneyinin lineer aralığında bir absorbans değeri elde etmek için gerekli olan hücre sayısını belirler. Not: doku ekstreleri de (daha fazla bilgi için Tartışma) kullanılabilir.
   2. Agita10 dakika boyunca buz üzerinde te ayrıntılı hücreleri hücre liziz sağlamak.
   3. Soğutulmuş bir mikrosantrifüj (4 ° C) 5 dakika için 16,000 x g'de ham lizat santrifüj ile hücre artıklarının çıkarılması ile berraklaştırılmış askorbat ihtiva eden hücre içi özü oluşturun.
   4. Her bir numune dikkatli bir şekilde 4 x 100 ul alikotları kaldırmak ve tek ya da 25 ul / oyuk 45.5 U PBS ("AO-"), 25 ul / ya da ihtiva eden bir 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki kuyu yatay dizisine eklemek / ml PBS ("+ AO") L-askorbat oksidaz-(AO) stok çözeltisi. Not: Bu (aşağıya bakınız) standartlarının hazırlanması paralel olarak yapılmalıdır.
3. Askorbat standart eğri yapı (her bir deney için yeniden inşa edilmesi gerekir)
   1. Buz soğukluğunda PBS içinde 10 mM askorbik asit, bir stok çözelti hazırlayın. Not: spektrofotometrik olarak 1 olan bir kuartz küvet kullanılarak askorbatın konsantrasyonu doğrulama265 nm'de (yok olma katsayısı = 14.5 mM ^{-1 cm-1) 40} cm yol uzunluğu.
   2. Dikkatle 0 ve 20 mcM arasında askorbat standartların bir dizi hazırlamak.
   3. Adım 1.2.4 paralel olarak, dikkatli bir şekilde, her bir standart 4 x 100 ul alikotları çıkarın ve PBS ("AO-") ya da 25 ul / yuva ihtiva eden bir 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki kuyu yatay dizisine eklemek PBS AO ("+ AO") 45.5 U / ml stok solüsyonu. Not: Yukarıdaki askorbat standartların 100 ul askorbat 0-2 nmol içerir. Lütfen dikkat, AO amacı azalma ferricyanide olmayan askorbat redüktantların katkı için kontrol etmektir.
4. Hücre içi askorbat belirlemek - Adım 1: seçici askorbat kaldırmak ve kantitatif ferrisiyanit ile askorbat okside
   1. Orbital folyo ile plaka kaplama ile karanlık bir ortamda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 550 rpm'de 96 oyuklu plaka karıştırın. Not: Tüvey DHA'ya "+ AO" kuyularda tüm askorbat okside gerekir. "-AO" kuyuları etkilenmemiş olmalıdır.
   2. Tüm oyuklara PBS içinde (burada "ferrisiyanür" olarak anılacaktır) 3.5 mM potasyum ferrisiyanür 50 ul ekle. Nihai [ferrisiyanür] = 1 mM. Not: a multipipettor kullanın.
   3. Orbital karanlıkta başka bir 5 dakika için oda sıcaklığında 550 rpm plaka karıştırın. Not: Bu adım okside askorbat 1 molekülü başına azaltılmış ferrisiyanit 2 molekülünün bir birleşme oranında askorbat ile ferrosiyanür için ferrisiyanür azalmaya neden olmalıdır.
   4. Hemen% 50 (v / v) asetik asit ve% 30 (a / h) trikloroasetik asit (TCA) ihtiva eden bir yeni inşa çözeltisi 25 ul ekle. Not: a multipipettor kullanın.
5. Hücre içi askorbat belirlemek - Adım 2: quantitate Ferrosiyanat miktarı ³⁷ oluşmuş
   1. E ferrosiyanür belirlenmesi çözüm ³⁷ 100 ul ekleyiniyi ach. Not: bir çalışma çözeltisi kullanımdan hemen önce yapılmalıdır: 3 M Na-asetat (pH 6.0) içinde 2 ml; Buzlu asetik asit (~ 17.4 M asetik asit), 0.5 mi; 0.2 M sitrik asit ve 2 mi; 0.1 M asetik asit içinde 3.3 mM _FeCl3 2 mi; 30 mM ferene-S 1 ml. Bu çalışma çözeltinin son hacmi 7.5 ml olmalıdır.
   2. Orbital oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 550 rpm'de karanlıkta plaka karıştırın.
   3. 593 nm'de kuyuların absorbans değerleri oku (örneğin Fe (II) (ferene-S) ₃ kompleksin absorbans maksimum).
   4. (Adım 1.3 'her bir örnek için -' AO 'kuyuları ve daha sonra askorbat standart eğriden interpolating ilk olarak karşılık gelen' + AO 'kuyular için bir _{593 nm} değerleri çıkarılarak milyon hücre başına nmol askorbat gibi hücre içi askorbat miktarını hesaplayın .) Standart eğri oluştururken, ascorb miktarına karşı her bir standart için, bu "fark değeri" arsaOyuk başına yedi.

