Yöntem makalesi

Yüksek homojenizasyon ve Seri Konsantrasyon konsantre, Lipid-tabanlı Oksijen Mikro Emülsiyonlar imalatı

DOI:

10.3791/51467

⸱

26 Mayıs 2014

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz, yüksek kesmeli homojenizasyon ve seri konsantrasyonu kullanılarak gerçekleştirilen damar içi oksijen verilmesi için tasarlanmış lipid tabanlı oksijen mikro-kabarcıkların (LOMs) büyük hacimlerde imalatı için yöntemler tarif eder.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gaz-doldurulmuş mikro-kabarcıklar ultrason kontrast ve ilaç taşıyıcı maddeler olarak geliştirilmiştir. Mikro-sonikasyon, mekanik ajitasyon, mikroakışkan cihazları ya da homojenizasyon ile yüzey aktif maddelerin işlemden ile üretilebilir. Son zamanlarda, lipid bazlı oksijen mikrokabarcıklar (LOMs) yaşamı tehdit eden hipoksemi tersine, tıbbi acil durumlarda damardan oksijen sağlamak için tasarlanmıştır ve daha sonraki organ yaralanması, kardiyak arrest ve ölüm önlenmesi olmuştur. Bir kapalı döngü yüksek kesmeli homojenizörü kullanılarak yüksek oksijenli mikro-ölçekli üretimi için yöntemler kadar mevcut. Bu süreç, 90 dakika içinde konsantre LOMs 2 L (hacim olarak% 90) üretebilir. Elde edilen kabarcıklar kan hacminin% 60 olduğu için seyreltildiklerinde tutarlı ~ 2 um bir ortalama çapa, ve reolojik bir profiline sahiptir. Bu teknik, bu teknik, çeviri araştırma laboratuarları için yararlı olabileceğini düşündüren, yüksek kapasiteli ve yüksek oksijen saflığı ile LOMs üretir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein, polimer ve lipid kabukları oluşan mikro-ilaç verilmesi için vektörler, gen tedavisi ve ultrason kontrast ajanları olarak 1-5 geliştirilmiştir. Bu terapötik kullanımları damar içi mikro-kabarcık ısrar gerektirir, bu yüzden, mikro-kabarcıklar genellikle bu tür kanda düşük bir çözünürlüğe sahiptir ve kabarcık 3,4 stabilize perflorokarbon 6, atıl, yüksek molekül ağırlıklı gazı ile doldurulur.

Son zamanlarda, lipid bazlı oksijen mikrokabarcıklar (LOMs) uç organ oksijen iletimini korumak ve hava yolu tıkanıklığı veya hipoksemi 7 dönemlerde hemodinamik kararsızlığı önlemek olabilir oksijenin terapötik dozda, sunmak için tasarlanmıştır. Damar içine gaz verilmesi için tasarlanmış emülsiyonlar ultrason kontrast ajanı ya da hedeflenen ilaç sağlama için kullanılanlardan farklı tasarım özellikleri gerektirir. Vücudun oksijen gazı (~ 200 ml / dakika) ile büyük hacimli tüketir, çünkü İlk olarak, LOMs üretilen ve edilmelidirbüyük ölçüde enjekte edilir. Bu, üretim sürecinin etkin olması gerekir. İkinci olarak, imalat işleminin çevre havasına (% 100 oksijen ile doldurulmalıdır) LOMs maruz kalma yoluyla azot kirlenmesini önlemek amacıyla kapalı döngü olmalıdır. LOMs amacı intravenöz gaz dağıtım çünkü Üçüncüsü, LOMs gaz fraksiyonu emülsiyon viskozitesi 7 sınırlamaları kabul, maksimize edilmelidir. Son olarak, herhangi bir damar içine enjekte edilebilen olduğu gibi, tanecik boyutu dağılımı üzerinde kesin kontrol mikrovasküler tıkanıklığı 8 kaçınmak için gereklidir.

