Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım Drosophila Dokular

Jingqun Ma; Vikki Marie Weake

doi:10.3791/51418

Yöntem makalesi

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım Drosophila Dokular

DOI:

10.3791/51418

⸱

25 Mart 2014

Jingqun Ma¹ , Vikki Marie Weake¹

¹Department of Biochemistry, Purdue University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila dokusu sık sık hücre tipleri heterojen bir karışım içerir. Belirli bir doku, spesifik hücre tiplerinde gen ekspresyonunu incelemek için, çekirdekler, genetik olarak etiketlendi ve daha sonra bir afinite dayalı bir yaklaşım kullanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdek bu gen ekspresyon analizi ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster embriyonik ve larva dokular genellikle bu dokularda gen ekspresyon analizi karmaşık hücre türleri arasında yüksek ölçüde heterojen bir karışımı içerir. Bu nedenle, Drosophila dokulardan hücreye spesifik gen ekspresyon profillerini analiz etmek için, yüksek saflıkta ve bu transkripsiyon profil ve kromatin immüno olarak alt uygulamalar için yeterli bir verimde özel hücre tiplerini izole etmek için gerekli olabilir. Bununla birlikte, bu dokularda spesifik hücre tipleri nadir nüfusu ile birleştiğinde örneğin merkezi sinir sistemi gibi dokularda düzensiz hücre morfolojisi, ayırma lazer mikro-kesim ve floresans ile aktive edilmiş hücre gibi hücre izolasyonu için geleneksel yöntemlerle (FACS) zorluklar oluşturabilir . Burada, etiketlenmiş çekirdeklerin afinite bazlı izolasyon yerine, tüm hücreleri kullanılarak hücre spesifik gen ekspresyon profillerini karakterize için alternatif bir yaklaşım tarif edilmektedir. Belirli c çekirdeklerilgi ell tür genetik olarak Gal4/UAS ikili sentezleme sistemi kullanılarak bir çekirdek zarı-lokalize EGFP etiket ile etiketlenir. Bu EGFP-etiketli çekirdekleri manyetik boncuklara bağlanmış olan GFP karşı antikorlar kullanılarak izole edilebilir. Bu protokol açıklanan yaklaşım, bu hücre tipleri, toplam hücre popülasyonunun en az% 2 edilmiş olsa dahi, yüksek saflıkta Drosophila larva, merkezi sinir sisteminde ve ekspresyon analizi için yeterli seviyelerde özel hücre tiplerinden çekirdeklerinin tutarlı izolasyonu sağlar doku. Bu yaklaşım, Drosophila embriyonik ve belirli Gal4 sürücüleri kullanarak larva hücre tipleri çok çeşitli çekirdek izole etmek için kullanılabilir, ve FACS veya lazer mikro-kesim için uygun değildir hücre tiplerinden olan çekirdek izole edilmesi için faydalı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gibi, merkezi sinir sistemi gibi dokularda Drosophila hücre tipleri karmaşık bir karışımını içerir. Bu nedenle, Drosophila dokulardan hücreye spesifik gen ekspresyon profillerini analiz etmek için, bu alt uygulamaları sağlamak için yeterli miktarlarda spesifik hücrelere homojen bir popülasyonu izole etmek için ilk olarak gereklidir. Dokulara hücreleri izole etmek için yöntemler lazer mikrodiseksiyon ve bütün hücre sınıflandırması (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre içerir. FACS ^1-3 gen ekspresyonu ve kromatin için Drosophila embriyolardan ve Caenorhabditis elegans hücreler ve çekirdekler izole etmek için kullanılmış ols....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. EGFP üretimi ve karakterizasyonu :: KASH Drosophila

