Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Özet

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Özet

Şimdi de hücre ve doku mikro çevre tümör başlangıcı ve ilerlemesini etkileyen kritik düzenleyiciler olduğu bilinmektedir. Ayrıca, hücre dışı matris (ECM) in vivo kültür ve homeostazında hücre davranışını önemli bir düzenleyici olduğu gösterilmiştir. Iki boyutlu (2D) üzerindeki hücrelerin kültüre mevcut yaklaşım, hücreler ve bunların mikro arasındaki karmaşık etkileşimlerin rahatsızlık ve zarar plastik yüzeyler sonuçları. Üç boyutlu (3D) kültür tahlillerin kullanımı sayesinde, hücreye mikro-ortam etkileşimi için koşullar, in vivo benzer mikro kurulmuştur. Bu makalede, etrafındaki çevreye hücre istilası değerlendirilmesinde 3D kültür potansiyelini örnekleme, 3 boyutlu bir bazal membran protein matrisi içinde meme kanseri hücrelerinin büyümesini detaylı bir yöntem sağlar. Buna ek olarak, bu deneyler, 3D molekül ağırlığına işaret kaybını incelemek için potansiyele sahip görüşmekprosedürleri immün epitel morfolojisi Modüller düzenler. Bu çalışmalar meme kanseri yayılması için gerekli istilasını düzenleyen işlemler, içine önemli mekanik bilgilerini tespit etmek yardım.

Giriş

Göç ve bireysel ya da kolektif hücrelerin işgali kanseri iki özellikleridir ve kanser hücrelerinin ^1-4 metastatik yayılması için gereklidir. Metastaz başlatmak için kanser hücrelerinin yeteneği göç ve hücrelerin, temel zara inerek için invadopodia kullanarak komşu doku içine işgal etme yeteneğine bağlıdır. Invadopodia matris-bozucu proteazlar ⁵ salınmasıyla hücre dışı matrisin bozulmasını sağlayacak dinamik aktin zengin matris bozulması çıkıntılar bulunmaktadır. Kanser hücre istilası kanser hücrelerinin taşınması takip matrisin bozulmasını içerir ve bu, üç boyutlu (3D) matris ortamı ² bir yeniden eşlik eder. Bu durumda, matris boyunca nüfuz bir hücre şekli dönüştürmek ve hücre dışı matrisin (ECM) ² ile etkileşim gerekir.

Meme dokusu bütünlüğünün bakım sıkı controlle bağlıdırhücre-ECM ve hücre-hücre yapışma bağlantıları gen ekspresyonu ve epitel kutupluluğun bozulması etkilediğinden d, doku mimarisi, kanser ^6-10 başlamasından yol açabilir. Ancak, bu tür transwell oda tahlillerde ya da yara tırmığı tahlilleri gibi çok in vitro göçü ve istila deneyleri, iki boyutlu (2B) ve bu nedenle, bu hücreleri ve bunların bitişik çevre ^3,6,8,11-14 arasındaki karmaşık etkileşimler ihmal. Hücresel morfoloji varyasyonlar, hücre farklılaşması, hücre-matris adezyonlar ve gen ekspresyonu dahil olmak üzere önemli morfolojik ve fonksiyonel farklılıklar genel olarak ^2,6,8,11 deneyleri, 2 boyutlu olarak eksik 3B kültürlerinde hücrelerin kültürlenmesi ile tespit edilmiştir. Böylece, kliniğe ^6-10 temel araştırma çığır açan bulgularının daha iyi çeviri açan, 3D tahlillerin in vivo durumda bir daha fizyolojik yansıtan anlamlı yararlı edilir kullanır. Bununla birlikte, dikkat edilmelidir3D kültürlerin kullanımı ile kazanılan pek çok avantajı olmasına rağmen, bu model çeşitli hücre tiplerini içeren in vivo tümör mikro tüm karmaşıklığı yakalamak değildir. Ancak, bu 3 boyutlu modellere stromal hücreleri dahil etmek mümkündür (örneğin, fibroblastlar, lökositler ve makrofajlar) kanser hücre yapışması ve yayılması ^15-17 tümör stromal etkileşimlerin etkilerini incelemek için.

