ScanLag, büyümedeki gecikmeyi, yani gecikme süresini ve paralel olarak binlerce hücre için kolonilerin büyüme hızını ölçmek için yüksek verimli bir yöntemdir. ScanLag kullanarak tarama, tek bir varyant düzeyinde uzun gecikme süresi ile yavaş büyüme arasında ayrım yapılmasını sağlar.
Yöntem makalesi
ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag
Bu makalede
Özet
Özet
Büyüme dinamikleri mikroorganizmaların temel özellikleridir. Büyümenin kesin olarak ölçülmesi mikrobiyolojide önemli bir hedeftir. Büyüme dinamikleri, hem mikroorganizmanın iki katına çıkma süresinden hem de bir durumdan diğerine geçerken büyümedeki herhangi bir gecikmeden, gecikmeden etkilenir. ScanLag yöntemi, bu iki bağımsız özelliğin, her biri tek bir hücreden kaynaklanan koloniler düzeyinde karakterizasyonunu sağlayarak, gecikme süresinin ve büyüme süresinin iki boyutlu bir dağılımını oluşturur. ScanLag'de, geleneksel besleyici agar plakalarındaki kolonilerin tespit edilmesi için geçen sürenin ölçümü, kurum içi bir uygulama tarafından kontrol edilen bir dizi ticari tarayıcıda otomatikleştirilir. Petri kapları tarayıcılara yerleştirilir ve uygulama periyodik olarak görüntüler alır. Koloni büyümesinin otomatik analizi daha sonra her bir koloninin ortaya çıkma süresini ve büyüme hızını döndüren bir uygulama tarafından yapılır. Koloninin şekli, dokusu ve rengi gibi diğer parametreler, hücre alt popülasyonlarının çok boyutlu haritalanması için çıkarılabilir. Son olarak, yöntem, daha fazla karakterizasyon için spesifik büyüme fenotiplerine sahip nadir varyantların elde edilmesini sağlar. Teknik, bakteriyolojide antibiyotiklerin kalıcılığına neden olabilecek uzun gecikmenin tanımlanması için ve ayrıca fenotipik ekranlar için genel bir düşük maliyetli teknik olarak uygulanabilir.
Giriş
Bakteriler çok stresli koşullara yanıt gelişmiştir. Strese adaptasyon genel özelliği, büyüme dinamikleri 1,2 bir değişimdir. Üstel büyüme oranı ve gecikme süresi, yeni koşullara uyum için gerekli yani zamanı: Büyüme dinamikleri iki parametre çoğunlukla karakterizedir. Yüksek verimli yöntemler, çok sayıda büyüme oranı ölçümleri odak ise yeni koşullara uyum karakterizasyonu için önemli bir parametre olan, ancak, gecikme süresi, çoğu zaman bir gözden parametredir. Değişen koşullara uyum Kantitasyonu geleneksel zahmetli manuel yöntemler 3,4 kullanılarak yapılmıştır. Daha yakın zamanda, gelişmiş teknikler tek hücre 5,6 analizi için geliştirilmiştir. Ancak, büyümenin gecikmesi yavaş büyüme (yani bir gecikme süresi) 2,3 aşağıdaki normal büyüme ayırt etmek hala zor. Otomatik bir yöntem, ScanLag 7 inşa edildiBu iki benzer fenotip arasında ayrım.
Gecikme süresi dağılımının çalışmanın önemini çarpıcı bir örnek antibiyotik tedavisi altında ortaya çıkar. Antibiyotik ve diğer gerilmeler çoğu sadece aktif olarak büyüyen hücrelerini öldürmek ve bu nedenle, "geri kalmış" edilmiş hücreler 8 korunur. Gecikme süresini izlemek için, bir mikroskop altında tek hücreleri gözlemlemek ve ilk bölümü için zaman izleyebilirsiniz. Bu yöntemin bir dezavantajı, büyük bir dinamik zaman aralığı sınırlı olduğunu; Erken büyüyen bu hücreler daha uzun etkili bir gecikme süresi ile hücrelerin büyümesini azaltarak, üstel bir oranda yüzeyini kapsamaktadır. Akış odaları kullanımı biraz bu 5 circumvents, ancak hücrelerin sınırlı sayıda izlenebilir ve nüfusun çoğunluğu artan başladıktan sonra lag faz çıkmak bakterilerin fraksiyonu gözlenen olamaz. Bu kısıtlamalara rağmen, çeşitli çalışmalar di düzeyinin etkisi değerlendirilmiştirfferent tek hücre mikroskopi 9-12 kullanılarak gecikme süresi dağılımına vurguluyor. Gecikme süresi dağılımını izlemek için başka bir yolu bulanıklık ölçümleri 13,14 geçer. Her biri tek bir hücreden ait birçok paralel kültürler, zamanla kültüründe bakteri sayısını ölçen bir optik yoğunluk okuyucu yetiştirilmektedir. Bu yöntem, ekstrapolasyon hassasiyeti ile bir plaka içinde kuyu sayısı ile sınırlıdır.