Kültür Hücreler Askorbat efflux-2. Belirlenmesi

1. Hücre kültürü ve hasat
   1. (Adım 1.1) yukarıdaki gibi süspansiyon veya yapışık hücreleri büyümek. Not: En iyi sonuçlar için süspansiyon ve yapışık hücreleri ile 24-iyi bir plat formatında aşağıda tahlil yürütmek.
   2. Süspanse süspansiyon hücreleri ya da ya da, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın, önceden ısıtılmış HEPES tamponlu salin çözeltisi 400 ul, yapışkan hücreler kaplamak ve 5 mM D-glukoz içeren, kuyularda (HBS / D, pH 7.3, 37 ° C) Bir 24-yuvalı plaka. Incelenecek her bir 24-çukurlu plaka üzerinde belirli bir hücre içermeyen çukurlara HBS / D aynı hacim. Not: ikinci (aşağıya bakınız) temel reaksiyon için hücre içermeyen kontroller olarak hizmet edecektir.

3.. Çıkış Askorbat miktarı belirleyin

1. Aşağıdaki stok çözeltileri önceden hazırlıklı olmalıdır: 120U / ml AO HBS / D (taze hazırlandı); 2.4 mM Ferene-S HBS / D; 120 uM _FeCl3 ve HBS / D (daha fazla konsantre stok çözümleri hemen hazırlamak) 600 mcM Na-sitrat.
2. Ferrireduction reaksiyonu (her son hacim 600 ul olmalıdır) başlatmak için, daha önce HBS / D 400 ul ihtiva eden tek tek oyuklara reaktiflerin aşağıdaki miktarlar ekleyin:
   1. , Üç kopya halinde kuyu eşleştirilmiş için AO (120 U / ml) ya da HBS / D 50 ul ekle. Nihai AO konsantrasyon 10 U / ml olmalıdır. Not: Etiket olarak kuyu eşleştirilmiş "- AO" ve "+ AO".
   2. 37 ° C'de 5 dakika boyunca hafif bir orbital karıştırma ile plakaları karıştırın
   3. Tüm oyuklara 2.4 mM ferene-S 50 ul ekle. Nihai ferene-S konsantrasyonu, 200 uM olmalıdır. 37 ° C'de 5 dakika boyunca, yukarıdaki gibi plakaları karıştırın
   4. Taze hazırlanmış 120 uM ferrik sitrat 50 ul ekle. Nihai demir ve sitrat konsantrasyonları 10 mcM demir ve 50 mM sitrat olmalıdır. İyice karıştırın.
3. Üç üçlü kontrol kaplan olarak, üstte uzanan orta aspire ve% 0.1 saponin içeren 600 ul HBS / D ekleyin. Not: Bu (aşağıya bakınız) paralel olarak yapılacak bir laktat dehidrojenaz (LDH) salım deneyi için "% 100 hücre liziz" kontrol grubu olarak hizmet edecektir.
4. 37 ° C'de karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe
5. Askorbat-akış deneyinde sonunda, hızlı bir şekilde her bir oyuğa 500 ul aspire ve uygun bir şekilde, bir 24-çukurlu plaka gözenekleri içinde etiketli ekleyin. Not: süspansiyon hücreleri için, ilk olarak 4 ° C'de santrifüj ile Hücreleri çıkarmak
6. 96 oyuklu bir plakaya süpernatan 300 ul hacimde ilave edin ve daha sonra 593 nm'de okundu.

Hücre dışı Askorbat 4. Belirlenmesi

1. 593 nm'de kuyuların absorbans değerleri okuyun.
2. Hücre içi askorbat tayini için tarif edildiği gibi mg protein başına (ya da milyon hücre başına) nmol askorbat gibi hücre dışı askorbat miktarını hesaplayınAdım 1.5.4 'te. Not: askorbat serbest hücre içi askorbat ile sınırlı değildir, böylece son kullanıcının koşullarını optimize etmek gerekir.

