Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Histokimyasal boyama

42.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

13 Mayıs 2014

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

Bu makalede

Özet

Bitki hücre duvarı bileşimi doku tipleri arasında farklılık gösterir ve lignin, selüloz, hemiselülozlar ve pektin içerebilir. Hücre tipi düzeyindeki farklılıkları görselleştirmek için çeşitli boyama teknikleri geliştirilmiştir. Bu makale, yaygın olarak kullanılan hücre duvarı boyama tekniklerinin bir derlemesidir.

Özet

Arabidopsis thaliana, bitkilerdeki çeşitli hücresel süreçleri anlamak ve manipüle etmek için yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır ve ikincil hücre duvarı oluşumu çalışmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. İkincil hücre duvarı birikimi, birincil hücre duvarı yerleştirildikten sonra meydana gelir, bu işlem yalnızca damar ve lif dokuları oluşturanlar gibi özel hücreler tarafından gerçekleştirilir. İkincil hücre duvarlarının çoğu selüloz (%40-50), hemiselüloz (%25-30) ve ligninden (%20-30) oluşur. İkincil hücre duvarı biyosentezini etkileyen birkaç mutasyon izole edilmiştir ve karşılık gelen mutantlar, bu mutasyonlar telafi edici yanıtlarla maskelenebileceğinden, belirgin biyokimyasal bileşim değişiklikleri veya görsel fenotipler gösterebilir veya göstermeyebilir. Boyama prosedürleri tarihsel olarak hücresel bazda farklılıklar göstermek için kullanılmıştır. Bu yöntemler yalnızca görsel analiz araçlarıdır; Bununla birlikte, hızlı ve eleştirel analizdeki rolleri büyük önem taşımaktadır. Kongo kırmızısı ve kalkoflor beyazı, polisakkaritleri tespit etmek için kullanılan lekelerdir, oysa Mäule ve phloroglucinol, lignin içindeki farklılıkları belirlemek için yaygın olarak kullanılır ve toluidin mavisi O, polisakkaritleri ve lignini diferansiyel olarak boyamak için kullanılır. Görünüşte basit kesit alma, boyama ve görüntüleme teknikleri yeni başlayanlar için zor olabilir. A. thaliana modelini kullanarak numune hazırlama ile başlayan bu çalışma, bitkilerin ikincil hücre duvarlarında hücre ve doku organizasyonunun gözlemlenmesi için kolayca uygulanabilecek çeşitli boyama metodolojilerinin protokollerini detaylandırmaktadır.

Giriş

Bitki hücre duvarı çeşitli bileşenlerine içinde bilgi bir bolluk tutar: lignin, selüloz, hemiselülozlar (ksilan, glucuronoxylan, ksiloglukan, arabinoksilan, karışık bağlantı glukan veya glukomannanı), ve pektin. Histolojik teknikler örgütsel ve hücresel düzeyde ikincil hücre duvarları içinde farklılıklarını inceleyerek önemli görsel ipuçları sağlar. Çeşitli histolojik teknikler geliştirilmiş ve literatürde bulunabilir, ama basit görsel talimatları ile çok detaylı protokoller nadiren hiç varsa, çünkü bu teknikler zor ve zaman alıcı yeni başlayanlar için olabilir. Bu çalışmanın amacı, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek histolojik boyama teknikleri için basit kurallar sağlamaktır.

