İnce tabaka kromatografi (TLC) Ayırımı ve bitki özleri Biyodenemeler Antimikrobiyal Bileşikler tanımak

Özet

Yöntem bitki özleri, ince katman kromatografisi (TLC) ile ayırma antibakteriyel metabolitlerin tespit etmek için iletişim bioautography açıklanmaktadır. Yöntem sığır işkembe için yerel aşırı amonyak üreten bakteri (HAB) inhibe kırmızı yonca fenolik bileşiklerin taranması uygulanır.

Özet

Bitki antimikrobiyal bileşikler için ortak bir elek (örneğin, bakteri veya mantarların suyu içinde veya agar), mikroplar için zaman büyümeye izin veren mikrobiyal süspansiyonlar için kromatogramlar maruz bırakılması, kağıt ya da ince-tabaka kromatografisi (PC veya TLC) ile ayırma bitki özleri oluşmaktadır nemli bir ortam, ve mikrobik büyüme bölgeleri görselleştirme. Bioautography olarak bilinen bu tarama yönteminin, etkinliği, kromatografik ayırma kalitesi ve mikrobiyal kültür koşulları ile alınan bakım hem de bağlıdır. Bu kağıt asit fermente bakterileri amino yeni bir uygulama ile TLC ve temas bioautography için standart protokoller açıklanmaktadır. Ekstre esnek (alüminyum destekli), silika TLC plakaları üzerinde ayrılmış ve bantlar ultraviyole (UV) ışık altında görselleştirilebilir. Bölgeleri Test mikroorganizma ile aşılanmış agar üzerine kesilmiş ve yüzü aşağı inkübe edilir. İnhibitör grupları agar plaka lekeleme ile görselleştirildis ile tetrazolyum kırmızı. Yöntem, kırmızı yonca ayrılmasından (Trifolium pratense ev. Kenland) fenolik bileşikler ve Clostridium sticklandii, sığır işkembe özgüdür bir hiper amonyak üreten bir bakterinin (HAB) karşı aktivite için, bunların yapılan tarama uygulanır. TLC yöntemleri (aerobik veya anaerobik), hem de mantar bitki özleri ve diğer bakteri türleri arasında, çok çeşitli kültür koşulları için geçerlidir türün büyüme gereklerine uyacak şekilde tadil edilmiş halinde, test organizmalarının olarak kullanılabilir.

Giriş

Bitkilerde antimikrobiyal bileşikler için tahlil, bir bitki ekstraktı bileşenlerinin ayrılması ve bu bileşenlerin, bir test mikroorganizmanın maruz bırakılması, ve mikroorganizmaların büyüme bileşiklerin herhangi biri ile inhibe olup olmadığının belirlenmesini gerektirir. Birçok bileşik düzlemsel bir yüzeye ayrılabilir, çünkü kağıt veya ince tabakalı kromatografi (PC veya TLC) ile Separations uygundur. Ayırma bazı bileşikler, adsorban (PC durumunda selüloz, ve TLC durumunda adsorbanların çeşitli) sıkıca bağlanması ve diğerlerine ¹ daha az geçirme ile, polarite dayanmaktadır. Şekil 1, göreli pozisyonlarının bir örnek teşkil silis TLC plakası üzerinde ayrılmasından sonra, polar ve polar olmayan fenolik bileşikler.

Şekil 1. Bir silika ince tabakalı kromatografi (TLC) üzerinde plaka ayrıldıktan sonra farklı polariteye sahip bileşiklerin dağılımı gösteren bir diyagramdır. Kırmızı yonca (Trifolium pratense L.) fenolik bileşikler, bir örnek olarak kullanılmaktadır. Örneğin clovamide gibi Polar bileşikler, silika gibi bir polar adsorban için güçlü bir afiniteye sahip ve kökeni (OR) yakın devam ederken böyle bir çözücü önünde yakınındaki üç izoflavon (SF), bölme daha kolay çözücü içine daha az polar bileşikler, (su, asitler, bazlar ya da içerdiği sürece, silika daha az polar olan) ve daha uzak plaka yukarı göç ederler.