Çapraz Gal4 sürücü Msp-300 ^KASH uçar UAS-EGFP'nin :: uçar. Alternatif olarak, sürücü ve Gal4 UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH transgeni taşıyan yeniden birleştirici hem de sinekler standart genetik teknikleri kullanılarak oluşturulabilir. Döl sayıda gerekmektedir, bu ikinci bir yaklaşım, avantajlıdır.
Standart mikroskopi teknikleri kullanarak EGFP :: KASH işaretleyicinin ekspresyonunu karakterize eder. Not: EGFP ekspresyonu ya da bütün larvaları, kesilmiş, sabitlenmiş Drosophila dokularda standart mikroskopi tekn....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Repo-GAL4 sürücü (Bloomington stok no 7415) özel olarak bir gelişme ¹⁸ çeşitli aşamalarında Drosophila sinir sistemindeki glial hücrelerde ifade edilir. Sinekler stabil standart genetik teknikler kullanılarak repo-GAL4 sürücünün kontrolü altında UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH ifade eden üretildi. EGFP ifade deseni :: KASH transgen Bu sinekler karakterize etmek için, üçüncü instar larvaları arasındaki kesilerek optik lob ve göz hayali disk GFP ekspresyon paterni konfoka.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Drosophila embriyonik ya da larva dokularda karma hücre popülasyonlarından, özellikle etiketli ya da yüksek ölçüde çekirdek izole zenginleştirmek için kullanılabilir. Bu protokolü kullanarak, çekirdekler, yaklaşık 1 saat içinde kesilmiş dokularından izole edilebilir. İzole edilmiş çekirdeklerin saflığı ve verimi deneysel her hücre tipi için belirlenmelidir. Çünkü numunede mevcut boncukların hemasitometre kullanarak protokol sonrası izolasyon aşamasında boncuk-bağlı çekirdek ölçmek için zor olabilir.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH plazmid sağlamak için Janice Fischer teşekkür ederim. MAB24B10 antikor NICHD himayesinde geliştirilen Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü tarafından muhafaza edilmiştir. Repo-GAL4 stok (BL7415) Indiana Üniversitesi Bloomington Stok Merkezinden elde edilmiştir. Kanser Araştırma Purdue University Center Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu (IRG # 58-006-53) den destek minnettarlıkla olduğunu. Jingqun Ma Purdue Üniversitesi'nde Gıda ve Tarım Purdue ASİSTANLIĞA bir Tarımsal Araştırma tarafından desteklenmektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-chaoptin antikoru (fare, monoklonal)	Gelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antikoru (fare, monoklonal)	Roche	11814460001	Bu spesifik antikor bu protokol için önerilir. Bununla birlikte, alternatif antikorlar da kullanılabilir.
MidSci	BEQPCR-R		ile 2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix
(4 ',6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür tuzu)	Biotium	40011
Dounce Homojenizatör (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Cımbız, 11 cm
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10003D	Bu protokol için bu özel manyetik boncuk markası önerilir.
EpiScript Ters Transkriptaz	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon hücre süzgeçleri, 40 μ m gözenek boyutu	VWR	21008-949	Hedef hücre çekirdeğinin boyutuna bağlı olarak alternatif gözenek boyutları kullanılabilir.
Manyetik stand (8 x 1.5 ml tüpler)	Kırlangıç	LSKMAGS08
Mini tüp döndürücü	Genemate	H-6700
Qubit başlangıç kiti	Yaşam Teknolojileri	Q32871	RNA verimini ölçmek için benzer floresan tabanlı yöntemler kullanılabilir. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
>RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	RNA'ları inaktive etmek için bu reaktifin kullanılması isteğe bağlıdır.
RT-PCR makinesi Termal Döngüleyici	BioRad	CFX Connect Termal Döngüleyici
Silikonize 9 oyuklu cam plaka	Hampton Research	HR3-134
Stereomikroskop Floresan Adaptörü (Kraliyet Mavisi (440-460 nm) uyarma + sarı bariyer	Gece Denizi		Bu adaptör, GFP floresansının tipik bir diseksiyon mikroskobu (örneğin Nikon)
kullanılarak incelenmesini sağlarStereoZoom Mikroskop 83604 10X Geniş Alan Göz Mercekleri ve Evrensel Bom Standı ile Set	Nikon	SMZ 745
Termal Döngüleyici	BioRad	T100
Trizol reaktifi	Yaşam Teknolojileri	15596018	DİKKAT; Alternatif RNA ekstraksiyon yöntemleri kullanılabilir. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L

ROX DAPI İmmünopresipitasyon için World Precision Instruments 14095

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
Bonn, S., et al. Cell type-specific chro....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gal4 UAS Sistemi EGFP etiketli ekirdekler Manyetik Boncukla zolasyon H creye zg Profilleme Merkezi Sinir Sistemi Transkripsiyonel Profilleme

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım Drosophila Dokular

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler