Method Article

Juxtasomal Biocytin Etiketleme Bireysel Kortikal nöronlar yapı-fonksiyon ilişkisi Çalışması için

DOI:

10.3791/51359

⸱

February 25th, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Neurophysiology, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam, VU University Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronal ağların yapısını anlamak için, bireysel nöronların fonksiyonel ve morfolojik karakterizasyon bir zorunluluktur. Burada, juxtasomal biocytin dışı yapılandırmada elektrofizyolojik kayıtları etiketleme izin verir, ama hücre içi dendritik ve aksonal mimari post hoc yeniden için nöron etiket yeteneğini muhafaza göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin korteksi, birlikte bir ağ olarak karar verme, duyusal kılavuzlu davranış veya bellek dahil olmak üzere birçok yüksek bilişsel işlevler sorumludur çok katmanlı ve çok farklı hücre tipleri ile karakterize edilir. Böyle karmaşık nöronal ağlar gibi görevleri gerçekleştirmek nasıl anlamak için, çok önemli bir adımdır hayvan ilgili bir bilişsel görevi gerçekleştirirken zaman tercihen, ağ içinde tek tek hücre tiplerinin işlevini (veya elektriksel aktiviteyi) belirlemektir. Ayrıca, ters kortikal ağını sağlamak için bireysel nöronların ağ ve morfolojik mimarisinin anatomik yapısını belirlemek için eşit derecede önemlidir. Bugün mevcut teknik atılımlar kaydedildi nöronları belirlenmesi post hoc değerli seçeneği ile hayvanlar davranmak, uyanık hücresel aktiviteyi kayıt izin. Burada, biz kayıt eylem potenti içerir juxtasomal biocytin etiketleme tekniği, göstermekal geleneksel yama pipetler kullanılarak dışı (ya da gevşek-yama) konfigürasyonunda spike. Juxtasomal Kayıt konfigürasyon, anestezi sedasyon, uyanık kafa sabit, ve hatta serbestçe hareket hayvanda dahil, davranışsal koşulları karşısında nispeten istikrarlı ve uygulanabilir. Bu yüzden, bu yöntem, bireysel nöronlar ve sonuçta, tüm kortikal mikrodevre yeniden hayvan davranış sırasında hücre tipi özel aksiyon potansiyeli çapalama bağlama sağlar. Bu Video yazıda, juxtasomal yapılandırmada bireysel nöronların post hoc tanımlanması ve morfolojik yeniden inşası için üretan-anestezi sıçan biocytin ile etiketlenmiş nasıl göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronal ağ oldukça spesifik morfolojik ve fizyolojik özellikleri 1-7, özelliği çok sayıda hücre türleri, oluşur. Bunun bir sonucu olarak, tek tek hücre tipleri (bakınız örneğin Gentet et al. 8 ve Burgalossi et al. 9) ağ içinde özel görevleri yerine getirir. Biz sadece nöronal ağlarda hücre tipine özel işlevleri anlamaya başlıyor ve çok keşfedilmeyi hala. Bu amaçla, çok sayıda laboratuarlar fizyolojik parametre 1,10-15 elde edilmiş olan aynı nöronal nüfusun morfolojik özelliklerinin analizine izin deneysel yaklaşımlar uygulamaktadır. Burada, biocytin ile kaydedilen nöronun elektroporasyon ile kombinasyon halinde hücre dışı (böylece invazif olmayan) bir yapılandırmada geleneksel kumanda pipetler kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları içerir juxtasomal etiketleme tekniği 16,17 gösterir.Bu yaklaşımın önemli bir avantajı, invaziv olmayan doğası tek nöronların aksiyon potansiyeli spike (örneğin diyaliz) hücrenin hücre içeriği değiştirmeden kaydedilir sağlar olmasıdır. Elektroporasyon ardından, juxtasomal yaklaşım yapısı (morfoloji) fonksiyonu (fizyoloji) bağlamak için post hoc hücre tanımlaması ve rekonstrüksiyon seçeneği sağlar. Tipik olarak, morfolojik yeniden omurga ve / veya bouton yoğunlukları miktarının veya elektron mikroskobu kullanılarak nm çözünürlükte nöronal morfoloji da yeniden genişletilebilir dendritik ve aksonal morfolojisi yeniden içerir. Çalışmaların çoğu, örneğin, fare ya da sıçan gibi küçük kemirgenlerde tekniği uygulanır olmasına rağmen juxtasomal kayıt tekniği, kortikal katmanları arasında türler ya da bir dizi alt kortikal bölgelerinde çeşitli hücre tiplerinin in vivo kayıtları için kullanılabilir. Bizim araştırma nöronlar kayıt ve etiketleme odaklanmıştırsıçan primer somatosensori korteks (S1) dan ve kayıtlı nöronların 18 görsel bir kimlik içerir, standart bir referans çerçevesi içinde kesin kayıt ile kombinasyon dendritik rekonstrüksiyonlar hücre tipine özel yerel karakterize etmek için kortikal ağları 4,19 ve aksonal mimarisi ayrıntılı yeniden tersine mühendislik ve uzun menzilli projeksiyon 20. hedefliyor.