Otomatik bir yöntem bile çok uzun bir gecikme süresine sahip bir popülasyonda bakterilerin küçük bir yüzdesi için, değerlendirilecek gecikme süresi ve büyüme süresi dağılımı sağlayan, ScanLag adlandırılan geliştirilmiştir. Yöntem, geleneksel besleyici agar plakaları 15 (Şekil 1) kolonilerin tespiti dayanmaktadır. Algılamasını 16,17 periyodik plakaların görüntüleri elde etmek için ev yazılım tarafından yönlendirilir ticari tarayıcılar 18 bir dizi otomatikleştirmek için tasarlanmış oldu. Yazılım olduotomatik olarak görüntüleri analiz ve bu süre 80 piksel 20 piksel büyümeye olarak burada tanımlanan her koloninin, her koloni ve büyüme zamanı görünüm zamanı olarak kantitatif parametreleri 19,20, çıkarmak için tasarlanmıştır. Burada sistemin kurulum ve daha iyi bir kullanıcı arayüzü ile geliştirilmiş otomatik bir görüntü analiz yazılımı kullanımı da dahil olmak üzere, detaylı bir yöntem sunuyoruz.
Bu yöntem, bu tür morfolojisi ve rengi gibi koloni diğer özelliklerini ölçmek için adapte edilebilir. Bu tür parametrelerin ölçülmesi boyutlu phenomics olarak sistem kullanılmasını sağlayacaktır. Yöntem, tek hücrelerden koloniler tespit gibi, sistem nüfus düzeyinde ölçümleriyle ölçülemez yeni fenotipi ortaya çıkarabilir. Bu teknik az varyantlarının saptanması ve alınmasını sağlayan ve istenen özellikleri için tarama kolaylaştırır.
Protokol
1.. Setup oluşturun
- Optik çözünürlüğe sahip bir masaüstü Tarayıcı seç: 4.800 dpi; Donanım çözünürlüğü: 4.800 x 9.600 dpi; renk bit derinliği: 48 bit, ilgili sıcaklık ve nem seviyelerinde çalışabilir.
- Petri kapları genellikle ticari tarayıcılarında kullanılan kağıt aksine, önemli bir hacmi var. Koloniler, yaklaşık 5 mm tarayıcı yüzeyi üzerinde, agar tabakasının üstünde yer alır. Not: Çoğu tarayıcılar için koloniler odak noktası olacaktır.
- Bazı tarayıcı şirketler aynı bilgisayara aynı türden tarayıcı birden fazla örneğinin bağlantısına izin vermez. Birden fazla tarayıcı bağlı ve benzersiz tespit edilebilir emin olun.
- Aşağıda ayrıntılı olarak aksesuarları hazırlayın:
- Steril siyah hazırlayın adet plakaları kapsayacak bez (Şekil 1 adım 2) hissettim.
- Yerinde Petri yemekleri tutmak için, tarayıcılar uygun beyaz plaka sahipleri (Gereç ve Yöntem) hazırlamak ve 6 hol vares yemekleri boyutu (Şekil 1 adım 3).
- Mikroorganizmanın büyümesi için gerekli ise, sıcaklık kontrollü bir ortamda tarayıcılar koydu. Bilgisayara tarayıcılar bağlayın.
- İsteğe bağlı: bilgisayara rölesini bağlayın ve sıcaklık gradyanı aşmak için tarayıcının açık / kapalı anahtarını atlamasına.
NOT: röle ünitesi son derece ısıya duyarlı mikroorganizmaların içindir. Elektronik dengesiz yüzey ısıtmak yok böylece tarayıcıyı kapatır. Tarayıcı yüzeyinin sadece bir kısmını kullanarak, benzer sonuçlar elde edilebilir.