Mikro-kabarcık üretimi için birkaç kurulan yöntem vardır. Sonikasyon yüksek yoğunluk kullanır, düşük frekanslı ultrason 7,9 mikro-kabarcıkları üretmek için gaz kafa mevcudiyetinde böyle bir amfipatik fosfolipid gibi bir yüzey aktif madde, emülsiyon içeren bir hava-sıvı arayüzü uygulanır. Bu işlem son derece değiştirilerek kontrol edilebilirsonikasyon nadiren klinik olarak kullanılan mikro-kabarcıkların imalatında kullanılan da ses frekans, güç ve darbe süresi ve elde edilen boyutu dağılımı, özel bir boyut dağılımının mikro-kabarcıkları üretmek için uygun olabilir. Amalgamation geniş hacimli 2 barındıracak kadar büyütmek de zor olan kapalı bir sistem, bir yüzey aktif madde ve gazın yoğun bir mekanik ajitasyon olduğunu. Damlacık tabanlı ve arayüz mikro-kabarcık boyut dağılımı 10-13 arasında hassas bir kontrol sağlar. Geleneksel olarak zor büyütmek rağmen, çok kanallı, yüksek hızlı Mikroakiskan mikro üretim verimliliğini 13 artış hangi tarif edilmiştir. Bu yöntemlerden herhangi birini kullanarak imal Mikrobaloncuklar gibi merkezkaç fraksiyonasyonu 14,15 ve mikro yüzdürme 16,17 gibi post-üretim boyutu azaltma süreçleri gerektirebilir.

Son derece kararlı mikro-kabarcıkların üretimi için bir başka yöntem, kesme kurulmuş olan homogenizmikro-kabarcık yüzeyinde 18 üzerinde stabilize edici bir altıgen fosfolipid desende olmasına yol açabilir ation 6,. Bu kavram üzerine bina, öz-montaj LOMs 19 oluşturmak için bir in-line yüksek kesme homojenleştirici birleşmesini açıklamak. Bu süreçte, homojenleştirici hızlı mikro-kabarcıkların oluşturulması için yüksek mekanik ve hidrolik kesme oluşturma, çift ince gözenekli emulsor ekranlara yakın bıçaklar döner kullanmaktadır. Bu sistem sayesinde lipid emülsiyonun seri konsantrasyonu daha da santrifüjleme ile konsantre edilebilir giderek daha konsantre hale gaz fraksiyonu, elde edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Sistem Set-up

Sistem, tek bir kademeli karıştırıcı, bir in-line yüksek kesme homojenizatör, HCT ve homojenleştirici arasında sıvının hareket ettirilmesi için bir silindir pompa ve bir ısı-eşanjörü (Şekil 1) ile donatılmış, bir tutma tankı ve konsantre (HCT) oluşur.

  1. Tek kademeli mikseri altında 2 temel limanlarından ve 3 yan portları ile donatılmış bir steril, geniş ağızlı 4 L cam toplama kabı yerleştirin. Kabın ağzına karıştırıcı kafa indirin ve (kafa alanını karışmasını ortam havasının önlemek için), kauçuk contalar veya bant kullanılarak çok gaz geçirmez bir montaj sağlar.
  2. Steril 3/8 ile HCT (Şekil 1, bağlantı noktası # 1) temel limanlarından birini Fit "(ID) açık boru, yaklaşık 10" uzun, konsantre emülsiyon toplanması için ucunda 3-yollu ile donatılmış .
  3. İkinci baz noktasını steril 3/8 ile (Şekil 1, bağlantı noktası # 2) "(ID) boru, approximatel Fity uzunluğunda 36 ". Bir silindir pompa ile bu boru besleyin. İki girişi olan bir T-parçası ile yüksek kesme homojenleştirici girişini Fit ve aşağıdaki gibi bağlayın: roller pompa aracılığıyla, port # 2 boru bağlamak ve T-parçasının yan portuna bağlayın. Düşük akımlı oksijen gaz debimetre ile bir oksijen tankına diğer liman takın.
  4. 4 ° C'de muhafaza edilen bir in-line ısı değiştiricinin giriş portuna yüksek kesme homojenleştirici çıkış portunu Kapalı bir döngü sistemi oluşturmak, HCT dönüş bağlantı noktası (Şekil 1, bağlantı noktası # 3), ısı değiştiricinin çıkış portunu.
  5. HCT (a debimetre ile) bir oksijen tankı takın (Şekil 1, port # 4). HCT üst noktasına (Şekil 1, port # 5) atmosfere açık olan bir gaz bileşimi monitör takın.
  6. Kısırlık isteniyorsa, otoklav her kullanımdan önce, cam ve metal parçaları sterilize edin. Tüp bileşenleri ve plastik co sterilizeHer kullanımdan önce etilen oksit ile nnectors. Ürün in vivo olarak test edilecek ise, bu özellikle önemlidir.

2.. LOM imalatı

  1. GMP 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC) ve HCT tabanında 10 g kolesterol, 20 g yerleştirin. Sulu faz içine mümkün olduğu kadar lipid entegre, 1 dakika için karıştırın ve el HCT Plazma-Lyte A 1 L ekleyin.
  2. Tüm kafa karıştırıcı, sulu faz ile kaplıdır sağlanması, sulu faza tek kademeli karıştırıcı indirin. HCT üst sıkı bir gazdır (yukarıdaki Adım 1.1) ve hiçbir tarafı açık bağlantı noktaları vardır emin olun. Port # 4 bağlı gaz kaynağı açın ve HCT tepe boşluğu oksijen fraksiyonu>% 95 ulaşana kadar bekleyin. 10 L / dk (LPM) de, bu ~ 10 dakika almalı.
  3. Tek aşamalı karıştırıcı kullanarak, 5000 rpm'de 5 dakika için ön-emülsiyonu karıştırılır. Elde edilen karışım, soluk beyaz görünür ve görünür bir Lipi içermelidird kümeleri. Bir kez karıştırıldı, kullanılmayan lipid-su karışımı, tek bir kullanımdan önce, 30 güne kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  4. Prime 1.3 LPM'de de roller pompa açarak öncü emülsiyon ile tüm kapalı döngü sistemi. Sistem dolana kez, 1.3 LPM'de de pompayı tutun.
  5. LOMs imalatını başlamak için, 7,500 rpm-line yüksek kesme homojenleştiricisi açın. Bundan hemen sonra, 0.5 LPM de homojenleştirici giriş kısmına oksijen akışını açın. 3,500 rpm üzerindeki (HCT olarak) tek aşamalı karıştırıcı tutun. LOMs in-line homojenizerden (Şekil 2) içinde rotor bıçakları ve emulsor ekranlarının arayüzünde oluşturulmaktadır. Birkaç dakika içinde, gözle görülür bir şekilde daha zor akışlı akışkan olmalıdır. Daha ayrıntılı bir yaklaşım, imalat sırasında Port1'inden numuneler çıkarılması ve bir viskometre ile analiz yapılabilir, zamanın bir fonksiyonu olarak viskozite belirlemektir.
    Not: görünür hava kabarcığı karıştırıcı, oksijen çıkan boru içinde mevcut isein-line homojenizerden akışının çok yüksektir. Sıvı opak ve görünür hiçbir gaz baloncukları kadar gaz akışını aşağı titre.
  6. 15 dakika boyunca sistem çalıştırın ve sonra buna yüksek kesme Homojenizatör ve oksijen giriş kapatın. Emülsiyon kaldırılır kadar HCT olarak tek aşamalı karıştırıcı çalışmaya devam eder; Bu faz ayrılmasını azaltır ve HCT içinde nispeten homojen bir ürünü tutar.
    Not: gazla doldurulmuş emülsiyon hacmi seri konsantrasyonu aşamasında, yaklaşık 2-3x artırmalıdır. Bu sağlamak için kontrol etmiyorsa oksijen yüksek kesme homojenizatör içine akar ve ön emülsiyon bu lipid konsantrasyonları doğru. Lipid konsantrasyonu azaldıkça üretim verimliliği azaltır.