Kök doku Kesit hücre duvarları ve hücre şekillerde görselleştirilmesi ilk adımdır. El-cut bölümler ucuz ve hazırlamak için daha az zaman alacak olsa da, bir vibratom kullanımı tutarlılığı sunar veyüksek kaliteli görüntü verir. Bir vibratome kullanarak keskin görüntüler üretmek için yardımcı olur ve önemli ölçüde sadece kötü bir örnek hazırlama neden olacağını numuneler arasındaki yanlış farklılıkları üretme riskini azaltır, aynı kalınlıkta, hatta bölümleri üreterek daha iyi veri kalitesini üreten sağlar. Taze örnekleri düzeltmek için reçineler kullanılarak yeni başlayanlar için zor olabilir ve bir şekilde analiz yapılması gerektiğinde hala bile uzmanlar için zaman alıcı olabilir. Buna ek olarak, bir reçine içine gömülü olduğu zaman numunenin herhangi bir biyolojik aktivitesini ölçmek mümkün olur. Agaroz ve ev yapımı bir kalıp kullanır Basit bir tekniktir kök dokuları gömmek için yararlı olduğunu ve aynı zamanda yumuşak dokuların diseksiyonu gerektiren uygulamalarda kullanılabilir. Reçine içinde gömme örnekleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, canlı dokuları tutmak ve örnek manipülasyon azaltma avantajına sahiptir. Bir vibratom yoluyla dokulara Kesit derece hassas ve homojen üretirÇalışmanın amacına bağlı olarak, daha sonra çeşitli boyama teknikleri ile kullanılabilir, lı bölümleri.

Lignin ve diğer aromatik maddelerin görselleştirmek için en basit yöntem, ultraviyole (UV) ışık kullanır. UV ışığı ile aromat bazlı moleküllerin uyarma eski bir tekniktir, ancak yine de lignin görüntülenmesi için hızlı yaklaşımlardan biridir. UV ışık diğer aromatikleri heyecanlandıracak Ancak, UV görselleştirme aslında lignin tespiti için ideal değildir. 1-3: Lignin esas olarak üç yapı, monolinyollere (koniferil alkol, sinapil alkol ve p-kumaril alkol hydroxycinnamyl alkolleri) oluşur. Phloroglucinol leke ksilem, lif, ve trakea dokularda 4 mevcut sinamaldehitler'in ölçüde ipuçları sağlayabilir. Phloroglucinol genel sinamaldehitler'in iyi bir göstergesi olduğunu ve sinamaldehitler'in ve diğer aromatik ayırt edebilirsiniz. Sinapil alkol monomerler algılanabilirve Maule leke kullanılmasıyla ayrılır. Toluidin mavisi O çok renkli bir boya ve bu nedenle farklı renklerde 5,6 hücre duvarının farklı unsurları leke yeteneğine sahiptir. Toluidin mavi O birincil kullanımı pektin ve lignin 5,6 tespit etmektir. Toluidin mavi O kullanmanın avantajı, hücre duvarının birçok unsuru tek bir aşamada görselleştirilebilir olmasıdır. Beyaz Kalkofluor ve Kongo Kırmızı hem de çalışmak için kolay ve selüloz görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz, ve diğer non-değiştirmiş veya zayıf ikame β-Glukan 6-9, kongo kırmızı lekeler, doğrudan özellikle 10,11-β (1 → 4)-Glukan ve selüloz oysa. Bu çalışmanın amacı A. yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yukarıda belirtilen boyama tekniklerinin kullanımı için basit kuralları sağlamaktır thaliana kaynaklanıyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Gömmeyi Kök