Örneğin laminin ve kolajen gibi ECM proteinlerinin mevcut olduğu zaman kültür meme epitel hücrelerinin en etkili şekilde büyür. Bu bilinen ile, ticari olarak temin edilebilir matris karışımı Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murin tümör elde edilmiştir ve Matrigel taban membran matrisi ^2,8 olarak bilinir. Bir takım teknikler taban membran matrisi ^2,8 3D koloniler olarak epitel hücreleri büyütmek için kurulmuştur. 3D bazal membran matrisi modeli habis ve habis olmayan meme hem hücre kurulması için etkilidirbüyümesi, in vivo ortamda ^18,19 meydana ne benzer. MCF10A hücreleri habis olmayan meme epitel hücreleridir. Temel zar matris içinde yetiştirildiğinde, bu hücrelerin normal meme hücrelerinin in vivo özellikleri sergiler ve hücre proliferasyonu, hücre polarizasyon ve lümen alanı ^8,12,20 kurmak için kontrol apoptoza uğrarlar. Ayrıca, 3D kültürlerde asinüsü oluşturan MCF10A hücrelerinin hücre çekirdeklerinin görünümünü daha yakından dokuda, meme epitelyal hücrelerinin kişilerce tek tabaka ²¹ içinde kültüre daha benzemektedir. Bissell'e ve arkadaşları tarafından yürütülen çalışmalar, habis hücreler, bir çok düzensiz fenotipi gösterdiğinden, bir laminin zengin bir ortamda yetiştirilen proliferasyon artan azaldığı habis meme hücreleri habis olmayan meme hücrelerinden ayırt edilebilir olduğunu ortaya koymaktadır için ilk hücreden hücre yapışması, artan mezenkimal markerlerin ekspresyonu ve invazif yapının sayısında bir artış meydana ^3,6,22.

Hücre ortamı anormallikleri tümör oluşumunu ²⁰ etkileyebilir. 3D kültür yöntemi etkili tümör hücreleri ve bunların çevreleyen çevre arasında meydana iletişimi çalışma ve ne kadar protein sentezleme etkenler, iletişim ^14,20,21,23 belirlemek için kullanılabilir. Bu ^makalede, analiz invaziv 3D kültürlerde MDA-MB-231 göğüs kanseri hücrelerinin büyümesini ve bir epitel işaretleyici laminin, hücre bazal membran ^18,19,24 bir bileşenini kullanarak epitel morfolojisi kaybını incelemek için detaylı bir yöntem sağlar ^25. Detaylı prosedürler, doğru ve tekrarlanabilir bir invazif kanser hücresi tarafından yıldız şeklinde (istilacı) yapısının oluşumunu ölçmek için ve bu MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 ya da T47D gibi ortak meme kanseri hücre hatları (sınırlayıcı değildir olanağı sağlar .) Bu nedenle, bu deney ile nasıl protein hücrelerde ekspresyonu ya da tedavi değerlendirmek için bir platform olarak hizmet edebilir pro-ya da anti-invazif bileşikler, bir ya da birden çok hücre tarafından, hücre dışı matris bozulması düzenler.

Protokol

Bazal Membran Matrix Meme Kanseri Hücreleri 1. Üç boyutlu Kültür (gömme Tekniği)