Bir TLC plakası üzerinde bir ekstresinin ayrılmasından sonra, deney mikroorganizmalar bu nedenle bir özü ^2'nin aktif bileşenlerinin tanımlanmasını hız, plaka üzerinde tüm bileşiklere maruz kalabilir. , Bir mantar ya da bakteri kültürü kromatogramında maruz kalırsa, mikrobiyal büyüme büyüme inhibitörü olan alanlarda dışında her yerde ortaya çıkary bileşikler yer alır. Engel bölgeleri daha sonra mantar ³ uygulanmış olması halinde miselial büyüme ve büyüme içermeyen alanlar arasındaki kontrast gözlemleyerek ya da canlı hücreler ⁴ azaltılabilir ya da hidrolize edilmiş renk değiştiren bileşiklerle püskürtme ile görselleştirilebilir. Antimikrobiyal tahliller için kağıt veya ince tabakalı kromatogramların kullanımı ilk antibiyotik ⁵ ve mantar öldürücüler ^3,6 uygulandı, ancak, bitki ekstreleri, sık sık bioautography olarak adlandırılan bu yöntemle antimikrobiyal bileşikler için taranmaktadır. Bu buluşta tarif edilen protokoller, ince tabakalı kromatogramların bioautography için de geçerlidir. Nispeten hızlıdır ve farklı adsorban (örneğin, silika, nişasta, alümina), hem de iyi bir çözünürlük ve hassasiyeti ¹ sağlanması gerçekleştirilebilir, çünkü TLC yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bitki özleri birçok yönden TLC için hazırlanabilir. Yaygın yöntemler ALC açılan bitki materyali içerirörneğin muhtemelen bir asit veya baz ⁹ eklenmesiyle% 80 etanol ^7,8 yanı ohol-su karışımları. Bir minimal hacimde TLC plakalarına tatbik edilebilir, böylece bir miktar su içerir ve muhtemelen, asidik veya bazik olan bu gibi çözgenler içinde, bir ekstre edilmesinden sonra, ekstreler konsantre edilmelidir. Alkol-su özleri konsantrasyonu, su ile karışmayan bir organik çözücü ⁸ ile ya da etil asetat-etil eter (1:1, v / v) ^10,11 gibi çözücülerin bir karışımı ile bölünmesi ile elde edilebilir. Farklı bitki metabolitleri, kutupları bağlı olarak, farklı bir organik çözücü içine ekstre edilmektedir. Bu bitki, organik asitler ya da bazlar, bu aşamada, organik çözücüler ile ekstre emin olmak için, bir alkol-su ekstrenin pH yükseltilmiş veya daha sonra da nondissociated formları haline ayrışmış analitlerin dönüştürmek için bir suda çözünür bir asit veya baz ile düşürülebilir nötr organik çözücü ⁹ çözünür. Organik faz daha sonra e olabilir,indirgenmiş basınç altında ya da azot altında vaporated ve TLC için istenen hacme ayarlanabilir. Ekstrenin pH nötr solventler, küçük bir nihai hacme, önceki ayırma TLC plakası üzerinde ekstraktın buharlaştırılması içine analitlerin bölünmesi nedeniyle biyolojik tayin mikroorganizmalar için öldürücü olması pek mümkün değildir.

Mantar ve bakteri her ikisi de ^2, bitki ekstrelerinin bioautography test mikroorganizmalar gibi kullanılır. Bir besleyici çözelti içinde plakalar üzerine püskürtülür ve birkaç gün ³ boyunca nemli bir ortamda inkübe bu tür Cladosporium cucumerinum gibi bazı mantarlar, sporları, (ayrı önleyici bileşikler ile alanlardan) TLC plakalar üzerinde filizlenmesi. C. karanlık miselyum noninhibitory bölgeler üzerinde cucumerinum misel büyüme serbest bölgelere keskin bir kontrast sağlar. Bakteriler ile aynı şekilde ^4,12 ince tabakalı kromatografi (TLC) plakaları uygulanmış olsa da, bakteriler, TLC üzerinde dökülüragar plaka yüzeyleri ^13,14 bindirmeleri. Örneğin Candida albicans gibi maya, hem de ¹⁴ agar kaplamalar olarak uygulanabilir. Seçenek olarak ise, TLC levhaları, bakteri ya da maya ^{8 10,15,} kontak bioautography ² olarak bilinen bir yöntem ile aşılanmış agar üzerine yüzü aşağı yerleştirilebilir.