  1. Su içinde bir% 7 agaroz çözeltisi (distile su, 100 ml dereceli agaroz elektroforezi 7 g) elde edin. 20 dakika için otoklav ile ya da düşük yoğunlukta (1250 watt bir mikrodalga, örneğin,% 10 yoğunluk) 20 dakika boyunca mikrodalga ile agaroz eritilir.
  2. Plastik şişeleri kullanarak kaynaklanıyor gömmek için bir ev yapımı kalıp hazırlayın.
    1. Bir jilet kullanarak, bir 2 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüp (Bölüm A) konik alt kesti. , Bir şırınga iğnesi ile, gömülü olarak kök çapından biraz daha büyük boru kap içinde bir delik delinerek. Sonraki, bir 0.6 ml mikrosantrifüj tüp (Bölüm B) alt kısmına 0,5 cm kesti.
    2. Önceden kesilmiş 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine 0.6 ml mikrosantrifüj tüpü cut-off 0.5 cm kısmını ekleyin. Parafilm (Şekil 1) kullanılarak, iki parça kapatın. NOT: Tüpün alt Agaroz katılaşmış sonra gömülü numunenin çıkarılmasını kolaylaştırmak için kesilir. To kap içinde bir delik kök agaroz gömüldüğünde kök sabit tutulmasına yardımcı olur. Kalıp agaroz tutun ve gömerken kök düz tutmak için hizmet edecektir. Agaroz ayarlanır ve kök gömülü kadar Parafilm, iki parça, A ve B yapacak.
    3. Bir jilet kullanarak, ilgi alanı, (ilk kök boğum örneğin orta) bir kök bölümü kesti. NOT: İdeal olarak, kök sadece dehidratasyon yıkımı önlemek için gömmeden önce kesilmelidir. Seçenek olarak ise, sap geçici olarak su ile ıslatılmış filtre kağıdı içeren bir plaka saklanabilir. Bu plaka, doku su kaybını ve deformasyonunu önlemek için gömülü olması için hazır olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir. Yüksek nem olmadan 30 dakika daha uzun süreler için kök saklama kök kurumasına neden olur.
  3. Düşük yoğunlukta mikrodalgada agaroz eritin. DİKKAT: agaroz içeren şişe sıcak olabilir. Şişe almak için de eldiven kullanın. Erimiş agaroz diyelim(20 ° C ve 25 ° C arasında), oda sıcaklığında tand yaklaşık 50 ° C'ye soğuyana kadar
  4. Yavaş yavaş şişeyi doldurmak için önceden hazırlanmış plastik kalıp içine agaroz 5 ml pipetle. NOT: Emin kalıplar içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları agaroz kalıp boşlukları neden olur ve tamamen sonunda numune bölümlerinin düzensiz kesme yol açacaktır kök örneği, kapsamaz.
    1. Agaroz yarı katı olmak için 30 ila 60 saniye boyunca soğumaya bırakın. Nüfuz ve agaroz, yüzer ayağa olamaz, ama emin, küçük bir kürdan ile test edin. NOT: agaroz o hücre morfolojisi yok, kök aksatmanın tarafından örnek zarar verecektir hala sıcak olduğu zaman kök yerleştirilir ise.
    2. Bu agaroz dolu şişe içinde kök yerleştirin. Gövdesi düz kalır emin olun. Kök ucu, kapak tarafından düzenlenen bir şekilde delikli kapağı yerleştirin. Vidalı kapağı açmayın. Bazen (tek bir tür) bir kök daha embe olabilirTek bir şişede dded; ama bu özel durumda, kap kullanmayın. NOT: vidalı kapak açıksa, kök bükümlü alacak.
  5. Sertleşene kadar, 10-30 dakika süre ile, oda sıcaklığında ya da 4 ° C 'de şişeyi bırakın.
  6. Yavaşça tüpün dışına kaydırarak kalıp çıkarın. Parafilm açın. Bir cam mikroskop lamı üzerine Kısım A katılaşmış agaroz serbest bırakmak için parmak ile hafifçe kalıbın Kısım B alt itin.
  7. 1.2 cm uzunluğunda üç eşit parçaya agaroz gömülü kök kesilir. Agaroz değildi ve atın kök kısmını kesip.
    1. Gömülü olan agaroz bu parçaları Mağaza hava geçirmez bölüme hazır olana kadar 4 ° C'de bir siyah kutu içinde 2 ml mikrosantrifüj tüpleri kaynaklanıyor. Seçenek olarak ise, bir haftalık bir süre için 4 ° C'de tüpler saklayın. NOT: Depolama mümkündür, ama deneyci gömülü kaynaklanıyor hala hayatta ve deney olarak farkında olması gerekir, Eserler potansiyel tanıtıldı olabilir.