Uyanık baş sabit 23, ya da serbest hareket eden hayvanlar 9, alternatif bir in vivo kayıt teknikleri (hücre içi ya da bütün hücre) ile karşılaştırıldığında, juxtasomal kayıtları nispeten kararlı olan ve bu yüzden anestezi 21,22 dahil olmak üzere davranış eyalette uygulanabilir, 14, sedasyon . Biz seçim birçok preparatlar için bu tekniğin genel uygulanabilirliğe vurgulamak rağmen Burada, bir üretan ile anestezi uygulanmış sıçan S1 juxtasomal etiketleme göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Animal hazırlanması

Tüm deneysel prosedürleri VU Üniversitesi Amsterdam, Hollanda'da yerel etik komite tarafından Hollanda yasaları uyarınca ve değerlendirilmesinden sonra yapılır.

  1. Intraperitoneal enjeksiyon ile (% 0.9 NaCI, 1.6-1.7 g / kg 'de% 20) üretan ile izofluran (oksijen içinde% 2-3) ile ve daha sonra bir Wistar sıçan (P25-P45, ♂ / ♀) anestezisi. Tutam çekilmesi, göz kapağı refleksleri ve burun kılı hareketlerini izleyerek anestezi derinliğini değerlendirin.
  2. Halinde üretan ek bir doz (başlangıç ​​dozunun% 10) yönetmek hayvanın yeterli anestezi derinliği ulaşamazsa ya da burun kılı twitches deney süresince gözlenir zaman.
  3. Bir ısıtma yastığı ile donatılmış stereotaksik çerçeve üzerine anestezi hayvan koyun, rektal sıcaklık probu eklemek ve bir ısıtma yastığı ile 37.5 ± 0.5 ° C 'de, hayvanın vücut ısısını korumak.
  4. stereotaktik çerçeve içinde hayvanın kafasını yerleştirin; görünen cildi işlemek için makas kullanarak başının üstüne saç kesme.
  5. Operasyon yerinde lokal anestezi için 100 ul% 1 lidokain, deri altı (% 0.9 NaCl) enjekte edilir ve 3-5 dakika bekleyin. Kuyruk-to-rostral yönde keserek kafatası yüzeyi kaplayan deri çıkarın ve geri kalan doku temizleyin.
  6. % 0.9 NaCl ve emici bezlerden ile yoğun kafatası temizleyin.
  7. (: 2.5 mm posterior ve bregmaya yanal 5,5 mm birincil somatosensoriyel korteks (S1)) sol yarımkürede hedef alan koordinatlarını belirlemek. Bir cerrahi cilt marker kalem ile kafatası üzerinde konumunu işaretlemek.
  8. Kemik şeffaf hale gelir ve kan damarları açıkça görülebilir kadar ilgi bölgesinden bir diş matkap yavaşça kemik kazıyın.
  9. Dura mater zarar kaçınarak, bir neşter (# 11) ile inceltilmiş kafatasında bir pencere keserek 0.5 mm x 0.5 mm kraniotomiye olunve kan damarları. İsteğe bağlı: görünürlüğünü artırmak için cerrahi bir cilt işaretleyici kalem kullanılarak kraniotomi kenarlarını işaretleyin.
  10. Kraniotomi kuşatan bir banyo (yani kayıt odası) oluşturmak için kuru kafatası ve daha sonra diş çimento üzerinde superglue ince bir tabaka uygulayın.
  11. Bıyık folikül tam 5 mm kontralateral tarafta bıyıkları kırpmak. İsteğe bağlı: siyah maskara ile kesilmiş bıyıkları vurgulayın.