Bu, kırmızı yonca (Trifolium pratense ev. Kenland) için antimikrobiyal fenolik bileşiklerin taranması için temas bioautography için bir yöntem tarif eder. Test mikroorganizma Clostridium sticklandii, bir rumen hiper amonyak üreten bakteri (HAB) ve anaerob zorunlu olduğunu. Kullanılan ayırma ekstrenin tüm bileşenlerini gidermek de, böylece olası antimikrobiyal bileşiklerin havuz daralma, antimikrobiyal aktivite bölgelerin belirlenmesini kolaylaştırır. Protokol TLC ¹ için standart yöntemler kullanmaktadır. Bu protokol, aynı zamanda kültür obli için gerekli olan bazı teknikler açıklanmaktadırBöyle bir tahlil için kapı anaeroblar canlı hücreler ^2,4 lekeleyen bir tetrazolyum tuzu ile temas bioautography ¹⁵ ve bir görselleştirme yöntemi, bir kullanım.

Protokol

1.. Bitki Özü hazırlanması

1. Pratense cv fenolik bileşiklerin çıkarılması için Kağan ve Flythe ¹⁰ Bkz. Kenland.
2. Diğer bitkilerde diğer bileşikler ayıklamak için, (pek tarif edilir) bitki veya metaboliti özel ekstraksiyon yöntemleri için fitokimyasal analizi literatürü kontrol veya geniş birçok bileşikleri izole böyle Khurram ve ark. ^7,8 olanlar gibi protokoller için bakmak kutuplulukların aralığı.

2. İnce tabaka levhası hazırlanması

1. Uzak gelişim bölgesinden adsorbe kirletici maddelerin hareket ettirmek amacıyla, bir veya daha fazla polar nötr çözücü maddeler içinde geliştirerek temiz TLC plakaları.
   1. Bir duman başlığı içinde, yeterli temizlik çözücü hazırlanması (etil asetat-metanol 2:1, örneğin 15-100 ml, v / v) TLC gelişmekte olan odasının alt, hem de bir TLC levhasının alt kenarı grubu kapsayacak odasının içine.
   2. Ticari ürünler kullanınlikle mevcut cam TLC veya folyo kaplı Pyrex kaplardan ya da konserve kavanozu (kapaklı mevcut farklı boyutlarda,) odaları gelişmekte.
   3. Alüminyum-ya da mevcut gelişmekte odasını uygun, çeşitli boyutlarda (20 cm x 20 cm ve daha küçük) gelip plastik destekli (esnek) silika jel plakaları kesmek için makas kullanın. (Dikkat:. Silis solunması halinde bir davlumbaz çalışın akciğer hasarına neden ve silis üzerine deri yağlarını önlemek için eldiven ile TLC plakaları işleyebilir.)
   4. Odası duvarlarına yaslanmış üstleri ile, bölmenin içine plakaları yerleştirin. Plakalar birbirine temas etmemelidir. Bölmesi kapağı ve çözücü kılcal eylem tarafından plakasını yukarı hareket edelim.
   5. Solvent levhaların üst ulaştığı zaman, odasından plakaları kaldırmak ve çözücü buharlaştırıldı kadar çeker ocak içinde bir ayakta durma konumunda düzenlemek.
   6. Kirlilikler görünür altında sarı bir bant bakarak TLC plakasının üstüne yakın göç olmadığını görmek için kontrol edinışık, veya ultraviyole altında floresan bant (UV) ışık (Şekil 2B "kirlilik ön" veya IF bakınız). Levhanın çoğunluğu yine sarımsı bir renk varsa, temizleme işlemini tekrarlayın.
   7. Odasından TLC plakaları ayrılmasından sonra, çözücü atın. Bakiye solvent Protokolü 2 odacığı kullanılarak önce tamamen buharlaşmasına izin verin.
   8. Bir 20 cm x 20 cm plaka, ve x 10 cm plakalar 7 cm boyunca 5 dakika boyunca silis ¹⁶ üzerinde bileşiklerin göç etkileyebilir kalan nemi çıkarmak için 100 ° C'de bir kurutma fırınında dik destek plakaları (10-15 min .)
   9. 100 ° C kurutma fırını kullanılabilir durumda değilse, daha düşük sıcaklıklarda (60 ° C 'de, yani 40 dakika) daha uzun bir süre için bir ısı plakalar.
   10. Plakalar kuruduktan sonra, yüklemeden önce çevre sıcaklığına soğumaya bırakın.