2.. Kesit alma Kök

  1. DİKKAT: dikkatle vibratome kılavuzunu okuyun ve tüm emniyet talimatlarını izleyin.
  2. Numune disk (herhangi bir katı veya sıvı ücretsiz) temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun. Önceki deneylerden herhangi bir kalıntı tutkal ve suyla yıkamak için bir traş makinesi bıçak ile numune diski temizleyin. Sonra bir kağıt havlu ile kurulayın. Not: Bu yapıştırıcı iyi çalışır ve agaroz numune bağlanan sağlayacaktır. Bu adımı düzgün yapılmazsa ise, numune diske uygun olmayabilir ve daha sonra numune kesit sırasında diske devrilmesine neden olasıdır.
    1. Kullanın yumuşak kağıt örnekler içeren agaroz blok herhangi bir nemi çıkarmak için mendil.
    2. Örnek disk üzerinde doku yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Çizgi yapışkan şişenin ucu kullanılarak plakanın ortasına bir alanı kapsayacak şekilde, yapışkan var. Çabuk yerAgaroz blok numuneler dik ya da sırasıyla, çapraz veya uzunlamasına kesitlerde, için plaka paralel olarak ya da olduğu kadar. Yapışkan 10-30 dakika için oda sıcaklığında ya da 4 ° C'de numune diske örnek düzeltmek için izin verin. NOT: Bu bir zaman duyarlı bir adımdır.
  3. Tampon tepsiye veya çukur üzerinde yerinde numune diski düzeltmek. Bölümleri ile agaroz blok / s jilet paralel olmalıdır. Örnekler tamamen gömülü olduğu kadar oda sıcaklığında damıtılmış su ile tampon tepsi doldurun.
  4. Yarısında jilet kesmek ve daha sonra bıçak tamamen düz kalır, böylece sağlam bir makasla uçlarını kesin. Bıçak tutucu üzerine önceden kesilmiş jilet yansım takın.
    1. 84 ° bıçak tutucuya açısını ayarlamak, 50 Hz (Vibratome pozisyon 5) 0.90 / sn mm (Vibratome pozisyon 8) ve frekans hızı. 100 um kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. Sürekli modunu kullanın. HAYIRTE: Bu kalınlık, doku boyama protokollerini kullanılan çeşitli asit ve baz tedavi dayanabilir emin olmak için seçildi. Kesit için pencere ayarlayın ve bölüm yaklaşık 1.2 cm'lik bir agaroz blok için Vibratome için sürekli bir modda 15-20 dk bekleyin.
  5. Tampon tepsisine kesit boyunca bir tek kullanımlık plastik pipet kullanarak bölümleri toplayın. Alternatif olarak, kısımlar, bir cam kabın içine tampon tepsiden aktarılır ve daha sonra berrak bir Petri levhaya edilebilir. 2.0 ml mikrosantrifüj tüplerine birkaç bölümleri aktarın. Not: numuneler saydam bir zemin üzerine bölümlerine bakınız daha kolay olduğu için, bir Petri plakasından toplanan ve tampon, tepsi bir sonraki numune için hazır olarak kabul edilebilir.
  6. Kesitler, 30-60 dakika boyunca 4 ° C de, 50 ml bir tüp içinde saklanan ya da toplandı ve 1,5-2 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde saklanabilir. NOT: Daha uzun süreler için bölümleri saklanması kötü görüntü kalitesine yol açacaktır.

