Yöntem bitki özleri, ince katman kromatografisi (TLC) ile ayırma antibakteriyel metabolitlerin tespit etmek için iletişim bioautography açıklanmaktadır. Yöntem sığır işkembe için yerel aşırı amonyak üreten bakteri (HAB) inhibe kırmızı yonca fenolik bileşiklerin taranması uygulanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnce tabaka kromatografi (TLC) Ayırımı ve bitki özleri Biyodenemeler Antimikrobiyal Bileşikler tanımak
Bu makalede
Özet
Özet
Bitki antimikrobiyal bileşikler için ortak bir elek (örneğin, bakteri veya mantarların suyu içinde veya agar), mikroplar için zaman büyümeye izin veren mikrobiyal süspansiyonlar için kromatogramlar maruz bırakılması, kağıt ya da ince-tabaka kromatografisi (PC veya TLC) ile ayırma bitki özleri oluşmaktadır nemli bir ortam, ve mikrobik büyüme bölgeleri görselleştirme. Bioautography olarak bilinen bu tarama yönteminin, etkinliği, kromatografik ayırma kalitesi ve mikrobiyal kültür koşulları ile alınan bakım hem de bağlıdır. Bu kağıt asit fermente bakterileri amino yeni bir uygulama ile TLC ve temas bioautography için standart protokoller açıklanmaktadır. Ekstre esnek (alüminyum destekli), silika TLC plakaları üzerinde ayrılmış ve bantlar ultraviyole (UV) ışık altında görselleştirilebilir. Bölgeleri Test mikroorganizma ile aşılanmış agar üzerine kesilmiş ve yüzü aşağı inkübe edilir. İnhibitör grupları agar plaka lekeleme ile görselleştirildis ile tetrazolyum kırmızı. Yöntem, kırmızı yonca ayrılmasından (Trifolium pratense ev. Kenland) fenolik bileşikler ve Clostridium sticklandii, sığır işkembe özgüdür bir hiper amonyak üreten bir bakterinin (HAB) karşı aktivite için, bunların yapılan tarama uygulanır. TLC yöntemleri (aerobik veya anaerobik), hem de mantar bitki özleri ve diğer bakteri türleri arasında, çok çeşitli kültür koşulları için geçerlidir türün büyüme gereklerine uyacak şekilde tadil edilmiş halinde, test organizmalarının olarak kullanılabilir.
Giriş
Bitkilerde antimikrobiyal bileşikler için tahlil, bir bitki ekstraktı bileşenlerinin ayrılması ve bu bileşenlerin, bir test mikroorganizmanın maruz bırakılması, ve mikroorganizmaların büyüme bileşiklerin herhangi biri ile inhibe olup olmadığının belirlenmesini gerektirir. Birçok bileşik düzlemsel bir yüzeye ayrılabilir, çünkü kağıt veya ince tabakalı kromatografi (PC veya TLC) ile Separations uygundur. Ayırma bazı bileşikler, adsorban (PC durumunda selüloz, ve TLC durumunda adsorbanların çeşitli) sıkıca bağlanması ve diğerlerine 1 daha az geçirme ile, polarite dayanmaktadır. Şekil 1, göreli pozisyonlarının bir örnek teşkil silis TLC plakas....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Bitki Özü hazırlanması
- Pratense cv fenolik bileşiklerin çıkarılması için Kağan ve Flythe 10 Bkz. Kenland.
- Diğer bitkilerde diğer bileşikler ayıklamak için, (pek tarif edilir) bitki veya metaboliti özel ekstraksiyon yöntemleri için fitokimyasal analizi literatürü kontrol veya geniş birçok bileşikleri izole böyle Khurram ve ark. 7,8 olanlar gibi protokoller için bakmak kutuplulukların aralığı.
2. İnce tabaka levhası hazırlanması
- Uzak gelişim bölgesinden adsorbe kirletici maddelerin hareket ettirmek amacıyla, bir veya daha fazla polar nötr çözücü maddeler içind....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kırmızı yonca (Trifolium pratense ev. Kenland) ekstreler fenolik bileşikleri ihtiva eden, temsili silis TLC ayrımı, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Etil asetat-heksan içinde kırmızı yonca özütünün ayrılması (9:1, v / v), 8.5 cm den fazla, beş bantları, tam olarak kökenli çözülmüş bir (Şekil 2A) ile sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, Şekil 2B, kırmızı yonca özütü (aynı çeşidinden, ancak aynı çiftlikte ayrı bir arsa yetiştirilen) farklı bir numune daha büyük bir m.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol bileşikler alt-grup halinde bir özü ayrılması ve kontakt bioautography ile bu alt kümeleri test etmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Yöntem, belsoğukluğu neden olan bakteriler için inhibitör bitki metabolitleri için ekrana Chomnawang ve ark. 15 tarafından kullanılan birine oldukça benzer. Antimikrobiyal bitkisel bileşikler için ekrana kullanılan bioautography tipi testi mikroorganizma, laboratuar kurulumu ve biyodeney gerçekleştiren kişi (ler) tercihlerine dahil olmak üzere birço.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Makalede ticari isimleri veya ticari ürünlerinin anılmasının özel bilgi sağlama amacıyla sadece ve USDA tarafından tavsiye veya onaylandığı anlamına gelmez. Yazarlar herhangi bir mali çıkarı beyan.