3. Özü Ayrılık için Chambers geliştirilmesi hazırlanması

1. Biraz kamara yükseklikten aşağıda filtre bir parça kağıt, ve genişliği yaklaşık yarım kamara çevresini kesmek için makas kullanın. Bu kağıt, böylece ayırımlar ¹ çoğaltılabilmesini iyileştirilmesi, bölme duvar solvent ve solvent buharları ile odasını doyurmak çizmek için bir fitil gibi davranır.
2. Bir duman başlığı içinde, çözücü (bu çalışma için etil asetat-metanol 04:01, v / v) karışımı. Odacık içine dökün ve çözücü karışımı kapsamaktadır. Tüm fitil çözücü ile ıslak kadar odasına tabak koymak, oda doygunluk belirten bekleyin.

4. TLC Plakaların yükleme ve Geliştirme

1. Hafifçe kalemle kökeni işaretleyin. TLC plakası emen yumuşak ve kolay zarar ise, kenarlarda işaretleri yapmak. Bileşikler plakaları TLC haznesine eklenir gelişmekte çözücünün yüzeyi üzerinde olmalıdır.
2. Yerine bulanık bir konsantre çözelti olması için yeterli organik çözücü (bu durumda, metanol) içerisinde özü çözülürsüspansiyon.
3. Plakanın yüzüne bir 1 cm sınır bırakarak bir mikrolitre şırınga ya da kılcal mikropipetler ile dar şeritler halinde yük numuneleri ve standartları,. Bantları (davlumbaz plaka havalandırarak ya da yükleme olur) kurumasını bekleyin.
4. Örnek daha büyük bir konsantrasyon kurutuldu, bantlar yeniden yükleme örnekleri bir plaka, "overspot" ile ilgili gerekli ise.
5. Forseps ya da maşa ile, doymuş TLC odasının içine plaka (lar) ayarlayın. Bu nedenle bileşiğin göç yolunu değiştiren, temas noktalarında plakalara solvent sağlayabilir, çünkü levhalar fitil temas etmemelidir. Bölmesi kapağı ve plakalar geliştirmeye izin.

5. Biyolojik deney için Plakaların hazırlanması

1. Çözücü, ön plakasının üstüne ulaşmadan TLC tankı plakasını (ler) çıkarın ve bir kalem ile çözücü ön yüksekliğini işaretleyiniz. Davlumbaz plaka kurumasını bekleyin.
   1. Ge olan aynı TLC odası, herhangi bir geri kalan TLC plakaları geliştirilmesitutulması halinde bir gün boyunca Ekseriyetle kullanılabilir kapatıldı. Odacık içinde çözücünün miktarı azalır, özellikle eğer TLC bölmesi için çözücü karışımı versiyonu.
2. Plakalar kuru sonra, görünür veya UV ışık altında bantları görselleştirmek, ve bir kalem ile bantları tasvir. Lamba 254 nm (kısa dalga UV) ve 365 nm (uzun dalga UV) hem de eden bileşikleri tespit edebilir, özellikle de bir taşınabilir bir UV lambası ile bir görüntüleme odası, uygundur.
   Not: Bu noktada, ya da bir sonraki aşamada sonra, plakalar folyo ile kaplanmış, plastik sargı sarılmış olabilir ve -20 ° C'de saklanır Maksimum saklama süresi bileşik istikrar bağlıdır. Silika nötr değildir, çünkü bazı bileşikler TLC plakası üzerinde süre düşebilir.
3. Plakaları fotoğraf veya çizin.
   1. Havai UV ve / veya görünür ışıkları ile donatılmış bir varsa bir jel biyomikroskop sistemi kullanın.
   2. Hiçbir ticari biyomikroskop sistemi varsa, bir kutu içinde fotoğraf plakaları wi, karanlık bir kağıt veya bezle kaplıBir tripod üzerinde kamera seti ve taşınabilir UV ışığı inci ¹⁷ durmak bir halka kenetlenir. Hiçbir floresan göstergesi var tabak fotoğrafı çekerken, bant görünümünü ¹⁷ iyileştirmek için kamera lensi üzerinde bir mavi ışık filtresi kullanın.
4. , Bantlar karakterize yardımcı bileşiği ve solvent ön tarafından seyahat mesafe ölçme ve ikinci (Şekil 2A) ile önceki bölünerek tutma faktörü _(Rf) değerlerini hesaplamak için.