Görüntüleme için 3. Mikroskop ve Kamera Ayarı

  1. Mikroskop Koehler aydınlatma ayarlayın. Bir hedef seçin. İlk numune odaklanın. Bir buçuk veya daha düşük bir ışık yoğunluğunu getirin. Alanında diyafram (FD) ve diyafram (AP) kapatın veya belirli bir hedef üzerinde mümkün olan en düşük ayara getirin.
    1. Büyütme kadar yüksek olursa, o kadar büyük halkası olacaktır. Gibi keskin mümkün olduğunca alan iris odaklanmak için kondansatör odaklanarak düğmeyi kullanın.
    2. Yavaşça kondansatör-merkezleme topuzlarını (Kondansörü çevreleyen iğne şeklindeki vida) kullanılarak merkeze alan iris (altıgen şekilli, küçük halka) resim getirecektir. Yavaşça alan iris kenarına ulaşır diyafram (FD) bu tür artış. Alan iris kenarını geçtikten hemen sonra FD artan durdurun.
    3. Yavaşça kontrastını ayarlamak için açıklığı (AP) artar. Gerektiği gibi ışık yoğunluğunu ayarlayın. NOT: Koehler aydınlatma her o için ayarlanması gerekiyorbjective, her deney gün. Gün için düzeltme yapıldıktan sonra elde edilen numaralarını not edin. Bu rakamlar hedefler o gün için ileri ve geri açıldığında her defasında yeniden edilecektir.
  2. Diyafram, şiddeti, maruz kalma süresi, kazanç, ve Tablo 1'de açıklandığı gibi filtreleri ayarlayın. Bu bilgiler sadece bir rehber olarak kullanılmalıdır.
  3. Floresan görüntü yakalamak için hiçbir mekanik obtüratör ile bir geniş format CCD çipi ile yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf makinesi kullanın; ve aydınlık alan görüntüler için yüksek çözünürlüklü, yüksek hızlı kamera.
  4. Standart yazılımı kullanarak slaytlar işleyin. Yazılımı yükleyin. "Al'ı" ve tıklayın "Set kamera / ütü masası," daha sonra kullanılacak kamera seçin. "Tamam" düğmesine tıklayın. Ardından "Al" Click "Renk sekmesinde." Altında "Renk sekmesinde," seçim "Bayer metodu" ve ardından "ortalama dört." Önerdi kazancı (kırmızı, yeşil, mavi) sağa sola eklem Tablo 1. "Set kaydetmek" sekmesini seçin ve görüntülerin saklanacağı dizinde tıklayın. Tablo 1'de önerileri "Pozlama süresi" olarak ayarlayın. "1" "binning" olarak ayarlayın ve "Canlı binning" ilgi bölgeye "1"., Odak ve sonra tıklayın "canlı kaydedin."
  5. Kamera yazılımı çıkış görüntüleri "TIF" formatında bulunmaktadır. Hücre tipleri için histokimyasal görüntüleri analiz edin. Sunum ve yayın aşağı kullanımlar için standart bilgisayar yazılımı kullanın.

4.. Ultraviyole ve Parlak alan Görüntüleme

  1. Bölümler kolayca pipetle böylece pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça pipet bölümler ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine. Bir kapak kayma bölümleri kapsayacak. UV ışığı veya parlak ışık altında alan bölümleri gözlemlemek.

5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Boyama 12

  1. % 3 phloroglucinol çözeltisi hazırlamak için, 10 ml mutlak etanol içinde 0.3 g floroglukinol çözülür. Etanol% 3 floroglukinol iki hacim için konsantre HCI (37 N), bir hacim karıştırın; Bu çözeltiye, phloroglucinol-HCl (Ph-HCI) veya Wiesner leke. NOT: Bu çözüm çözüm zamanla düşer ve boyama etkisiz hale gelecektir çünkü, boyamanın gününde taze yapılacak ve saklanabilir olamaz. DİKKAT: HCl oldukça yıpratıcıdır, Ph-HCl leke tutarken çok dikkatli kullanın.
  2. Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe Ph-HCl çözeltisi 1 ml ilave edilir ve Ph-HCl leke olarak HCl oldukça aşındırıcı, çünkü hemen kap. Yavaşça tüm bölümleri boyanır sağlamak için tüp hareket ettirin. Bu aşama için bir alternatif, Ph-HCl çözeltisi yukarı ve aşağı pipetle böylece tercihen saniye bozmadan, açık boru kap tutmaktırTIONS. NOT: Bu, bu bölümleri zarar verebileceğinden, pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun.
    1. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Kapak kayma bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. NOT: Ph-HCl çözüm örneklerinin bir bozulmaya neden, 5-10 dakika içinde kurur. Bu nedenle, görüntüleme bu süre içinde tamamlanması gerekmektedir.