1. Taşıma Matrigel bazal membran matrisi: 4 ° C'de gece boyunca buz üzerinde Çözülme Taban membran matrisi düşük bir sıcaklıkta sıvı olan, ancak oda sıcaklığında katılaşır. Buz (Şekil 1A-B) ile ilgili bazal membran matrisi tutun.
2. Spiral bir desen (Şekil 1C) ve P-200 Pipetman ucunu kullanarak matris yayma vasıtasıyla taban membran matrisi 50 ul Konfokal No.1 cam alt çanak örtün. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için bazal membran matrisi yayılan dikkatli kullanın. Aynı şekilde, menisküs oluşmasını önlemek için, cam alt-çanak sınırlarına yakın matris yayılmasını önlemek. Deneyimsiz işleme bazal membran matris, daha sonra buz üzerinde olabilir çanak, P-200 Pipetman ve pipetler soğutulmuş halinde (alternatif olarak 4 ° C 'de bir buzdolabında gece boyunca bırakılmıştır.) Bu adım tekliflerkatılaşmadan önce bazal membran matrisi yaymak için ek süre. (Şekil 1D) katılaşması için temel zar matris sağlamak için en az 30 dakika boyunca (% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de) bir hücre kültürü inkübatöründe çanak (ler) yerleştirin.
3. Matris katılaşma geçirmekte iken, hücre% 70-80 konfluent 100 mm plaka trypsinize. Hücreler, plakanın kapalı kaldırma bir kez başladıktan sonra, tripsin (Şekil 1 E) etkisiz hale getirmek için,% 10 (v / v) cenin sığır serumu (FBS) içeren RPMI 1640 ortamında 10 ml bunları tekrar süspansiyon. Daha sonra 15 ml konik bir tüp (Şekil 1F) içine yeniden süspansiyona hücreleri aktarın.
4. Özel bir hücre kültürü santrifüj (Şekil 1G-H), 3 dakika boyunca 100 x g (konik bir tüp içinde mevcut olan) hücreleri dönerler.
5. Hücreleri aşağı bükülmüş edilirken, bir 1 ml mikrosantrifüj tüp (not içine kısım matris 50 ul: Her cam dipli çanak bir mikrosantrifüj tüpü tahsis edilir, bu nedenle, eğerDeney, 3 yemekler gerektirir o) 3 mikrosantrifüj tüpleri de gerekli olduğu takip eder ve daha sonra buz (Şekil 1 B) tüpü yerleştirin.
6. (Şekil 1 H) rahatsız pelet terk ederken, aşama 1.4 'dan konik tüp arasındaki orta aspire. Hücreler yeniden süspanse FBS ile desteklenmiş RPMI ortamı (Şekil 1J) 1 ml (aşağı bükülmüş olması).
7. Hücreler mikrosantrifüj tüpü içine, bir hemasitometre (Şekil 1 K), veya bir hücre partikül sayacı kısım 2.5 x 10 ⁴ hücreleri kullanılarak sayılmıştır ve 50 ul (Şekil 1 L) toplam hacim elde etmek üzere, uygun ortam kullanılarak kapalı üst kez.
8. 1:1 oranında 1.5 adım matris içeren mikrosantrifüj tüpü ile adım 1,7 (50 ul içinde 25,000 hücre) gelen hücreleri karıştırın; Nihai hacim 100 ul (Şekil 1 M) olacaktır.
9. S üzerine aşama 1.8 'den hücre karışımı: yavaşça matrisin 100 ul plakaadım 1.2 (Şekil 1N) den olidified bazal membran matris kaplı çanak. Hücreler bazal membran matris içine gömülü olması için bu sağlar.
10. (% 5 _CO2 ile 37 ° C) hücre kültür inkübatörü içine çanak (ler) aktarın ve matris sağlar: Hücre karışımı en az 30 dakika boyunca katılaşmaya.
11. Matris kez: hücre karışımı katılaşmış, çanak (Şekil 1O) için FBS-desteklenmiş RPMI medya 2 ml ekleyin ve deney (Şekil 1P) geri kalanı için saklanır inkübatör çanak geri almak.
12. (Bir tahlil için gerekli başına ya da, MDA-MB-231 hücreleri için, tahlilin süresi uzunluğu 5 gündür), 5 gün süreyle her gün ortam kullanın.
13. Bir ışık mikroskobu kullanılarak, diferansiyel girişim kontrast taban membran matrisi (Şekil 3A) içinde süspansiyon haline MDA-MB-231 koloni (DIC) görüntüleri alır. Görüntü 20 temsili alanlar 10X objektif seferde bir günBeş gün koloni morfolojilerinden (Şekil 3C) belirlemek için.
14. Hücre kolonisi Yıldızsı oluşumu (Şekil 3B) belirlemek için körü körüne görüntüleri analiz. A koloni hücrelerin sfero bir veya daha fazla çıkıntılar algılandığı takdirde yıldız şeklinde olduğu düşünülmektedir. Invazif stellate kolonilerin yüzdesini belirlemek elde edilen görüntünün başına hücre kolonilerinin toplam sayısına göre Stellate kolonilerin sayısını bölmek ve sonra her gün için 20 görüntülerin stellate kolonileri yüzdeleri ortalama için.