6. Bakteri kültürü ve Deneyi

1. Hazırlayın ve anaerobik koşullarda ortamı aşılamak. Bu durumda kullanılan kültür James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY kültür koleksiyonundan elde edildi Clostridium sticklandii soyu SR oldu.
   1. Flythe ve Kagan ¹³ ve HAB medya açıklaması için malzeme listesine bakınız.
2. Üslü veya sabit faza kültür büyütün. Steril anaerobik techniqu kullanınes anaerobik mikroorganizmalar ile çalışırken.
3. En az 60 ° C'ye düşmüştür agar (a / h% 0.75) sıcaklığından sonra erimiş agar içine (% 1 v / v) kültürü inoküle İyice karıştırın ve hemen dökmek için (HAB medya için% 95 CO ₂ -5% H ₂ atmosfer) bir anaerobik odasına getirmek.
4. 15 mm x 100 mm plastik Petri kapları içine dökün ve katılaşmaya izin.
5. Makas ile, ilgi konusu grup (lar) ihtiva eden bölgeye TLC plaka kesti. Bantları TLC plakası üzerinde orijinal yönü izlemek için plaka desteğinde bantları işaretleme, agar plakaları üzerine yüz aşağı yatıyordu. Bir kontrol olarak agar plaka üzerine kullanılmayan bir TLC şeridi yatıyordu.
6. Agar, aşağı tarafı ağar, anaerobik odasındaki (24 saat, 39 ° C) inkübe.

7. Biyoanaliz Agar Plakaların Görselleştirme

1. Anaerobik odası içinde iken forseps ile, agar levhalarından bantları çıkarın.
2. % 1 ekleme (w / v) tesu içinde hazırlanabilir trazolium kırmızı, agar plakalarının yüzeyleri üzerine damla damla eklenir. Kontrol plakası, anaerobik bölmeden çıkarmadan önce, tam olarak kırmızı olana kadar renk en az 20 dakika boyunca geliştirmek ya da izin verir. Anaerobik bakteri hemen havasız odadan çıkarıldıktan sonra canlılığı kaybetmeye başlar, ancak renk fazla 24 saat boyunca stabildir.
3. Görünür ışık altında fotoğraf.

Sonuçlar

Kırmızı yonca (Trifolium pratense ev. Kenland) ekstreler fenolik bileşikleri ihtiva eden, temsili silis TLC ayrımı, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Etil asetat-heksan içinde kırmızı yonca özütünün ayrılması (9:1, v / v), 8.5 cm den fazla, beş bantları, tam olarak kökenli çözülmüş bir (Şekil 2A) ile sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, Şekil 2B, kırmızı yonca özütü (aynı çeşidinden, ancak aynı çiftlikte ayrı bir arsa yetiştirilen) farklı bir numune daha büyük bir m...