LDH Release 5. Belirlenmesi

1. Her bir numunenin hücre dışı çözeltinin geri kalan 200 ul hücre liziz boyutunu belirlemek için bir LDH salma tahlili ^32,41 yaparlar. Not: toplam salınabilir LDH% olarak hesaplamak. % 0.1 saponin ile muamele edilmiştir örneklerinden ayrılabilir LDH belirler.

Sonuçlar

Kültür Süspansiyon hücreleri içinde hücre içi Askorbat belirlenmesi

İlk deneyde (Şekil 1) 'de, hücre içi askorbat, önceden yayınlanmış bir prosedüre göre ³⁷ Ferrosiyanat son derece hassas saptaması kullanılarak, ferrosiyanür için ferrisiyanür (örneğin AO duyarlı) indirgeme askorbat-özgü ardından, tespit edilir. Askorbat tespiti ferrosiyanür ile demir ferrik demire indirgenmesi, ardından ferrosiyanür için ferrisiyanür askorbat bağımlı azalma, tarafından üreti...

Tartışma

Bu yazıda, kültürlenmiş hücrelerde hücre içi ve hücre dışı bölmelerden türetilen askorbat tayini için iki hızlı, spesifik ve nispeten hassas mikro kolorimetrik tahlilleri mevcut. Tahliller, standart laboratuar ekipmanları ve reaktifler erişim tamamlanabilir. Deney için gerekli olan sadece orta derecede pahalı reaktif L-askorbat doğru analit özgüllük yüksek derecede kazandırmaktadır olarak önemlidir AO vardır. Tahliller, ya da süspansiyon hücreleri (örneğin, K562) ya da yapışık hüc...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nunc 96 kuyulu düz tabanlı plakalar	Thermo	269620	Herhangi bir düz tabanlı 96 kuyulu plaka kullanılabilir
Soğutmalı tezgah üstü mikrosantrifüj	Eppendorf	5415D	Soğuk bir odadaki sıcaklığa dengelenmiş, soğutulmamış bir mikrosantrifüj de kullanılabilir
Soğutmalı tezgah üstü santrifüj	Eppendorf	5810R	Döner kova
Bio-Rad Benchmark Plus Mikroplaka Spektrofotometresi	Bio-Rad		593 nm'de okuma yapabilen herhangi bir mikroplaka spektrofotometresi kullanılabilir ve tavsiye edilir. Filtre tabanlı bir plaka okuyucu kullanılıyorsa, mümkün olan en yakın dalga boyunu seçin ve standart eğri yöntemini kullanın.
Ependorf MixMate (mikroplaka orbital karıştırıcı)	Eppendorf		Bu çok yönlü ve güvenilir bir mikroplaka karıştırıcıdır ve bu tahliller için çok iyi çalışır
Genel amaçlı tamponlar
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4
MOPS tamponlu salin (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glukoz (MBS/D)
HEPES tamponlu salin + 5 mM D-glukoz (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2 boğa; 2 H < alt > 2 < / alt >O, 0.8 mM MgSO4< / alt > ve boğa; 7 H2O, 5 mM D-glikoz, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Hücre geçirgenlik tamponu (CPB; PBS'de %0.1 saponin)
Genel kimyasallar
L-askorbik asit veya sodyum L-askorbat	Sigma-Aldrich		En yüksek saflıkta müstahzarlar elde edilmelidir
Dehidro-L-askorbik asit (DHA) dimer	Sigma-Aldrich	30790	Sulu çözeltiler teorik olarak mol DHA dimer başına 2 mol DHA monomeri verir
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	DMSO veya etanolde hazırlanan stok çözeltileri
Askorbat oksidaz (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Stok çözeltileri (120 U / ml) PBS veya MBS'de hazırlanabilir ve daha sonra alikotlarda dondurulabilir
Potasyum ferrisiyanür (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihidrat
Feren-S (3- (2-Piridil) -5,6-di (2-furil) -1,2,4-triazin-5 & asal;, 5 & asal; &asal;-disülfonik asit disodyum tuzu)	Sigma-Aldrich	92940
Sodyum L-glutamat	Sigma-Aldrich
L-glutamin	Sigma-Aldrich
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	% 0.1 stok çözeltisi hazırlayın
Hücre içi askorbat tayini deneyi
3 M sodyum asetat (pH 6.0)
Buzlu asetik asit
0.2 M sitrik asit
3.3 mM FeCl3 0.1 M asetik asit
30 mM feren-S
%50 (h/h) asetik asit + %30 (a/h) trikloroasetik asit (TCA)
Askorbat-akış deneyi
(120 U/ml)
2,4 mM feren-S, 0,6 mM sodyum-sitrat
			içinde 0,12 mM FeCl3