Yöntem makalesi

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

DOI:

10.3791/51341

⸱

11 Haziran 2014

 ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Department of Oncology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Lawson Health Research Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şimdi de hücre ve doku mikro çevre tümör başlangıcı ve ilerlemesini etkileyen kritik düzenleyiciler olduğu bilinmektedir. Ayrıca, hücre dışı matris (ECM) in vivo kültür ve homeostazında hücre davranışını önemli bir düzenleyici olduğu gösterilmiştir. Iki boyutlu (2D) üzerindeki hücrelerin kültüre mevcut yaklaşım, hücreler ve bunların mikro arasındaki karmaşık etkileşimlerin rahatsızlık ve zarar plastik yüzeyler sonuçları. Üç boyutlu (3D) kültür tahlillerin kullanımı sayesinde, hücreye mikro-ortam etkileşimi için koşullar, in vivo benzer mikro kurulmuştur. Bu makalede, etrafındaki çevreye hücre istilası değerlendirilmesinde 3D kültür potansiyelini örnekleme, 3 boyutlu bir bazal membran protein matrisi içinde meme kanseri hücrelerinin büyümesini detaylı bir yöntem sağlar. Buna ek olarak, bu deneyler, 3D molekül ağırlığına işaret kaybını incelemek için potansiyele sahip görüşmekprosedürleri immün epitel morfolojisi Modüller düzenler. Bu çalışmalar meme kanseri yayılması için gerekli istilasını düzenleyen işlemler, içine önemli mekanik bilgilerini tespit etmek yardım.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göç ve bireysel ya da kolektif hücrelerin işgali kanseri iki özellikleridir ve kanser hücrelerinin 1-4 metastatik yayılması için gereklidir. Metastaz başlatmak için kanser hücrelerinin yeteneği göç ve hücrelerin, temel zara inerek için invadopodia kullanarak komşu doku içine işgal etme yeteneğine bağlıdır. Invadopodia matris-bozucu proteazlar 5 salınmasıyla hücre dışı matrisin bozulmasını sağlayacak dinamik aktin zengin matris bozulması çıkıntılar bulunmaktadır. Kanser hücre istilası kanser hücrelerinin taşınması takip matrisin bozulmasını içerir ve bu, üç boyutlu (3D) matris ortamı 2 bir yeniden eşlik eder. Bu durumda, matris boyunca....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bazal Membran Matrix Meme Kanseri Hücreleri 1. Üç boyutlu Kültür (gömme Tekniği)

  1. Taşıma Matrigel bazal membran matrisi: 4 ° C'de gece boyunca buz üzerinde Çözülme Taban membran matrisi düşük bir sıcaklıkta sıvı olan, ancak oda sıcaklığında katılaşır. Buz (Şekil 1A-B) ile ilgili bazal membran matrisi tutun.
  2. Spiral bir desen (Şekil 1C) ve P-200 Pipetman ucunu kullanarak matris yayma vasıtasıyla taban membran matrisi 50 ul Konfokal No.1 cam alt çanak örtün. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için bazal membran matrisi yayılan dikkatli kullanın. Aynı şekilde, menisküs oluşmasını önlemek için, cam alt-çanak sınırl....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3 boyutlu bir matris içinde işgal eden MDA-MB-231 hücrelerin bir örneği, Şekil 3C 'de gösterilmiştir. Hücreler, matris (Gün 1) gömülü ve 3. gün göre invaziv (yıldız biçimi) yapılar oluşturan başlar ve tam olarak 5. günde (Şekil 3C) ile matrise işgal edilir. Oluşan yıldız şeklinde kolonilerin sayısı sayılır ve (invaziv ve non-invazif) çanak başına koloni toplam sayısının yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Ölçümler beş gün boyunca her gün yapılır beri Ayrıca, istila oranı da değerlendirileb.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D hücre kültürü teknikleri geliştirilmesi araştırmacılar bize dramatik morfolojik değişikliklere görselleştirmek için izin göğüs epitel hücrelerinin dönüşümünü incelemek için izin verdi. Hücre istilasını analiz Bunun yanı sıra, tek ya da çok-hücreli küreler, meme epitelyal hücre yapışması, proliferasyon, boyut ve bazal-apikal polariteli değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Hücreler ECM 8 ile kaplanmış olan daha önce bildirilen yöntemlere de, bizim sayısal yöntem için çok yönlü istila sağlar ECM.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR) hibesi MOP 107972'den M.B.'ye sağlanan fonlarla gerçekleştirilmiştir. M.B., CIHR Yeni Araştırmacı Maaş Ödülü sahibidir. DC, Translasyonel Meme Kanseri Araştırma Birimi ve CIHR Kanser Araştırmaları ve Teknoloji Transferi Stratejik Eğitim Programı, Londra Bölgesel Kanser Programı'ndan öğrenci almaktadır. C.G., Translasyonel Meme Kanseri Araştırma Birimi'nden öğrenci bursu, Londra Bölgesel Kanser Programı ve CIHR- Kanser Araştırmaları ve Teknoloji Transferinde Stratejik Eğitim Programı'ndan. Sgd.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 ml tüplerVWRCA10011-700Steril, tek kullanımlık
100 mm kültür kabı BD353003VWRCABD353003Steril, tek kullanımlık
15 ml Falcon tüpVWRCA21008-918Steril, tek kullanımlık
1 ml filtrelenmiş uçlarVWR10011-350Steril, tek kullanımlık
200 μ l filtrelenmiş uçlarVWR22234-016Steril, tek kullanımlık
20 & # 956; l filtrelenmiş uçlarVWR22234-008Steril, tek kullanımlık
35 mm cam tabanlı Konfokal No.1 kültür kapları MatTek CorporationP35G-1.0-14-CKullanmadan önce önceden soğutulmuş
Sığır serum albümini (BSA)BioShopALB003.100için %3'te kullanılır
, yüksek oranda çapraz adsorbe edilmişLife Technologies  A110291:250 IF
Alexa Fluor 568 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) AntikorYaşam Teknolojileri  A110111: 1,200 IF
Anti-Beta-Katenin için BD Transdüksiyon Laboratuvarları610153Fare-monoklonal; IF
Fetal sığır serumu (FBS)SigmaF1051%10 (h/h) 'de kullanılır;
Hoechst 33258, Pentahidrat (bis-Benzimid) - 10 mg & frasl; Su Ömrü Teknolojilerinde ml ÇözeltisiH3569%0,1'de (1:10.000 seyreltme) kullanılırInVivo
Analyzer Suite Medya Sibernetik(10X ve 40X'te DIC görüntüleri)
Kisspeptin-10 (KP-10)EZ BiolabsPT0512100601100 nM 'de kullanılır;
Anti-Laminin CedarlaneAB19012(CH)Tavşan-poliklonal tam boy insan; IF
LSM-510 META lazer tarama mikroskobu için 1:100'de kullanılır Zeiss63X objektifte kullanılır; yağa daldırma lensi
Matrigel fenol kırmızı içermez (BD356237)VWRCACB356237  Parti No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 mikroskobu Olympus3D kültür görüntüleme için kullanılır (10X ve 40X'te DIC görüntüleri)
Penisilin-streptomisin (10.000 U/ml)Life Technologies15140-122Antibiyotik (besiyerine eklenir; %0,01'de kullanılır)
10 ml pipetVWRCA53300-523Steril, tek kullanımlık
RPMI 1640 GlutaminYaşam Teknolojili11875-119MDA-MB-231 hücrelerinin
kültürlenmesinde kullanılır% 0.25 Tripsin-EDTA (1x), Fenol KırmızıYaşam Teknolojileri25200-072MDA-MB-231 hücrelerini tripsinize etmek için kullanılır
MEGM (mermi kiti): MEBM (CC3151) + Tek quots (CC4136)LonzaCC-3150MCF10A hücrelerinin kültürlenmesi için kullanılır
IF Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Fare IgG (H+L) Antikoru için 1:100'de kullanılır, 3D kültür görüntüleme için Kullanılan Orta

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  2. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
  3. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3D Invasion AssayBreast Cancer CellsBasement Membrane MatrixLight MicroscopyImmunofluorescent MicroscopyStellate Colony FormationMDA MB 231 CellsECM Protein LocalizationCell Culture IncubatorFluorescent Antibody Staining

İlgili makaleler