Method Article

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

DOI:

10.3791/51354

April 30th, 2014

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vitro kültürü sistemleri omurgalı Miyogenesis anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmıştır. Ancak, çok özellikle bazal taksa içinde, memeli olmayana iskelet kas gelişimi ve büyüme öğrendi gerekmektedir. Bu doku, kas kaynaklı öncü hücreleri (MPCs) yetişkin kök hücrelerin izole edilmesi ve bir birincil kültür ortamda kendi kendini yenileme, proliferasyon ve farklılaşma korumak için etkili ve güçlü bir protokol boyunca korunmuş ve farklı düzenleyici mekanizmaların tanımlanması için sağlar: omurgalı soy.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nedeniyle in vivo miyojen programı eğitim ile ilgili doğasında zorluk ve zaman, iskelet kasının yerleşik yetişkin kök hücrelerinden elde edilen primer kültür sistemleri, miyojenik öncü hücreler (MPCs), memeli iskelet kas gelişimi anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmış ve var büyüme. Özellikle OMURGALI bazal takson arasında, ancak, veri kendini yenileme, çoğalmasını ve MPCs farklılaşmasını kontrol eden moleküler mekanizmaları açıklayan sınırlıdır. Özellikle ilgi apendiksinde kaybı (yani urodele amfibi) sonra hatırı sayılır postlarva iskelet miyofiberde oluşan hiperplazi (yani Kemikli balıklar) ve tam rejenerasyon geçmesi bazal omurgalıların yeteneğini altında yatan potansiyel mekanizmaları vardır. Buna ek olarak, kültürlü miyoblastların kullanımı rejenerasyonu ve kas kaynaklı programın tekrarlama ve aralarındaki farklar anlaşılmasına yardımcı olabilir. KarşıBu amaçla, biz detaylı olarak sağlam ve verimli bir protokol tarif (ve varyasyonlar burada) daha ile başlayan, miyojenik programın evrimini anlamak için bir platform olarak hücre kültüründe, MPCs ve döl, miyoblastları ve olgunlaşmamış miyotüpleri izole ve bakımı için bazal omurgalılar. Zebra balığı (Br.rerio) model organizma durumuna Capitalizing, biz sazan dalının Danioninae küçük balıklar, bu protokolün uygulanması hakkında rapor. Paralel olarak, bu protokol Meksika Axolotl (Ambystomamexicanum) ve hatta laboratuar kemirgenlerden MPCs izole edilmesi suretiyle daha geniş bir karşılaştırmalı bir yaklaşım gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu protokol, artık yaygın gökkuşağı alabalık, somon, ve çipura 1-4 dahil olmak üzere çeşitli balık türleri, Miyogenesis okuyan kullanılmaktadır.

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli Miyogenesis arasında dikkate değer bir anlayış C2C12 5, her iki primer fare (Mus musculus) miyoblast kültürleri ve iyi tanımlanmış bir fare-türevi hücre hattı bu sürecin tekrarlama yoluyla elde edilmiştir. 1950 6 başlayarak, bu kültürler diğer omurgalılarda uzantısı, Miyogenesis ile murinemyogenic programın anlayışında çok ilerleme yol açmış ve var. Buna ek olarak, tek bir hücre miyofiberde oluşan eksplant teknikleri uydu hücreleri ve çevreleyen myofibers 7-9 arasındaki etkileşimlerin bir anlayış üzerinden artmıştır. Hücre kültürleri edilir Miyogenesis araştırmalar için özellikle çekici dolayı kısa bir süre için ön-far....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Açıklama: Burada açıklanan omurgalı hayvanları kapsayan tüm deneyler Birmingham Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından önceden onaylanan ve Laboratuar Hayvan Refahı, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Ofisi tarafından oluşturulan kurallar ile tutarlı edildi Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı.