Şekil 1. Taban membran matrisi (gömme teknik), MDA-MB-231 göğüs kanseri hücrelerinin üç boyutlu bir kültür. AB) çeker ocak içinde gerçekleştirilen deney kurulumu () kaplanmış cam tabanlı bir çanak. ° C) iyi bir şematiktaban membran matrisi 50 ul, en az 30 dakika boyunca katılaşması için matris izin vermek üzere% 5 _CO2) 37 ° C 'de (bir hücre kültür inkübatörü içine yerleştirildi. D) Çanak (lar) ı ile. E) Hücreler, tripsinize edilmiştir. F ) Hücreler konik bir tüp içinde mevcut. GH) Hücreler (), bir doku kültürü santrifüj içinde 3 dakika boyunca 100 x g hızında döndürüldü edildi, 15 ml konik bir tüp içine yeniden süspanse edildi. I) Hücre topağı, aşağı döndürülmüştür edilmiştir. J) Hücreler () FBS ile desteklenmiş RPMI ortamı içinde, 1 ml olarak yeniden süspansiyon haline getirildi. K) Hücreler bir hemasitometre. L kullanılarak sayıldı) mikrosantrifüj tüpüne halinde bölünerek, 50 ul toplam hacim elde etmek üzere, uygun ortam kullanılarak tepesinde 2.5 x 10 ⁴ hücreleri. M ), bir 1:1 oranında 1.5 adım matris içeren mikrosantrifüj tüpü ile adım 1.7 (50 ul içinde 25,000 hücre) hücreleri karıştırın; Nihai hacim 100 μ olacak.. Hücre karışımı katılaştırılır, hiç FBS ile desteklenmiş RPMI ortamı 2 ml ekleyin: matris kez) aşama 1.2 'den katılaşmış matris ile kaplanmış yemek O üzerine adım 8 hücre karışımı:, l H) yavaşça, matrisin 100 ul plaka çanak. P) bu deneyin geri kalan saklanacak inkübatör çanak yerleştirin.