2.. Tarama Yöneticisi yükleyin
- Http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html bir belirlenen dizine tüm 'Tarama Yöneticisi' uygulama dosyalarını kopyalayın.
- Onlar Bilgisayar Yönetimi-> Aygıt Yöneticisi-> Görüntüleme Cihazları (göründükleri gibi tarayıcılar isimlerine göre ScanningManager.exe.config dosyayı yapılandırın Şekil 2).
- 'Tarama Yöneticisi' uygulamasının sorun giderme için, beni oku dosyasını bakın.
- 'Tarama Yöneticisi' uygulaması başka evrakların, Documentation.html bakın.
3.. Deneme gerçekleştirin
- Petri kapları (Şekil 1) hazırlanması:
- Yaklaşık 2.000 CFU / ml kültür seyreltin. Muntazam plaka yüzeyi üzerinde kültürünün 0.1 ml Plate.
- Sömürgeler ve çanak arasında iyi bir kontrast elde etmek ve nemi absorbe, steril siyah bir parça ile kapak plakası bez hissettim. Plaka üzerinde kapak koymak.
- Tarayıcılar üzerinde tutuculara tabak yerleştirin.
- Ekli tarayıcılar listesinden katılan tarayıcılar seçin: Tarama Yöneticisi (Şekil 3) başlatın. (Tekrarlari) alınacak resim sayısını, sonraki görüntüleri arasındaki zaman aralığını (Time boşluk), ve t başlamadan önce gecikme süresini seçino (sonra başlat) deneme.
Görüntüler 4. Analizi
NOT: hesaplama yöntemleri bir taslak http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications de ticari olmayan kullanım için serbestçe kullanılabilir "ScanLag" kullanılarak MATLAB görüntüleri analiz sağlanır. html. Mevcut Diğer fonksiyonlar yazılım kılavuzunda ayrıntılı olarak, ve bir örnek kod güçleniyor.
- Ayrı klasörlere her tarayıcıdaki görüntüleri sıralamak.
- Matlab'ın Komut penceresini kullanarak, aşağıdaki işlemleri çalıştırın. Bu işlemleri çalıştırmak için gereken parametreler yazılım kılavuzuna tanımlanır.
- Ön işleme gerçekleştirmek için PreparePictures çalıştırın: önişleme olarak, bir tarayıcıdan görüntüleri hizalanır. Her Petri görüntülerin her dizisinden kırpılır. Her resim toplandı hangi zaman damgası alınır.
- E'de algılama ve izleme gerçekleştirmek için çalıştırın TLAllPlatesach Petri ayrı ayrı koloniler tespit ve tanımlama numarası tahsis edilir.
- Ekstre verilerin analizi: Her tespit kolonisinin boyutları, zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür. Kolonilerin görünümü dağılımını ayıklamak için Matlab'ın komut penceresinde aşağıdaki fonksiyonları (daha fazla bilgi yazılım kılavuzunda mevcuttur) kullanın:
- Zaman (Şekil 4) karşı boyutu kolonilerin grafiği ile birlikte belli bir Petri kabı analizini görüntülemek için ScanLagApp çalıştırın.
- Plaka şimdiki zaman değiştirmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Zamanlama da koloniler alan grafik üzerinde eşleşen bir dikey çizgi ile gösterilir.
- Ilişkili eğrisini görmek için kolonisi üzerinde tıklayın, ve tersi, ilişkili koloni bulmak için bir eğri üzerine tıklayın. Koloniyi belirledikten sonra, fenotip tespit Petri kabı koloni seçerek alınabilir.
- Choo tarafından otomatik analizi filtre kusurlarBir koloni şarkı ve dışlamak butonuna tıklayarak. Koloninin sayısını dışlamak tıklayarak sarıya dönecektir.
- Her plaka analiz sonuçlarına geçtikten sonra, sonuçları Özetle:
- Görünüm kez bir histogram oluşturmak için AddHistograms çalıştırın.
- Dağıtımının bir sağkalım eğrisi gösterimi oluşturmak için plotDeathCurve çalıştırın.
- Deneyde tüm kolonilerin görünümü zaman almak için GetAppearanceTimes çalıştırın.
- Zaman (Şekil 4) karşı boyutu kolonilerin grafiği ile birlikte belli bir Petri kabı analizini görüntülemek için ScanLagApp çalıştırın.