2. Juxtasomal Kayıtlar ve Biocytin Etiketleme

  1. 3-5 MQ direnci ile elektrotlar elde etmek ~ 1 mikron iç ucu çapı ile borosilikat cam yama pipetler olun. Not: juxtasomal kayıt için ideal bir pipet morfoloji kademeli sivrilik, düşük koni açısı ve bir ~ 1 mikron ucu (Şekil 1).
  2. (Pial yüzeyine göre) kayıt derinliğine bağlı olarak, kayıt elektrot şev boyutları ayarlanmalıdır. Önem bu to çap kayıt alanının mekanik hasar veya stresi önlemek için beyinde giriş noktada en az 75 mikron olmalıdır konik. Nispeten derin kortikal katmanları kayıtları maksimum dış yine, 1,500-1,800 um daha uzun bir konik gerektirir ise bu yüzeysel kortikal kayıtları için, maksimum 75 um'lik bir dış çapı 300-500 um'lik bir şev (Şekil 1A) gerekli olduğunu gösterir (elektrot ucundan 1.800 mikron olarak) 75 mikron çapı.
  3. Normal sıçan zil (NRR) ile yama pipet yükleyin 2% biocytin ile desteklenmiş (çözümleri ve reaktifler için bakınız Tablo 1) ve bir micromanipulator sabit bir kafa sahnede yama pipet montaj.
  4. Özellikle sıçan S1 D2 sütun hedeflemek için sagital düzleme göre 34 ° 'ye kadar, elektrot tutucu açısını ayarlayın.
  5. Köprü modunda bir amplifikatör (yani şimdiki kelepçe) için kafa sahne bağlayın.
  6. Yama yerleştirinkraniotomi yakın pipetle. % 0.9 NaCl ile banyo doldurmak ve pozitif akım enjeksiyon (1 nA, on / off 200 msn) ile bir kare darbe uygulayarak değerlendirilen 3-5 MQ arasında olmalıdır elektrot direncini belirlemek.
  7. Kare bakliyat (1 nA, on / off 200 msn) gibi pozitif akımı uygulanması sırasında 100-150 mbar aşırı basınç kurmak ve 1 mikron adımlarla yama pipet ilerlemek. Dura mater ile temas kurarak üzerine sağlam direnç değişimi izleyin. Bu noktada, doğru derinlik ölçümü izin vermek için "sıfır" için mikromanipülatör koordinatlarını ayarlayın.
  8. Yama pipet elektrot direnci ani bir düşüş ile gösterilen dura mater girinceye kadar 1 mikron adım modunda ilerlemek. Pipet tutma basıncını çıkarın.
  9. 1 mikron adımlarla ilerleyen süre tek birimler arayın. / Kapama bakliyat 200 msn'den uygulayarak sürekli elektrot direnci izleyin. Elektrot direnci Typic bir artışmüttefiki tek bir nöron yakınlığını gösterir. Pozitif hareket potansiyelini (AP) ~ 2 mV dalga formu (Şekil 2A ve 2B) kaydedilir kadar elektrodu ilerletin.
  10. İsteğe bağlı: nöronun kendiliğinden engelleyici desen kaydedin ve tespit bıyık-uyarılmış kaudal bir piezoelektrik cihaz 18 kullanılarak 3.3 ° 'lik bir açı ile 200 msn için ayrı bir bıyık saptırma, örneğin, ile spike.
  11. Direnci 25-35 MQ ve sivri juxtasomal dolum en uygun koşulları elde etmek için 3-8 mV'luk genlikleri kadar elektrot ilerlemek. Pozitif akım (1 nA, on / off 200 msn) kare bakliyat uygulayarak juxtasomal dolum başlatın. AP dalga biçimi ve frekans (Şekil 2A ve 2B) ve izleme sırasında yavaş yavaş yavaş 0.1 nA aşamaları mevcut artar.
  12. Blok darbesi (Şekil 2C-on aşamasında AP frekans belirgin bir artış gibi, zar açıklığı Monitör ). Dolum sırasında başak dalga artan bir genişliğe ve indirgenmiş sonrası hiperpolarizasyonuna (Şekiller 2C ve 2D) göstermektedir. Ek parametreler artan gürültü ya da bir küçük (1-5 mV) negatif DC vardiya içerir.
  13. Artırın veya stabil biocytin infüzyon korumak için dolum esnasında (1 nA) akımı azalır. Azaltmak veya sodyum iyonları gibi iyonların hücre dışı, aşırı akışı ile toksisite önlemek için AP frekans ani artışı üzerine akım darbeleri durdurun. Not: Her nöron etiketleme parametreleri ayrı kayıt koşullarına bağlı olarak ayarlanması gerekir akım enjeksiyon ve juxtasomal farklı yanıt olacaktır.
  14. Yakından mevcut enjeksiyon durdurduktan sonra sinyalini izlemek. Bir dolum oturumundan sonra başak dalga genellikle genişletmiş ve güçlü bir hiperpolarizasyonuna sonra azalır gösterir. Başak dalga (orijinal özelliklerine yani varlığını döndüğünde açıktır nöron, kurtarılması için bekleyinNormal sonrası hiperpolarizasyonuna, Şekil 2).
  15. Gelişmiş boyama kalitesi için biocytin yükünü artırmak için nöron tam iyileşme sonra oturumları doldurarak biocytin tekrarlayın.
  16. Başak genlik hücreye herhangi bir mekanik stresi azaltmak düşene kadar 1 mikron adımlarla yama pipet geri çekin. Yakından ilgili hayvanın vücut sıcaklığının izlenmesi ve solunum sırasında hücre yayılması için biocytin için en az 1 saat bekleyin.

3. Hayvan perfüze ve Beyin Çıkarma

  1. , Perfüzyon kurulum hazırlayın durulayın, ve% 0.9 NaCl ile boru preload.
  2. Cerrahi bir tepsi üzerinde hayvan yerleştirin ve standart etiketleme bant ile sabitleyin. Anestezi yeterli derinliği sağlamak; ayak tutam ve göz kapağı refleksleri olmalıdır.
  3. Sadece göğüs kafesinin altında karın duvarından kesi (5-6 cm) yanal ve sternum maruz posterior-anterior yönde devam etmek için bir orta yapmak.Öne sternum çekin ve dikkatlice diyaframdan karaciğer ayrı.
  4. Alt kaburga kesti diyafram küçük bir kesi, yapın ve kalp açığa çıkarmak için karın boşluğunun tüm uzunluğu boyunca kesik devam etmektedir.
  5. Perikard çıkarın.
  6. Sol ventrikül içine iğne takın ve sağ atrium bir kesi yapmak. Karaciğer soldurması tamamlanana kadar% 0.9 NaCl (~ 8 ml / dak) ile serpmek.
  7. Ön ayaklarında tutukluk kadar% 4 paraformaldehid (PFA) için infüzyon geçin ve alt çene belirgindir.
  8. Bir makas kullanılarak sıçan başını kesmek
  9. Kalan boyun kaslarını kaldırmak ve tamamen kafatası maruz.
  10. Sırt tarafında beyin sapındaki makas yerleştirin ve dorsal konumunu koruyarak, sagital sütür boyunca dikkatle kemiği kesti.
  11. Forseps kullanarak beyin maruz sutur iki taraftan kemikleri çıkarın. Dikkatle d önlemek için dura kaldırmakermeden.
  12. Dikkatli beynin ventral tarafında künt spatula yerleştirin ve yavaşça beyin kaldırmak.
  13. 4 ° C'de PFA tüm beyin gecede Post-fix 0.05 M fosfat tampon maddesi (PB) için beyin geçiş ve 4 ° C'de saklayın