İmmünofloresan 3D Kültürleri morfojenık Özellikleri 2. Incelenmesi

1. Çanak (ler) üzerinden geçmeden önce (Şekil 2A),% 80 metanol (tespit edici çözelti) ve% 3 sığır serum albümini (BSA bloke çözeltisi) bir buz kaseti, soğuk fosfat tamponlu çözelti (PBS),% 20 aseton ayarlama inkübatör.
2. Buzluk ve aspire ortama çanak (ler) koyun, daha sonra soğuk PBS ve 2 ml (Şekil 2B) ile 3 kez yıkayın.
3. Son yıkama PBS aspire edildikten sonra,% 20 aseton içinde 2 ml ekleyin: çanak (ler) (Şekil 2C halinde% 80 metanol çözeltisi (Şekil 2B) 'de 20 dakika boyunca hücreleri düzeltmek için.
4. Fiksasyon 20 dakika sonra sona erer, oda sıcaklığında yemekleri geri getirmek fiksatif havalandırın, ve daha sonra 3 kez PBS ile yıkayın. Nihai yıkama PBS aspire edildikten sonra, oda sıcaklığında (Şekil 2E) en az 30 dakika boyunca bloke etmek üzere çanak (ler) için% 3 BSA 2 ml ekleyin.
5. Bloke dönemde blokaj tamponu% 3 sığır serum albümini (BSA) içinde çözülmüş (uygun dilüsyonda) birincil (laminin V 1:100) ve ikincil antikor seyreltileri hazırlanır. Hücresi karışımı: 'BSA + primer antikor' çözüm ul 400-500 matrisi doğrudan eklenmesi gerektiğini unutmayın.
6. Tıkanması süresi 30 dakika sonra, birincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında (Şekil 2F) en az 1 saat boyunca inkübe edilir. Hiçbir PBS yıkar 30 dk Blockin aşağıdaki yapılması gerektiğini unutmayıng dönem.
7. Aşama 2.6 tamamlanmasından sonra, 'BSA + birincil antikor "solüsyon çıkarın ve 3 kez PBS ile yıkayın.
8. Doğrudan bir matris üzerine (uygun seyreltmede)% 3 BSA içinde çözülmüş ikincil antikor ekleyin: Hücre karışımı, yemekler kapak ve oda sıcaklığında (Şekil 2G) 1 saat boyunca inkübe edilir.
9. 'BSA + ikincil antikor' çözüm çıkarın ve PBS ile 3 kez yıkayın.
10. Çekirdekler boyama için PBS içinde çözüldü, Hoechst 33258 (1:10,000) 2 ml ilave edilir, ve alüminyum folyo altında 5 dakika boyunca inkübe (veya photobleaching sınırlamak amacıyla ışık geçirmeyen bir kap ile kapak) (Şekil 2H).
11. Hoechst 33258t ile inkübasyon süresi 5 dakika sonra, PBS ile (ler) 5x çanak yıkayın.
12. Doğrudan matris üzerine montaj orta ekleyin: konfokal çanak hücre karışımı ve bazal membran Matri içinde kolonilerin bütünlüğüne herhangi aksaklıkları uyaran önlemek için dikkatli bir şekilde cam lamel ile kaplayınx: hücre karışımı (Şekil 2I).
13. Çanak (es) oda sıcaklığında (Şekil 2I) de gecede (veya 24 saat) kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, çanak (ler) -20 ° C'de muhafaza edilebilir, ancak bunlar oldukça kısa sürede görüntülü gerektiği tavsiye edilir.
14. (Şekil 3B-E) kullanılan antikorların uygun lazer dalga boyları ile bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü kazanır.

Bağışıklık 3D kültürlerin Şekil 2.. Incelenmesi. . A) deney düzeneği şematik B) Çanak (es) buz tepsiye yerleştirilir ve medya aspire; . sonra hücreler soğuk PBS ve 2 ml C) 2 ml% 20 aseton ile üç kez yıkanmıştır:.% 80 metanol çözeltisi D) için, hücreler çanak (ler) ilave4 ° C'de (ya da buz üzerinde, ya da bir buzdolabı içinde) 20 dakika. E)% 3 BSA içinde 2 ml, oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca bloke etmek üzere çanak (ler) ilave edildi. F) 30 dakika sonra, bloke sona ermiş, birincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında en az 1 saat süreyle inkübe G) () uygun seyreltme ile% 3 BSA içinde çözülmüş ikincil antikorlar taban membran matrisi üzerine direkt olarak ilave edildi:. hücre karışımı; . ardından yemekler üzeri örtüldü ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya H) Hoechst 2 ml (1:10000, PBS içinde çözülmüş) alüminyum folyo altında 5 dakika boyunca inkübe diShe (leriyle) ve hücrelere eklendi I) montaj ortamı, doğrudan ilave edildi. bir matris üzerine: konfokal çanak ve tabak içinde hücre karışımı cam lamel ile kaplıdır. Çanak (ler), oda sıcaklığında bir gece boyunca (veya 24 saat) kurutulmuştur.

Sonuçlar

3 boyutlu bir matris içinde işgal eden MDA-MB-231 hücrelerin bir örneği, Şekil 3C 'de gösterilmiştir. Hücreler, matris (Gün 1) gömülü ve 3. gün göre invaziv (yıldız biçimi) yapılar oluşturan başlar ve tam olarak 5. günde (Şekil 3C) ile matrise işgal edilir. Oluşan yıldız şeklinde kolonilerin sayısı sayılır ve (invaziv ve non-invazif) çanak başına koloni toplam sayısının yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Ölçümler beş gün boyunca her gün yapılır beri Ayrıca, istila oranı da değerlendirileb...

Tartışma

3D hücre kültürü teknikleri geliştirilmesi araştırmacılar bize dramatik morfolojik değişikliklere görselleştirmek için izin göğüs epitel hücrelerinin dönüşümünü incelemek için izin verdi. Hücre istilasını analiz Bunun yanı sıra, tek ya da çok-hücreli küreler, meme epitelyal hücre yapışması, proliferasyon, boyut ve bazal-apikal polariteli değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Hücreler ECM ⁸ ile kaplanmış olan daha önce bildirilen yöntemlere de, bizim sayısal yöntem için çok yönlü istila sağlar ECM...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,5 ml tüpler	VWR	CA10011-700	Steril, tek kullanımlık
100 mm kültür kabı BD353003	VWR	CABD353003	Steril, tek kullanımlık
15 ml Falcon tüp	VWR	CA21008-918	Steril, tek kullanımlık
1 ml filtrelenmiş uçlar	VWR	10011-350	Steril, tek kullanımlık
200 μ l filtrelenmiş uçlar	VWR	22234-016	Steril, tek kullanımlık
20 & # 956; l filtrelenmiş uçlar	VWR	22234-008	Steril, tek kullanımlık
35 mm cam tabanlı Konfokal No.1 kültür kapları	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Kullanmadan önce önceden soğutulmuş
Sığır serum albümini (BSA)	BioShop	ALB003.100	için %3'te kullanılır
, yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş	Life Technologies	A11029	1:250 IF
Alexa Fluor 568 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Antikor	Yaşam Teknolojileri	A11011	1: 1,200 IF
Anti-Beta-Katenin için	BD Transdüksiyon Laboratuvarları	610153	Fare-monoklonal; IF
Fetal sığır serumu (FBS)	Sigma	F1051	%10 (h/h) 'de kullanılır;
Hoechst 33258, Pentahidrat (bis-Benzimid) - 10 mg & frasl; Su Ömrü Teknolojilerinde ml Çözeltisi		H3569	%0,1'de (1:10.000 seyreltme) kullanılırInVivo
Analyzer Suite	Medya Sibernetik		(10X ve 40X'te DIC görüntüleri)
Kisspeptin-10 (KP-10)	EZ Biolabs	PT0512100601	100 nM 'de kullanılır;
Anti-Laminin	Cedarlane	AB19012(CH)	Tavşan-poliklonal tam boy insan; IF
LSM-510 META lazer tarama mikroskobu için 1:100'de kullanılır	Zeiss		63X objektifte kullanılır; yağa daldırma lensi
Matrigel fenol kırmızı içermez (BD356237)	VWR	CACB356237	Parti No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 mikroskobu	Olympus		3D kültür görüntüleme için kullanılır (10X ve 40X'te DIC görüntüleri)
Penisilin-streptomisin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Antibiyotik (besiyerine eklenir; %0,01'de kullanılır)
10 ml pipet	VWR	CA53300-523	Steril, tek kullanımlık
RPMI 1640 Glutamin	Yaşam Teknolojili	11875-119	MDA-MB-231 hücrelerinin
kültürlenmesinde kullanılır% 0.25 Tripsin-EDTA (1x), Fenol Kırmızı	Yaşam Teknolojileri	25200-072	MDA-MB-231 hücrelerini tripsinize etmek için kullanılır
MEGM (mermi kiti): MEBM (CC3151) + Tek quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	MCF10A hücrelerinin kültürlenmesi için kullanılır