Sonuçlar
Gecikme süresi dağılımı ekstre bir örnek olarak, Şekil 5, bir tarama deneyinde yapılabilir gibi, zaman içinde tek bir plaka üzerinde belirli özelliklere sahip her bir koloni tespit etmek ve izlemek için ScanLag yeteneğini göstermektedir.
Mikroorganizmanın kültür heterojen olduğunda, farklı popülasyonlar deneyi sırasında kendilerini ortaya çıkarabilir. Örneğin, Şekil 6, bu görünüm niceliğini gösterir ve dolayısıyla E bir mutant suşu içinde bimodal duraklama süresi dağılımı ortaya koymaktadır coli.
Hücrelerin büyüme hızı koloninin ortaya çıkış zamanı etkilemektedir. Koloniler aynı oranda Olgunlaştıklarında geç ortaya gecikme süresi (Şekil 7) atfedilebilir.
Yöntem, gerçekten tek hücre gecikme süresini ölçen doğrulamak için, tek hücreli bir mikroskopi kullanılarak elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında, ScanLag; Bu doğrulama azalan birönceki bir yayında 7 ayrıntılı ribed. Bu yöntem mikroskobu ile değerlendirilebilir çok daha fazla hücre izlenmesini sağlar. Mikroskopi kullanılarak ve ScanLag kullanılarak elde edilen dağılımlar, büyük ölçüde üst üste gelir. ScanLag dağılımı biraz daha geniştir; teorik analizler bölünme zaman, standart sapmanın düzenin olduğu tahmin genişletmektedir. Büyüme süresi, her bir suş için farklı ise, görünüşte gecikmenin kökeni ayrıca diğer yöntemler kullanılarak incelenmelidir.
Daha sonra kolonilerin görünüşüne erken görünen kolonilerin etkisi incelenmiştir. Kontrol deneyleri 7 daha sonra görünüm olarak uzun plaka başına kolonilerin sayısı (Şekil 8) 200'ü aşmadı olarak etkilenmez olmadığını doğruladı. Başka bir kontrol deneyi plaka üzerinde koloninin yeri görünümü zaman 7 etkileyen olmadığını doğruladı.
P analizilates büyüme ortamı veya mikroorganizma türü mevcut besin bağlı olarak değişiklik gerekebilir belirli eşikleri kalibre edilir. Şekil 9'da gösterildiği gibi Bununla birlikte, analiz eşik geniş bir ürün yelpazesi için oldukça sağlamdır.
Şekil 1. Kolonisi görünüm dağılımını oluşturmak için gerekli adımların şematik diyagramı.
Şekil 2. Bağlı tarayıcılar, ve yapılandırma dosyasının isimlerini gösteren Aygıt Yöneticisi bir ekran görüntüsü. daha büyük görmek için lütfen buraya tıklayınızBu rakamın sürümü.
Tarama Yöneticisi Şekil 3.. Bir ekran görüntüsü.
Şekil 4. ScanLagApp bir ekran görüntüsü. Plakasının bir görüntü, sol bölmede üzerinde olduğunu ve kılavuzda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi her koloninin büyüme eğrileri, sağ bölmedeki vardır. Iki veya daha fazla koloni birleştirme zaman koloniler alan eğrilerinin bazı ani ortaya çıkar. Kolonilerin birleştirme durumda, bu kolonilerin alan bağlantı bölgesi olarak kabul edilir.
Şekil 5,. Bir plakanın analiz temsili bir sonucu. (A), deney sonunda tespit uygulamanın çıkışı bir görüntü. Her koloni alanı tespit renkli ve benzersiz bir kimlik numarası atanır. Oklar Koloni (yoğunluk bir eşiğe dayalı olarak tespit edilir B'de ölçülen temsil etmektedir koloniler LB agar veya M9 agar üzerine E. coli kolonileri için, bu eşiği 0.03 'tür. Başka bir ortama veya bakteriler, bu eşik işlev ProcessPictures ayarlanabilir .) 10 piksel üzerinde sadece nesneleri (bu eşik işlev MatchColonies değiştirilebilir) sayılır. Bir koloninin Algılama yaklaşık 10 5 bakteri başlar. Bu plakanın dört temsili koloni zamana karşı piksel olarak alanın (B) araziler. Koloni tespit edildiğinde her koloninin 'görünümü zamanı' olduğunu. Zaman sağa sola büyümeye olarak her koloninin 'büyüme zamanı' burada tanımlanmıştır80 piksel (bu sınırların işlevini getAppearanceGrowthByVec kullanarak ayarlanabilir) m 20 piksel. Yazılım üst sınır ulaşmadan önce birleşerek kolonileri dışlar. Kendi özelliklerine göre özel bir koloni tanımlanması belirlenmesi sayısı ve her bir koloni atanan renk sayesinde son derece kolaydır. Örneğin 1. kolonilerinin, 56, 77 ve 124 hem de grafikler vurgulanır.