Teşekkürler
Biz bize bu çalışma için onun kırmızı yonca parsellerden örnekleri kullanmak için izin için, merhum Dr Norm Taylor, Bölümü Bitki ve Kentucky Üniversitesi Toprak Bilimi teşekkür ederim. Bu proje Tarım Amerika Birleşik Devletleri Bakanlığı tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Silika F254 TLC plakalar, alüminyum destekli, 0,2 mm kalınlık, 20 cm x 20 cm | EMD Kimyasalları | 5554/7 | Bu plakalar, 254 nm'de floresan bir indikatör içeren silika ile kaplanmıştır. Bu dalga boyunda emilen bileşikler, floresan yeşil bir arka plan üzerinde koyu görünür. Alternatif kaynaklar arasında Analtech, Selecto Scientific, Fluka bulunmaktadır. Silika dışındaki adsorbanlara ihtiyaç duyulabilir. Kullanılacak solventlere bağlı olarak plastik destekli plakalar uygun olabilir. |
| Keskin, ağır hizmet tipi makaslar | Fiskars 175800-1002'ye benzer | herhangi bir dikiş tedarik şirketi | TLC plakalarını kesmek için. Keskin bıçaklı bir kağıt kesici de kullanılabilir. Silika tozunu solumayın. |
| 100 ° C'de kurutma fırını; C (mekanik konveksiyon) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC odası | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternatif kaynaklar: Atalay. Küçük tabaklar için (yani 5 cm x 10 cm) Pyrex beherleri veya konserve kavanozları kullanılabilir. Alüminyum folyo ile örtün (kavanoz kapakları solvent buharları ile ekstrakte edilebilen malzeme içerebilir). |
| 50 ve mikro; l Düz iğne uçlu şırınga | Hamilton | 80965 | 5-10 &mikro;l. aşan standart veya numune yükleme miktarları için Alternatif kaynaklar eşdeğerdir. |
| Mikropipetler | Drummond | 2-000-001 | Az miktarda standart veya numune yüklemek için. Alternatif kaynaklar: VWR. Ayrıca, Pasteur pipetleri bir bütan meşale ile daha ince bir çapa kadar gerilebilir. |
| Filtre kağıdı (#1 sınıf) | Whatman | 1001 917 | Oda fitili görevi görür. Diğer filtre kağıdı sınıfları uygundur. Bu boyut, 20 cm x 20 cm'lik plakaların bulunduğu odacıklar için kesilebilir. |
| Beher maşası | Fisher Scientific | 15-186 | Plakaları büyük bir TLC haznesinin içine ve dışına koymak için. Alternatif kaynaklar: VWR |
| Düz kenarlı forseps | Fisher Scientific | 10-275 | Plakaları küçük bir haznenin içine ve dışına koymak için. Alternatif kaynaklar: VWR |
| ve uzun dalga UV ışık aydınlatması için 4 W veya 6 W ampullü küçük taşınabilir UV lambası (sırasıyla 254 ve 365 nm) | Ultraviyole Ürünler | 95-0271-01 | Alternatif kaynaklar: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| El tipi UV lambası ile kullanım için görüntüleme kabini | Ultraviyole Ürünler | Chromato-Vue C-10E | UV aktif bantlar, plakalar buraya yerleştirilebilirse daha kolay daire içine alınır. Alternatif kaynaklar: Spectronics Corporation. |
| Tepe UV lambalı ve görünür lambalı fotodokümantasyon sistemi | Kodak | Gel Logic 200 | Alternatif kaynaklar: Ultraviyole Ürünler (www.uvp.com). Ev yapımı alternatif için protokole bakın. |
| Anaerobik Oda, Tip A, Vinil Coy | 7150000 | Bu oda, tarif edildiği gibi Clostridium sticklandii gibi anaerobik bakteriler için uygundur. Bununla birlikte, büyüme koşulları, tahlilde kullanılan organizmaya göre uyarlanmalıdır. Patojen organizmalar kullanılıyorsa biyogüvenlik kabini ve diğer önlemler alınmalıdır. Alternatif kaynaklar: Anaerob Systems, BioRad, Plas Labs, diğerleri | |
| Tetrazolium kırmızı | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternatif kaynaklar: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| HAB media için malzemeler | |||
| >Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | Bunun için ve bu tablodaki diğer tüm reaktifler için alternatif kaynaklar eşdeğerdir. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Tiamin HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nikotinamid | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Kalsiyum D-Pantotenat | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Lipoik Asit | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoik asit | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folik asit | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Kobalamin | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Piridoksal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Piridoksin | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Demir sülfat ve orta nokta; 7H < alt > 2 < / alt >O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Çinko sülfat ve orta nokta; 7H < alt > 2 < / alt >O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganez klorür ve orta nokta; 4H2< / sub>O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Borik asit | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Kobalt klorür ve orta nokta; 6H < alt > 2 < / sub>O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Bakır klorür ve orta nokta; 2H < alt > 2 < / sub>O | Sigma-Aldrich | ||
| Nikel klorür ve orta nokta; 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Sodyum molibdat ve orta nokta; 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Triptikaz (Kazeinin pankreas sindirimi) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Potasyum fosfat monobazik susuz | Thermo Fisher | P284 | |
| Sodyum karbonat ve orta nokta; H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnezyum sülfat ve orta nokta; 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Kalsiyum klorür ve orta nokta; 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Sistein HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Potasyum fosfat dibazik susuz | Thermo Fisher | P290 | |
| Sodyum klorür | Thermo Fisher | BP358 |
Kaynaklar
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
