Method Article

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

DOI:

10.3791/51339

⸱

April 10th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Team Alzheimer & Tauopathies, Jean-Pierre Aubert Research Centre, Inserm UMR 837, 2EA 4308-Department of Reproductive Biology-Spermiology-CECOS, CHRU-Lille, 3EA2686-Laboratorie d'Immunologie, Faculté de Médecine - Pôle Recherche, 4Department of Neurology, CHRU-Lille

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki boyutlu jel elektroforezi (2DE) potansiyel olarak farklı fizyolojik veya patolojik durumlar ile ilgili proteomdaki değişiklikleri ortaya çıkarmak için güçlü bir araçtır. Temel olarak, bu teknik, SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile bir birinci aşamada, izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması, ve ikinci olarak, moleküler ağırlıklarına göre dayanmaktadır. Bu raporda insan post-mortem ve fare beyin dokusu az miktarda için optimize edilmiş bir numune hazırlama protokolü tarif edilmiştir. Bu yöntem, hem iki boyutlu, floresan fark jel elektroforezi (2D-DIGE) ve mini 2DE immünoboyama gerçekleştirmenizi sağlar. Bu yaklaşımların kombinasyonu tek bir kütle spektrometresi algılama ile uyumluluk için kendi ifadesi sayesinde yeni proteinler ve / veya protein değişiklikleri bulmak için değil sadece sağlar, aynı zamanda işaretçileri doğrulama yeni bir fikir. Böylece, mini 2DE sonrası belirlemek ve doğrulamak için batı lekeleme izin birleştiğinde-Translasyonel modifikasyonlar, protein katabolizma ve farklı koşullar ve / veya tedaviler arasında niteliksel bir karşılaştırma sağlar. Burada, bu tür amiloid beta-peptidi ve alfa-sinüklein olarak AD ve Lewy vücut demans bulunan protein agrega bileşenlerinin çalışma için bir yöntem sağlar. Önerilen yöntem, böylece proteomun analizi için uyarlanabilir ve çözünmeyen proteinler, çok insan beyin dokusu ve farenin modelleri çıkarmak. Buna paralel olarak, nörodejeneratif hastalıklar gibi olası yeni biyolojik belirteç ve terapötik hedefler yer moleküler ve hücresel yollarının çalışması için yararlı bilgiler sağlayabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zihinsel ve nörolojik bozukluklar hastalık küresel yükünün% 13 temsil eden, patofizyolojik mekanizmaları, risk faktörleri ve prodromal biyomarkerler gibi yeni sorunlar 1 araştırılmalıdır. Bu amaç doğrultusunda, insan beyninin proteomiks çalışmalar fizyolojik hem de patolojik koşulları için değil, sadece hafıza, davranış, duygu ve örneğin nöronal plastisite gibi süreçlerde moleküler yolları ortaya çıkarmak için vazgeçilmez hale. Bu nedenle, hayvan modellerinin kullanımı ve daha özel olarak ise transgenik fareler, insan nörodejeneratif hastalıkların 2 etyolojisini taklit etmek mümkün olan geniş bir yelpazede getiriyor.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Homojenizasyon İnsan ve Fare Beyin Dokusu Toplam Protein Ekstraksiyon

  1. Beyin dokusu homojen hale getirilmesi. Bir (insan örnekleri için) potter cam veya (farenin örnekleri için) teflon homojenleştirici kullanılarak beyin dokusu% 10 (w / v), 8 M üre içinde, 2 M tioüre ve a / h SDS tamponu (UTS)% 1 homojenize. 60 Hz toplam doku parçalanması 13, 14 için 0.5 saniye başvuran bir ultrason jeneratörü ile 30 darbeler sonikasyon.
    1. Standart olarak BSA kullanılarak Bradford tayini ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Bu tampon çıkarma sürece lisatları Karbamilleme 15 önlemek için ısıtılmış fazla değil gibi bir boyut SDS-PAGE ile t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İdeal bir tampon proteinlerin% 100, özellikle membran-ilişkili veya hücre iskeleti proteinleri kurtarmak için var yana beyin dokusu üzerine Proteomiks zorlu kalır. Deneylerin ilk seti proteinin büyük bir panel kurtarmak sağlayan iki yaklaşım ile uyumlu uygun bir parçalama tamponu için arama üzerinde duruldu. Böylece, üç lizis tampon, en uygun olanı belirlemek için analiz edilmiştir. İlk olarak,% 1 ile 10 mM (w / v) SDS (Şekil 1A), ortak biyokimyasal ve moleküler biyoloji tampon Tris-HCl 20 ku.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinlerinin patolojik ifadesi değişiklikleri keşfetmek, biyomarkerler için arama ve farmakolojik hedefler için potansiyel yolların modülasyon neuroproteomics amaçları arasındadır 30 yaklaşır. Gelişmekte olan araçları ortasında, 2DE alan bir gelecek vaat expectative ekler. Bununla birlikte, bir konsensüs değişkenliği en aza indirmek ve deneylerde tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla ulaşılmalıdır. Bu fikrin doğrultusunda 2D-dige (Şekil 2) ve mono-boyutlu immunoblotting ile tam uyumlu insan.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bildirmek için herhangi bir çıkar çatışması var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma INSERM, Lille 2 Üniversitesi tarafından desteklenen, MEDIALZ, LabEx (mükemmellik laboratuvar program geleceğe yatırım) ve DISTALZ (Alzheimer hastalığı için bir Transdisipliner yaklaşım Yenilikçi Stratejilerinin Geliştirilmesi). FJ.FG anda ANR (Fransız Ulusal Araştırma Ajansı / NeuroSplice de Tau 01 Projet Deurne-2010-BLAN-1114) bir alıcı dostluk olduğunu, ancak bu çalışma JCCM (İspanya) bir hibe desteği altında da oldu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 NmoGE Healtcare25-8010-65
Immobiline DryStripGE HealtcarepH aralığı/boyutu IPG Tamponu fonksiyonunda
Referansı, pH XXGE HealtcareReferansı istenen pH aralığının fonksiyonunda
AMBERLITE IRN-150L KARIŞIK YATAK REÇİNE 1 GE Healtcare551797N
DRYSTRIP KAPAK SIVISI İMMOBILİN 1 * 1 lGE Healtcare17-1335-01
KİT KUTUSU IPG 1 * 1 KİTGE Healtcare28-9334-92Pasif rehidrasyon yapmak için plastik kutu 
MILLEX GS FiltreKırlangıç SLGS033SB
Criterion XT Prekast Jeller 13,3 x 8,7 cm (G x U)Ünitesini ayırmak için MW işlevindeBio-Rad
GE Healtcare11-0033-64
Ettan DALTsix Büyük Elektroforez SistemiGE Healtcare80-6485-08
OneTouch 2D Jel SpotPicker 1,5 mm Jel ŞirketiP2D1.5
Healtcare IPGphor III İzoelektrik Odaklama Referansı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
  2. De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
  3. O'Farrell, P. H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Extraction2D DIGEMini 2DE ImmunoblottingBrain ProteomeChloroform Methanol PrecipitationIsoelectric FocusingSDS PAGEWestern BlottingPost Translational ModificationsNeurodegenerative Diseases

Related Articles