Şekil 6.. Görünüm miktar modlu gecikme süresi dağılımını ortaya çıkarabilir., Iki farklı suşları için görünüm kez ScanLag analizi histogramlarının Karşılaştırılması. Mavi hat: yabani tip suşu katlanarak (Toplam: 1.320 koloniler) büyüyor; kalmış bakterilerin (: 1.529 koloniler Toplam) ile zenginleştirilmiş kırmızı hat-yüksek kalıcılık mutant. (A) Normalleştirilmiş görünüm histogramları. Pikkatlanarak büyüyen hücre görünümünü bir tespit koloni büyümeye tipik zamandır. Ankastre: Bimodal gecikme süresi dağılımını gösteren log-aralıklı bidonları üzerinde gerçek gecikme süresini almak için üstel kültürünün zirve zamanını düşüldükten sonra mutant suş aynı histogram. (B) logaritmik bir ölçekte, (A) 'da anlatılanla aynı verilerin Survival fonksiyonu. Bu gösterim mutant suşunun geç ortaya kuyruk artırır.
Şekil 7. Görünüm dağıtım ve büyüme süresi dağılımı. (A) ve (B) iki boyutlu görünüm zaman histogramlarını ve iki farklı koşullar (Yazılım üst sınır ulaşmadan birleşti kolonileri hariç) büyüme zaman gösterecek. (C) histogramları karşılaştırılmasıBüyüme kez (D) benzer iken iki suşları görünümü zamanında fark göstermektedir. bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 8,. Erken Kolonilerin görünümü, daha sonra koloni görünümü ile karışmaz. (A), tek başına kaplama, vahşi tip hücre süre dağılımı kalmaktadır. (B) izin veren sıcaklığa transfer edildikten sonra, tek başına soğuk hassas bir soyun süre dağılımı kalmaktadır. (C) ile aynı koşullar altında bir araya kaplama her iki soy süresi dağılımı kalmaktadır. Siyah çizgi ayrı ayrı gerginlik ölçerken elde edilen verilere dayalı beklenen dağılımını gösterir. İyi birbeklenen ve ölçülen dağılımları arasında greement sürece plaka başına kolonilerin toplam sayısı 200, aşağıda olduğu gibi elde edilir.
.. Şekil 9 algılama eşiği koloni görünüm dağıtım şeklini etkilemez koloni görünümü dağılımı iki farklı boyutlarda eşik kullanarak aynı veri kümesi için analiz edilmiştir; (A) eşik büyüklüğü 10 piksel; (B) eşik boyutu 50 piksel. Histogramının başına hücre sayısı: yakl. 1.500. Farklı algılama eşiği sadece algılama zaman bir kayma ile sonuçlanır.
10. Sıcaklık kararlılığı ölçümleri ACR ŞekilGüç Yönetimi olmadan tarayıcı üzerinde yetiştirilen Bacillus subtillis kolonileri ile bir levhanın oss tarayıcının yüzey. (A) görüntü. Yüzey alt sıcak olan ve bu nedenle koloniler daha hızlı büyür. Plakanın yanındaki kademeli hattı ısı derecesinde bir şematik temsilidir. (B) ısı stabilitesi, tarayıcının yüzeyi boyunca yerleştirilmiş iki termokupl ile ölçüldü. Tarayıcı her tarama sırasında ve zamanla ısınır. (C) Güç Yönetimi ile, sıcaklık üniforma ve koloniler benzer oranlarda büyür. (D) Güç Yönetimi modülü ile (B) aynı. ± 0.2 ° C sıcaklık kararlılığı
Şekil 11. Görünüm dağılımındaki farklılıklar di bağlı olabilirKatı ortamın hacimlerde fferences. Aynı bakteri kültürü agar yüzeyinden farklı yükseklikte sonuçlanan LB agar farklı hacimlerde plakaları üzerine kaplanmıştır. Farklı yükseklikleri plakaların farklı donukluk ve bu nedenle farklı bir zamanda algılama yol açtı. Arası plakalar fark kontrol ve farklı yükseklik koşulları arasındaki fark edildi. LB Agar 30 ± 0.5 ml eşit hacimlerde plakaları arasındaki (A) tipik farklar. Farklı yükseklik koşullar arasında (B) Fark: görünüm dağıtımı 30 ± 0.5 ml (yeşil) ve 40 ± 0.5 ml (mavi), 20 ± 0.5 ml (kırmızı) hacimli plakaları için ölçülmüştür. Her koşul, 6 farklı plakalar ortalamasıdır. Sürece levhaların hacmi ± 5 ml aralığı içinde olduğu gibi, benzer bir donukluk ve benzeri bir görünüm süresi dağılımına yol açar.
Tartışma
Doğrudan gözleme dayalı mikroskobik yöntemler genellikle tek hücre davranışlarını incelemek için "altın standart" olarak kabul edilmektedir. Bakteri popülasyonlarında lag kez dağılımının ölçümü sağlar ScanLag, tek hücreli analizinden elde edilen dağılımı ile iyi bir uyum içinde veri sağlayan ve daha yüksek bir istatistik sağlar.
Birkaç kritik adımlar iyi çalışması için bu yöntem için yapılması gerekir: Birincisi, iyi bir görüntü elde etmek için 4,800 x 9,600 olmalıdır tarayıcı çözünürlük, üzerinde uzlaşma yok. İkincisi, güç yönetimi modülü (adım 1.6) olmadan, sıcaklık gradyanı dorse yüzeyinde gelişebilir ve büyümeyi etkileyebileceğini unutmayın. Diğer önemli bir adım yanlışlıkla yazılım tarafından koloni sayılır olabilir toz gibi kusurların filtrasyon. Yazılımın dahili arka plan çıkarma genellikle bu kusurları üstesinden gelir, ama bazen "yanlış" kolonileri varel ile filtrelenebilir.
(A) mikroorganizmaların büyüme hızı sıcaklıktan etkilenir: Ana sorun giderme adımları çeşitli nedenlerden dolayı, kurulum arası plaka değişimi ele alabilir. Farklı sıcaklık ve nem koşulları nedeniyle inkübatör çanak düzensiz havalandırma veya yere oluşabilir. (B) tarayıcının elektronik tarayıcının yüzeyi boyunca bir sıcaklık gradyanı ısınmasına ve neden olabilir. 10 birlikte önce tarayıcı yüzeyi üzerindeki sıcaklık ölçümleri ile, Bacillus bakteriler üzerinde mekansal ısı derecesinde etkisini gösterir ve Şekil güç yönetimi modülü uygulanmasından sonra (1.6 adım). Bu modül yeni tarayıcılar için gerekli olmayabilir, ve tarayıcı yüzeyinin sadece bir bölümü kullanılır ise, güç yönetimi gereksiz olabileceğini unutmayın. (C) agar besin farklı donukluk ile Tabaklar algılama farklı düzeylerde yol açabilir. 11. gösterileri inci Şekilfarklı opasiteler neden besin agar farklı hacimlerde e tolerans.
Deneysel ScanLag tekniği gerçekleştirmek kolaydır ve sadece standart Petri yemekleri mikroorganizmaları plaka ve tarayıcının bir yüzeye koyun gerektirir. Geliştirilen yazılım tüm prosedürü kontrol eder. Görüntü elde etme otomatik olarak yapılır ve koloni izleme için görüntü analizi de otomatik olur. Ayrıca, sistem ölçekli kadar olabilir, aynı zamanda bir çok farklı koşullar ölçmek için. Son olarak, bu yöntem, ticari ofis tarayıcılar dayanır ve bu nedenle, düşük maliyetli.