6.. Maule Boyama 13,14

  1. % 0.5 'lik bir potasyum permanganat solüsyonu hazırlamak için, 40 ml damıtılmış su içerisinde potasyum permanganat, 0.2 g çözülür. 7 günlük bir süre boyunca oda sıcaklığında karanlık şişe içinde depolayın.
    1. 9 ml saf su (1:10) ile, 1 ml konsantre HCI (37 N) ilavesiyle, bir% 3.7 HCI solüsyonu hazırlayın. Taze bir% 3.7 HCl çözeltisi hazırlayınDeney günü. Kullanılan 37 N HCI stok çözümü çok eski olmadığından emin olun. Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi (14.8 M) azalan gelen doymuş çözeltisi molaritesini önlemek için 4 ° C'de depolanmalıdır.
  2. Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 1 ml ilave edilir.
    1. Tercihen bölümleri bozmadan, yavaşça yukarı ve aşağı% 0.5 potasyum permanganat çözüm pipetle. 2 dakika boyunca inkübe edin ve pipetleme tekrarlayın. Tüm bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp bekletin. NOT: bölümleri zarar verebilir gibi pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bu çözüm karanlık olduğu gibi kök bölümlere bakın, bu yüzden tüp rafa bölümleri ile tüp tutmak ve onları 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir.
    2. 1 ml pipet kullanarak,% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 700 ul çekmek.Potasyum permanganat solüsyonu çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Su çözeltisi berrak kalana kadar 3-4x tekrarlayın ya.
    3. Su atın. Derin bir kahverengi renk bölümlerde taburcu kadar hızlı% 3 HCl 1 ml ekleyin. Bu, 3-5 dakika içinde ortaya çıkabilir veya 5 dakika her 2 yıkar gerektirebilir. Tüm% 3 HCl çözümü Pipet ve hemen bir sonraki adıma geçin.
    4. Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi 1 ml ilave edilir. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde uç kesim ile 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Bir lamel ile bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. DİKKAT: amonyum hidroksit derece aşındırıcı olduğundan, mikroskop veya mercek aşamasına korozyona neden önlemek için ekstra bakım ve dikkat gerektirir. NOT: amonyum hidroksit dumanlar zor örneği gözlemlemek için yapım, lamel sis olabilir. Bu nedenle lamel eklemeden önce ekstra dikkatli olun. Çözelti 5-10 dakika içinde kurur, bu yüzden görüntüleme o süre içinde tamamlanması gerekmektedir.

7. Kongo Kırmızı Boyama 11,15

  1. % 0.5 'lik Kongo kırmızı bir çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 100 ml kırmızı Kongo 0.5 g çözülür.
  2. Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0.5 Kongo kırmızısı çözeltisi 1 ml ilave edilir. Yavaşça% 0.5 kongo kırmızı çözümü pipet ve aşağı bölümleri bozmadan. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun.
    1. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında kuluçkalama bir diğer 3 dakika ile izleyin.
    2. % 0.5 kongo kırmızı solüsyon 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Kongo kırmızı bir çözelti çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Yıkama çözeltisi kadar yıkama 3-4x Tekraraçıktır.
    3. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde kendi ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet, ve kapak örtün. 560/40 bir bant geçiren bir filtre kullanılarak mavi ışık uyarma altında mikroskop lamı üzerine örnekleri gözlemlemek. NOT: Su 10-30 dakika içinde kongo kırmızı yıkayın gibi, önce mikroskopik analiz için uzun süre suda bölümleri tutmayın.