Kültür 1. Hazırlanması

  1. (, 2 L başına 26,96 g 13,48 g / L) 9 mM NaHCO 3 (2 L başına 1.51 g), DMEM içinde 20 mM HEPES (2 L başına 9.53 g) aşağıdaki gibidir: orta taban hazırlayın.
    1. PH belirlemek HCI veya NaOH ile 7,40 ayarlayın.
    2. Ozmolaliteye belirleyin ve (gerekirse) ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yirmi dört saat sonra tohumlama, miyojenik öncü hücreleri (MPCs) (Şekil 1a ve 1d bakınız) laminin alt tabaka bağlı görünür olmalıdır. Tohumlamadan sonra, hücreler (MPCs) bu hücre tipi göstergesi olan bir mil benzeri bir şekle, (Şekil 1) kabul etmek ve MyoD1 + (Şekil 2) vardır. Danio türlerde, MPCs Oncorhynchus ve Salmo türlerden MPCs göre daha küçük bir bipolar işlemleri ile daha küçük olduğu görülmektedir. Ancak, kültür dört .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miyojenik programı, hangisi incelenen türlerin içinde, en kolay bir in vitro sistemi ile incelenebilir. Nitekim, izolasyon üzerine, miyojenik öncü hücreler (MPCs) balık veya memelilerde myosatellite hücreler (MKH) kolayca çoğalması, hücre döngüsü çekilmesi ve miyoblastların terminal farklılaşma ve doğmakta myotubes bu miyoblastların kaynaşmasını içeren çok iyi düzenlenmiş bu süreci girin. (Zebrabalıkları 67 ve 69 gökkuşağı alabalığı olası hariç) balık türlerinin transgenik gen haberci soyl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Dr için çok teşekkürler sunarım. Küçük balıklar ve kurbağalar için bu kültür protokol geliştirme ve uygulama, mesleki uzmanlık için Josep Planas ve Juan Castillo. Teşekkürler nedeniyle yorulmadan Matthew, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall Şarj dahil olmak üzere birçok balık (türlerin ve sayı hem de), kas dokusu diseksiyonu ve ayrışma ile destekli olan sayısız bireyler de vardır Ben Meyer, Ethan Remily ve Sinibaldo Romero. Bu çalışma Biyoloji start-up fonları Birmingham Bölümü, Proteaz Araştırma NIH Hibe # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 için Merkezi'nde Alabama Üniversitesi tarafından destekle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tablo 1. Ayrıntılı Reaktif Bilgileri
ReaktifŞirketi (Tercih Edilen V. Alternatif)Katalog Numarası (Tercih Edilen V. Alternatif)Kültür başına miktar
&gama;ışınlanmış poli-L-lizinSigma-Aldrich (MP Biyomedikal)P5899 (ICN19454405)5 mg
DMEM (yüksek glikoz)Sigma-Aldrich (cellgro)MT-50-003-PB (D7777)2 L
LamininBD Biosciences ( Sigma-Aldrich)CB-40232 (L2020)1 mg
Sodyum Bikarbonat (NaHCO3)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP328-500 (S5761)1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP310-1 (H6147)9.53 g
Antibiyotik/AntimikotikThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SV3007901 (A5955)17-20 mL
Gentamisin SülfatLonza (Sigma-Aldrich)BW17-519Z (G1397)2-3 mL
Donör At SeraThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007403 (H1270)75 mL
Fetal Sığır SeraThermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007103 (F2442)25 mL
Kollajenaz (Tip IV)Worthington (Sigma-Aldrich)LS004189 (C9891)0.44 g
Tripsin (Pankreastan)MP Biyomedikal (Sigma-Aldrich)ICN15357125 (T5266)1 g
Tablo 2. Sarf Malzemeleri, Araçlar ve Ekipmanlar
Sarf MalzemeleriEkipman
Hücre kültürü plakalarıForseps (kaba)Serolojik pipetleyici
Steril 50 mL Konik tüplerForseps (İnce)pH Metre
Laboratuvar bandıNeşter KollarıSoğutma İnkübatörü (Ekoterm)
0.2 μ m Vakumlu Sterilizasyon SistemleriNeşter Bıçakları (#10, #11)Laminer Akış Başlığı
Su İtici OtoklavKağıdı Cerrahi MakasVakum Manifoldu
Serolojik PipetlerCam Petri KaplarıMikroozmolalite Ölçer
12-16 G Luer Kilitli Kanüller
Tablo 3. Hücre Kültürü Plakalarının Kaplanması için Optimize Edilmiş Hacimler
Plaka Boyutucm^2 Kuyu başınaPoli-L-lizin*Laminin**
6 kuyu9.51.6 mL1
24 kuyu1.90.320.2
48 kuyu0.950.160.1
96 kuyu0.320.060.03
*0.1 mg/mL konsantrasyon** 0.020 mg/mL konsantrasyon
Tablo 4. İzolasyon, ayrışma ve kültür
reaktifiortamı İzolasyonyıkamaayrışma
baz ortamı419.25 mL395.40 mL297.00 mL
gentamisin sülfat**0.75 mL0.60 mL-Donör
At Serumu75.00 mL--
Fetal Sığır Serumu ***---
* PSF: penisilin / streptomisin / fungizone kokteyli (100x); ** 50 mg / mL konsantrasyon; Characterized
Tablo 5. Önerilen Seyreltmeler ve Kaplama Hacimleri
Plaka Boyutucm^2 Kuyu başınaSeyreltmeKaplama Hacmi
6 kuyu9.51.5-2.0x10^6 hücre/mL1 mL
24 kuyu1.91.5-2.0x10^6 hücre/mL250 μ L
48 kuyu0.951.5-2.0x10^6 hücre/mL150 μ L
96 kuyu0.321.5-2.0x10^6 hücre/mL50-100 μ L
Tablo 6. G doku başına ortalama hücre sayısı
TürOrtalama # hücre/g doku
Danio rerio6.400.000
Danio dangila1.783.000
Devario aequipinnatus1.797.000
Oncorhynchus mykiss66.800
Tablo 7. Önerilen Kuluçka Sıcaklıkları
Tür Sıcaklığı
Danio/ Devario spp.26 - 28 & derece; C
Oncorhynchus/Salmo spp.10* - 18 derece > C
Ambystoma mexicanum18° C
* Daha düşük sıcaklıklar, daha düşük çoğalma oranlarını destekler.

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
  2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myogenic Precursor CellsPrimary Cell CultureTissue DissectionMechanical DissociationEnzymatic DissociationCollagenase TreatmentLaminin SubstrateCell PlatingMyogenesis AssayZebrafish Model

Related Articles