Bu teknik, E'den farklı mikroorganizmaların çalışma uzatılabilir E. coli K-12, ancak bazı noktalar yapılması gerekir. İlk olarak, daha sonra olanlar erken görünen kolonilerin etkisi önceki bir yayında 7'de ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi, değerlendirilmelidir. E. Coli K-12,plaka başına CFU maksimum yoğunluğu. kolonilerin farklı boyutlarda olan diğer suşlar 200 ve koloniler arasındaki diğer muhtemel çapraz talk, farklı bir yoğunluk gerektirebilir. İkinci olarak, plakaların analiz katı, orta ve koloniler arasındaki kontrast bağlı olarak, modifiye edilmesi gerekebilir özel yazılım tabanlı bir eşik için kalibre edilir. Yazılım lag ve büyüme oranı ötesinde diğer koloni özelliklerini elde etmek için de uzatılabilir. Yazılım kodu açıktır ve koloni şekli, parlaklık, yumuşaklık ve renk elde etmek için modifiye edilebilir.
Ölçümleri tek hücrelerden köken kolonileri üzerinde yapılmış olduğundan, verileri nüfus seviyesi ölçümlerine göre edilemeyen yeni fenotipleri ortaya koymaktadır. Gecikme süresi dağılımının önemi antibiyotiklerin varlığında ortaya çıkar. Birçok antibiyotikler sadece artan hücrelerine karşı etkili olduğu bilinmektedir; Bu nedenle sürece hücreler gecikme aşamasında kalır ve büyümek değil, onlar proBu antibiyotik 21 etkilerinden koruma altında. Kalanlar bakterilerin sayıları antibiyotik tedavisi 15,22,23 sırasında zaman aralıklarında değerlendirildiğinde, persisters adı bakteri alt popülasyonu, çoğu zaman ortaya çıkar. Bazı durumlarda, antibiyotik tedavisine uzun süreli bağışıklık lag kaynaklanmaktadır. Bu kurulumu kullanarak, bu gecikme ortaya ve genellikle önemsiz olmayan bir dağılımı 24 (Şekil 6) vardır. Bu yöntem, aynı zamanda az bulunan mutantların alınmasını sağlar. Örneğin, mutasyona uğramış bir nüfus kaplama sonrası, mutantlan fenotip göre tespit edilebilir ve seçim olmadan, direkt olarak izole edilmiştir. Kurulum da at kolonilerinin yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak kolonilerin büyümesini ölçmek yoluyla hücre-hücre etkileşimleri izleyebilir ve bu çekirdek algılama veya sarılmış bakterilerin yayılması gibi olayları ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak gelecek deneylerle ortaya boyutlu bilgi mikrobiyal nüfusun daha iyi karakterizasyonu yol açacaktırs tıbbi ve çevresel araştırma gelişmeler.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bacillus subtillis'in görüntüleri için Eliq Oster'a teşekkür ederiz. Çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi (# 260871) ve İsrail Bilim Vakfı (# 592/10) tarafından desteklenmektedir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Difco LB et suyu | BD | 240230 | |
| Petri kabı 90 mm | Miniplast | 20090-01 | |
| Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Optik çözünürlüklü Düz Yataklı Tarayıcı: 4.800 dpi, Donanım Çözünürlüğü: 4.800 x 9.600 dpi, renk bit derinliği 48 bit. |
| Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
| Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
| ADU200 USB Röle | ONTRAK | ||
| Steril siyah keçe kumaş parçaları | Özel yapım | Yaklaşık 100 x 100 mm | |
| Beyaz plaka tutucular | Özel yapım | Yüzey boyutu, 6 x 99 mm çapında delikli | |
| Özel yapım Petri kabının boyutunda Delerin halkaları | İç çap: 72 mm Dış çap: 86 mm Üst dış çap: 90 mm |
Kaynaklar
- Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).
- Penfold, W. J. On the Nature of Bacterial Lag. J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).
- Powell, E. O. Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture. J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).
- Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis. Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).
- Hertog, A., et al. Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies. PloS one. 5, (2010).
- Levin-Reisman, I., et al. Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes. Nature Methods. 7, (2010).
- Lewis, K. Persister cells. Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).
- Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics. Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).
- Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).
- Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells. Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).
- Pin, C., Baranyi, J. Single-cell and population lag times as a function of cell age. Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).
- Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations. Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner. Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).
- Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells. Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).
- Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).
- Ernebjerg, M., Kishony, R. Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking. Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).
- Rotem, E., et al. Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).
- Bigger, J. The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes. Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).
- Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiol. 13, 25 (2013).
- Moyed, H. S., Bertrand, K. P. Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis. Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).
- Balaban, N. Q. Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 768-775 (2011).
Yeniden basım ve izinler