8. Kalkofluor Beyazı Boyama 9

  1. % 0,2 'lik bir stok çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 10 ml (beyaz Kalkofluor M2R'den) fluoresan parlatıcı 28 0.02 g çözülür. % 0.2 'lik çözelti, 4 ° C de karanlık bir şişe içinde, altı ay boyunca saklanabilir Damıtılmış su ile% 0.2 'lik stok çözeltisi 10x seyreltilerek% 0.02' lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
  2. Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. % 0.02 calcof en boru 1 ml ekleluor beyaz çözelti. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% calcofluor beyaz çözüm pipetle. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun.
    1. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında bir diğer 3 dakika için bölümü inkübe edin. NOT: bölümleri daha kolay bölümlere zarar vermeden çözüm pipetle yapmak için tüpün dibine çökmesine izin verilmektedir.
    2. % 0.02 calcofluor beyaz solüsyon 700 ul çekmek ve distile su 700 ul eklemek için 1 ml pipet kullanın; 5 dk calcofluor beyaz çözümü çalkalamak için bekleyin. Yıkandıkları 3-4x tekrarlayın. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle olabilir Bu şekilde olarak pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın.
    3. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. UV ışık altında bölümleri gözlemlemek.

9. Toluidine Blue O Boyama 16,17

  1. A% 0.02 çözeltisi hazırlamak için 100 ml damıtılmış su içinde 0.02 g toluidin mavi O çözülür. NOT: toluidin mavi O çözelti, oda sıcaklığında karanlık şişe iki hafta içinde saklanabilir.
  2. Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0,02 toluidin mavi O solüsyonun 1 ml ilave edilir. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% toluidin mavisi O çözüm pipetle. Daha sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve bir kez tekrar pipetleme. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp hala bekletin. Bu çözüm karanlık olduğu gibi, görmek, bu yüzden tüp rafa bölümleri içeren tüp tutmak ve onları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir.
    1. % 0.02 toluidin mavisi O çözeltisi 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Toluidin mavi O sol dışarı durulama için distile su 700 ul ekleyinution. 3-4x tekrarlayın veya yıkama solüsyonu kadar açıktır. Bölümler onlara zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın.
    2. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Gömme ve kesit Kök:
Gömmek için ev yapımı plastik kalıp kullanımı agaroz hızlı ve kolay (Şekil 1) kanıtladı% 7 kaynaklanıyor. İki parça (A ve B; Şekil 1) gömülü flakon sistemin basit kolayca temiz sistemini tutmak, agaroz atıl olan şişe parçaları sopa değil gibi agaroz gömülü kök serbest bırakmak için yapmak. Vialler yıl için birden çok kez tekrar edilebilir. Gömülü kök depolamak kolaylık da sonraki adımları kolaylaştırır. , Bazen gömülü benzer kurtarmak için kaynaklanıyor kesit ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

A. thaliana sap bölümleri yaygın olarak sekonder hücre duvarındaki hücre organizasyonunu incelemek ve niteliksel olarak vahşi tip ve transjenik bitkiler arasındaki farklılıkları incelemek için kullanılır. Örneklerin kesit için yaygın olarak kullanılan teknikler doğrudan el kesme vardır; numuneleri agaroz veya sabitleyici gömülü olduğunda ya da kesit bir vibratome veya mikrotom ile yapılabilir. Helisli aksine, sadece son iki numune ve düzgün olmayan yüzeyler arasında kalınlık farklılıklarından kaynaklanan kötü b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir mali çatışması yoktur.