Tartışma

Bu protokol bileşikler alt-grup halinde bir özü ayrılması ve kontakt bioautography ile bu alt kümeleri test etmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Yöntem, belsoğukluğu neden olan bakteriler için inhibitör bitki metabolitleri için ekrana Chomnawang ve ark. ¹⁵ tarafından kullanılan birine oldukça benzer. Antimikrobiyal bitkisel bileşikler için ekrana kullanılan bioautography tipi testi mikroorganizma, laboratuar kurulumu ve biyodeney gerçekleştiren kişi (ler) tercihlerine dahil olmak üzere birço...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Silika F254 TLC plakalar, alüminyum destekli, 0,2 mm kalınlık, 20 cm x 20 cm	EMD Kimyasalları	5554/7	Bu plakalar, 254 nm'de floresan bir indikatör içeren silika ile kaplanmıştır. Bu dalga boyunda emilen bileşikler, floresan yeşil bir arka plan üzerinde koyu görünür. Alternatif kaynaklar arasında Analtech, Selecto Scientific, Fluka bulunmaktadır. Silika dışındaki adsorbanlara ihtiyaç duyulabilir. Kullanılacak solventlere bağlı olarak plastik destekli plakalar uygun olabilir.
Keskin, ağır hizmet tipi makaslar	Fiskars 175800-1002'ye benzer	herhangi bir dikiş tedarik şirketi	TLC plakalarını kesmek için. Keskin bıçaklı bir kağıt kesici de kullanılabilir. Silika tozunu solumayın.
100 ° C'de kurutma fırını; C (mekanik konveksiyon)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC odası	Kimble Chase	416180-0000	Alternatif kaynaklar:  Atalay. Küçük tabaklar için (yani 5 cm x 10 cm) Pyrex beherleri veya konserve kavanozları kullanılabilir. Alüminyum folyo ile örtün (kavanoz kapakları solvent buharları ile ekstrakte edilebilen malzeme içerebilir).
50 ve mikro; l Düz iğne uçlu şırınga	Hamilton	80965	5-10 &mikro;l.  aşan standart veya numune yükleme miktarları için Alternatif kaynaklar eşdeğerdir.
Mikropipetler	Drummond	2-000-001	Az miktarda standart veya numune yüklemek için. Alternatif kaynaklar:  VWR.  Ayrıca, Pasteur pipetleri bir bütan meşale ile daha ince bir çapa kadar gerilebilir.
Filtre kağıdı (#1 sınıf)	Whatman	1001 917	Oda fitili görevi görür. Diğer filtre kağıdı sınıfları uygundur. Bu boyut, 20 cm x 20 cm'lik plakaların bulunduğu odacıklar için kesilebilir.
Beher maşası	Fisher Scientific	15-186	Plakaları büyük bir TLC haznesinin içine ve dışına koymak için. Alternatif kaynaklar: VWR
Düz kenarlı forseps	Fisher Scientific	10-275	Plakaları küçük bir haznenin içine ve dışına koymak için. Alternatif kaynaklar: VWR
ve uzun dalga UV ışık aydınlatması için 4 W veya 6 W ampullü küçük taşınabilir UV lambası (sırasıyla 254 ve 365 nm)	Ultraviyole Ürünler	95-0271-01	Alternatif kaynaklar: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
El tipi UV lambası ile kullanım için görüntüleme kabini	Ultraviyole Ürünler	Chromato-Vue C-10E	UV aktif bantlar, plakalar buraya yerleştirilebilirse daha kolay daire içine alınır. Alternatif kaynaklar: Spectronics Corporation.
Tepe UV lambalı ve görünür lambalı fotodokümantasyon sistemi	Kodak	Gel Logic 200	Alternatif kaynaklar: Ultraviyole Ürünler (www.uvp.com).  Ev yapımı alternatif için protokole bakın.
Anaerobik Oda, Tip A, Vinil Coy		7150000	Bu oda, tarif edildiği gibi Clostridium sticklandii gibi anaerobik bakteriler için uygundur. Bununla birlikte, büyüme koşulları, tahlilde kullanılan organizmaya göre uyarlanmalıdır. Patojen organizmalar kullanılıyorsa biyogüvenlik kabini ve diğer önlemler alınmalıdır. Alternatif kaynaklar: Anaerob Systems, BioRad, Plas Labs, diğerleri
Tetrazolium kırmızı	Sigma-Aldrich	T8877	Alternatif kaynaklar: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
HAB media için malzemeler
>Pyridoxamine · 2HCl	Sigma-Aldrich	P9380	Bunun için ve bu tablodaki diğer tüm reaktifler için alternatif kaynaklar eşdeğerdir.
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R4500
Tiamin HCl	Sigma-Aldrich	T3902
Nikotinamid	Sigma-Aldrich	N3376
Kalsiyum D-Pantotenat	Sigma-Aldrich	C8731
Lipoik Asit	Sigma-Aldrich	T5625
p-Aminobenzoik asit	Sigma-Aldrich	A9878
Folik asit	Sigma-Aldrich	F8798
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Kobalamin	Sigma-Aldrich	C3607
Piridoksal HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Piridoksin	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Demir sülfat ve orta nokta; 7H < alt > 2 < / alt >O	Sigma-Aldrich	F8263
Çinko sülfat ve orta nokta; 7H < alt > 2 < / alt >O	Sigma-Aldrich	Z0251
Manganez klorür ve orta nokta; 4H2< / sub>O	Sigma-Aldrich	M8054
Borik asit	Sigma-Aldrich	B6768
Kobalt klorür ve orta nokta; 6H < alt > 2 < / sub>O	Sigma-Aldrich	C8661
Bakır klorür ve orta nokta; 2H < alt > 2 < / sub>O	Sigma-Aldrich
Nikel klorür ve orta nokta; 6H2O	Sigma-Aldrich	203866
Sodyum molibdat ve orta nokta; 2H2O	Sigma-Aldrich	331058
Triptikaz (Kazeinin pankreas sindirimi)	Thermo Fisher	B11921
Potasyum fosfat monobazik susuz	Thermo Fisher	P284
Sodyum karbonat ve orta nokta; H2O	Thermo Fisher	S636
Agar	Thermo Fisher	50841063
Magnezyum sülfat ve orta nokta; 6H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
Kalsiyum klorür ve orta nokta; 2H2O	Thermo Fisher	BP510
Sistein HCl	Thermo Fisher	19464780
Potasyum fosfat dibazik susuz	Thermo Fisher	P290
Sodyum klorür	Thermo Fisher	BP358