4. Teğet bölümlerinde Beyin dilimleme

  1. 0.05 M PB dışında beyin almak ve anterior bakan bir filtre kağıdı üzerine koydu. Koronal düzlem boyunca beyincik kesti ve orta sagital düzlemi boyunca keserek yarımküresini ayırmak için keskin bir jilet kullanın.
  2. Montaj platformda superglue uygulayın ve ön sağ bakan ile sagital düzlemde sol yarımkürede monte edin. Bir vibratome üzerinde 45 ° 'lik bir açı ile monte platformu elde edin ve 0.05 M PB beyin daldırın.
  3. Vibratome bir jilet güvenli ve beyin yüzeyi ile ilk temas yarımkürenin ön-arka düzlemin ortasında olduğundan emin olun. 24 100 mikron kestibölümleri ve 0.05 M PB ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içinde toplarlar.

5. Histolojik Prosedürleri

  1. Daha önce tarif edilen yöntemlere uygun olarak 25, sitokrom oksidaz boyama 24 ve avidin-biotin-peroksidaz yöntemi için histolojik protokolleri gerçekleştirir. İsteğe bağlı: floresan avidin / streptavidin-Alexa birleşimleri kullanılarak biocytin görselleştirmek. Bu ayrıca retrograd veya antegrad izleme teknikleri ile çift boyanmasını sağlar.
  2. 0.05 M PB ve 3-3'-diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) çözümleri için bakınız Tablo 2 (katman 4 S1 (L4) in varil görselleştirmek üzere, sitokrom oksidaz boyanması için çözelti içeren hazırlanması ile yıkayın bölümleri 5 x 5 dakika reaktif). 37 ° C de 30-45 dakika için önceden ısıtılmış çözeltide pia kesitler 6-12 inkübe
  3. 6 x 5 dakika süreyle 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın ve% 3 H 2'deki tüm bölümleri inkübe edilerek bir endojen peroksidaz etkinliğini gidermek O, oda sıcaklığında (RT) 20 dakika süreyle 0.05 M PB 2.
  4. 5 x 10 dakika için 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın. 4 ° C de bir gece (çözümler ve reaktifler için bakınız Tablo 3) ABC-çözeltisi içinde bölümleri inkübe
  5. 5 x 10 dakika için 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın ve (çözümleri ve reaktifler için Tablo 4) biocytin doldurulmuş nöron görselleştirmek için DAB-solüsyon hazırlanır. Oda sıcaklığında 45-60 dakika boyunca filtre edilmiş çözelti içinde bölümleri inkübe edin.
  6. 5 x 10 dakika için 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın. Mikroskop slaytlar ve Mowiol ile kapak kayma (çözümleri ve reaktifler için bkz. Tablo 5) Mount bölümleri.
  7. Işık mikroskobu kullanılarak etiketleme kalitesini belirler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bireysel nöronların 3D yapısı hakkında detaylı bilgi nöronal ağların örgütsel ilkelerini aydınlatılması için çok önemlidir. Bizim yöntem ve böylece post hoc nöronal sınıflandırma ve dendritik ve yüksek çözünürlükte tek nöronların aksonal mimarisinin ayrıntılı yeniden izin, in vivo hazırlanmasında yüksek kaliteli biocytin etiketleme elde etmek için bir boru hattı içerir. Juxtasomal etiketleme kalitesine bağlı olarak, nöronlar soluk çok doğru bir şekilde kayıt konumu 19,26 uygun pozisyonlarda ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Juxtasomal yöntem davranışsal koşulları karşısında tek birimlerden vivo aksiyon potansiyeli çivilenmesi kayıt sağlar (anestezi, uyanık baş-sabit veya serbestçe hareket) biocytin-etiketleme post hoc hücre tipi sınıflandırma ve / veya 3D rekonstrüksiyon için kaydedilen nöron seçeneği ile. Büyük avantajı dışı (böylece noninvaziv) yapılandırmada fizyolojik parametrelerini elde etmek için, henüz biocytin 16,17,32 ile hücre nöron etiketlemek edememek. Etiketleme biocytin ek olarak, bu tek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Authros ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Profs teşekkür etmek istiyorum. Kapsamlı destek için Huibert Mansvelder ve Bert Sakmann, verimli