Teşekkürler

Biz düzenleme yardım için Sabin Russell müteşekkiriz. Bu çalışma (http://www.jbei.org) ABD Enerji Bölümü, Bilim, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi, Ofisi tarafından desteklenen DOE Ortak Biyoenerji Enstitüsü parçası oldu Lawrence Berkeley arasındaki sözleşme DE-AC02-05CH11231 yoluyla Ulusal Laboratuvarı ve ABD Enerji Bakanlığı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgarozEMDMERC2125CAS Numarası: 9012-36-6
PhloroglucinolSigmaP 35021,3,5-trihidroksibenzen [CAS Numarası: 108-73-6]
Hidroklorik asitEMDHX0603-75CAS Numarası: 7647-01-0
Amonyum hidroksitEMDAX1303-6CAS Numarası: 1336-21-6
Toulidin Mavi OSigmaT3260Bluten klorür, Tolonyum Klorür [CAS Numarası 92-31-9] 
Potasyum permanganatSigma223468CAS Numarası 7722-64-7 
Etanol 190 geçirmezKOPTECV1401CAS Numarası: 64-17-5
Kongo KırmızıSigma C6277Disodyum 3,3 '- [[1,1'-bifenil] -4,4'-diylbis (azo)] bis (4-aminonaftalin 1-sülfonat) [CAS Numarası 573-58-0]
Floresan Parlatıcı 28 / Calcofluor Beyaz LekeSigmaF3543 & nbsp;4,4'-Bis[[4-[bis(2-hidroksietil)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-il]amino]stilben-2,2'-disülfonik asit [CAS Numarası 4404-43-7] 
VibratomLeicaLeica Titreşimli bıçak mikrotom VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
RazorAmerikan Güvenlik tıraş bıçağı şirketiÜrün # 60-0139-0000 Paslanmaz Çelik Çift Kenarlı Bıçak (Personna Super)
Vidalı Kapaklı Mikrosantrifüj Tüpleri (2 ml)VWR16466-044
Mikrosantrifüj Tüpleri (0.6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
MittBel-Art380000000SCIENCEWARE  Sıcak El Koruyucu Eldiven
Doku yapıştırıcısıTed Pella Inc100334 & ° C'de saklayın; C veya 20 & derece; 3 ay veya daha uzun süre saklama için C
MikrodalgaPanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 Anında doku yapıştırıcısı 
Mekanik deklanşörsüz CCD çipli kamera HamamatsuC4742-95
Yüksek hızlı renkli kamera     QImagingMicroPublisher 5.0 RTV
Kamera yazılımı   Moleküler CihazlarMetaMorph sürüm 7.7.0.0
Hayal analizi Adobe Photoshop CS4
Mikro Kapaklı Gözlükler, Kare, No. 1VWR48366-06722 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Kapak camları korozyona dayanıklıdır ve eşit kalınlıkta ve düzdür. 1 numaralı kalınlık 0,13 ila 0,17 mm'dir.
Buzlu Mikro Kızaklar, 1 mmVWR48312-00375 x 25 mm - 1 mm
Parafilm MAlcan ambalajBRNDPM998
TX2 Filtre küpüLeica11513851/11513885560/40 bant geçiren Kongo kırmızısı analizi için kullanılan filtre.

Kaynaklar

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
  2. Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin biosynthesis and structure. Plant physiology. 153, 895-905 (2010).
  3. Humphreys, J. M., Chapple, C. Rewriting the lignin roadmap. Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).
  4. Adler, E. Lignin chemistry—past, present and future. Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).
  5. Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue. 59, 368-373 (1964).
  6. Mori, B., Bellani, L. M. Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls. Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).
  7. Maeda, H., Ishida, N. Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener. Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).
  8. Wood, P. J. Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides. Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).
  9. Hughes, J., McCully, M. E. The use of an optical brightener in the study of plant structure. Stain technology. 50, 319-329 (1975).
  10. Verbelen, J. P., Kerstens, S. Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants. Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).
  11. Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots. Plant physiology. 152, 787-796 (2010).
  12. Liljegren, S. Phloroglucinol Stain for Lignin. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  13. Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).
  14. Sibout, R., et al. CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis. The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).
  15. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).
  16. Yeung, E. A beginner's guide to the study of plant structure. Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).
  17. Turner, S. R., Somerville, C. R. Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall). The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).
  18. Iiyama, K., Pant, R. The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin. Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).
  19. Yang, F., et al. Engineering secondary cell wall deposition in plants. Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).
  20. Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants. Plant physiology. 123, 59-70 (2000).
  21. Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway. The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).
  22. Fagard, M., et al. PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis. The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Bitki G vdesi Kesit AlmaKongo K rm z s BoyamaCalcofluor White BoyamaToluidin Mavisi O BoyamaFluorol BoyamaMALS BoyamaFloroglusinol Boyama
Histokimyasal boyama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.