tartışmalar ve teknik yardım için nöronal izleme ve Brendan Lodder sağlamak için Dr Marcel Oberlaender. Veri cömertçe R. Bruno (Columbia Üniv., NY, ABD) tarafından sağlanan LabView için ntrode VI, kullanılarak elde edilmiştir. Bu araştırma Max Planck Derneği ve Hesaplamalı Sinirbilim, Tübingen için Bernstein Merkezi tarafından desteklenmiştir (Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (Bmbf tarafından finanse; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Neurogenomics ve Bilişsel Araştırma Merkezi (CNCR) , Neuroscience Kampüs Amsterdam (NKA), CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 ve ENC-Ağ # p3-c3) ve VU Üniversitesi Amsterdam fon.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SM-6 kontrol sistemiLuigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipülatör bloğu X2
Lynx-8 amplifikatörNeuralynx
Axoclamp-2B amplifikatörAxon Instruments
Osada modeli EXL-M40Osada, Inc.
Piezoelektrik cihazPhysik InstrumentePL140.10
LabViewNational Instruments, Austin, TX, ABDLabView edinme yazılımı
Ntrode Virtual Instrument R. Bruno, Columbia Univ., NY
Sugi emici swablarKettenbach30601
At kalbinden sitokrom CSigmaC2506
Sığır karaciğerinden katalazSigmaC9322
DABSigmaD5637
H2O2Boom7047
Vectastain standart ABC kitiVektörPK6100
Triton X100SigmaT9284
ÜretanSigmaU2500
İzofluranFarmakkimya45.112.110
LidokainSigmaL5647
Simpleks hızlı diş çimentosuKemdentACR308 / ACR924
BiyositMolekula36219518
PFAMerck Millipore8187151000
Trizma tabanıSigmaT4661
Mowiol 4-88Aldrich81381
Analitik sınıf gliserolFluka49767
HEPESSigmaH3375
NaClSigma Aldrich31434
KClSigma Aldrich60130
CaClSigma Aldrich22,350-6
MgCl2Fluka63072

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
  4. Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
  5. Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
  6. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  7. Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
  8. Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
  9. Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
  10. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  12. Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
  13. Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  14. Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
  15. Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
  16. Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
  17. Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
  18. de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
  19. Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
  20. Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
  21. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
  22. de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
  23. de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
  24. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  25. Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
  26. O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  27. Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
  28. Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
  29. Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
  30. Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
  31. Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
  32. Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
  33. Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
  34. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Juxtasomal RecordingBiocytin LabelingCortical NeuronsAction Potential SpikingMorphological ReconstructionSensory CortexPatch PipettesCurrent InjectionsBiotin StainingDigital Reconstruction

Related Articles