3.. Koleksiyonu, Konsantrasyon, Değerlendirme ve LOMs Depolama

  1. Steril takın, toplama kabına baz port # 1 bağlı musluğa 140 ml Luer-lock şırınga değiştirilmiş. 10 çizinSıvının 0 ml. Tüm akışkan kaldırıldı kadar sıkıca şırınga ve tekrar kap.
    1. Şırıngaya havanın çekilmesi, 100 ml ve daha sonra 140 ml işaretinin üzerinde fazla pistonu ve şırınga malzemeyi testere ile şırınga değiştirin. Dolgu ve pistonu yukarı çekmek için dişli forseps kullanarak boş şırınga. Bu modifikasyon, daha kolay santrifüj sağlar.
  2. 10 dakika boyunca 225 x g 'de bir buzdolabında (4 ° C) santrifüjü kova aşağıya doğru dönük ucu ile kapaklı santrifüj şırınga.
  3. Üç kat malzeme santrifüj sonra görünür. Fazla kapalı sulu fazın alt tabaka Expel ve atın. İkinci katman parlak beyaz ve konsantre edilerek LOMs içerir. Gaz, çevre kirliliğini önlemek için üç yollu valf kullanılarak bir gaz geçirmeyen şırınga konsantre edilerek bir köpük aktarın. Kopan LOMs gelen serbest oksijen gazı içeren son kat, atın.
  4. Köpük kalite konsantre köpük ≥% 90 gaz ulaşarak değerlendirilebilir. Calculaşağıdaki gibi gaz konsantrasyonu yedik:
    Hacmi% gaz = [(Köpük ağırlık / hacim Köpük) - 1] x 100
    1. Parçacık boyutu beklenen aralık içinde ise bir ikinci kalite kontrol olarak, ışık kararması ile boyut mikrokabarcıklar belirlemek. Bu, homojenleştirme zaman ya da formülasyon içinde bir değişiklik baloncuk büyüklüğünü değiştirebilir unutulmamalıdır.
  5. Sıkıca bir luer-lock montaj ile cam şırınga kap. Konsantre LOMs kullanım sırasında plazma Lyte A ile seyreltilebilir. Şırınga, 22, 4 ° C'de saklanabilir, ya da -20 ° C; soğuk sıcaklıklar gelişmiş raf ömrü stabilitesi 7 sağlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek kesme homojenizasyon bir hayvan çalışma için yeterli LOMs etkin (bir öğleden sonra içinde yani) üretimini sağlar ve teknik uzmanlık gerektirmez. Bir kez yeterli konsantre LOMs en fazla 2 L 90 dakika içinde imal edilebilir.

Mikro-kabarcık boyut ve şekil ve ışık mikroskopisi ile ışık kararması ile değerlendirildi. LOMs bir 10 ul örnek gözlendi zaman, küresel LOMs belirtildiği gibi, hem de lipid enkaz göreli yetersizliği (Şekil 3A) edilmiştir. GMP ürün kullanıld...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konsantre, yüksek oksijenli LOMs oluşturmak için en önemli adımlar şunlardır: 1) HCT içinde tepe boşluğunun tam olarak oksijenli kalmasını sağlamak; 2) lipid yardımcı maddelerin saflığının (C) depolama koşulları ve GMP ürünlerin kullanımı da dahil olmak üzere uygun olduğunu temin etmek; 3) toz haline getirilmiş lipidler sistemin hazırlanmasından önce, sulu faz ile tamamen karıştırmak sağlanması; ve 4) gaz hacim oranı% 70 aşmamasını sağlamak için HCT içinde gaz fraksiyonu artışa dikkate almıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansman: ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (USAMRMC) ve Teletıp ve İleri Teknoloji Araştırma Merkezi tarafından yönetilmektedir. Shunxi Ji burada tarif edildiği gibi şırıngaların modifikasyonu olmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,2-distearoyl- sn< / em>-glisero-3-fosfokolin (DSPC770365Alternatif ürün: NOF America'dan GMP olmayan (Coatsome MC-8080)
KolesterolSigma AldrichC75209
Plazma-Lyte AVWR80089-818Alternatif olarak NaCl
Cam toplama kabıSpecialty Glass, Inc.Özelİletişim: Pam Zurbrick - 281-595-2210
Gaz bileşimi (oksijen) monitörüHassas MedikalPM5900L
Sarns 8000 silindirli pompaCalicut Medical16407Modüler perfüzyon sisteminin bir parçası
BIOtherm Isı EşanjörüMedtronicECMOtherm-II
Verso laboratuvar hat içi karıştırıcıSilverson Machines, IncTH-IL-102-VERSOT parçalı çok kademeli çalışma kafaları ve ön uç uzantısı kullanın
Süreç YenilikleriÖzelİletişim: Brian Leavitt - 508-423-2266
L5M-A laboratuvar mikseriSilverson Machines, IncNC0136483Mesh emülsör ekran kullanın (ince)
Rochester-Ochsner dişli forsepsFisher Scientific13-812-18
140 ml şırıngaKendall Healthcare Monoject 8881114030Bir luer kilidi olduğundan emin olun.
IX71 Ters ışık mikroskobuOlympusIX71
Retiga-2000R mikroskop kamerasıQImagingRET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A Otomatik SeyreltmePSS-NICOMP Partikül Boyutlandırma SistemleriÜretim
) kullanabilirsiniz. Silverson Verso giriş portu için Dışı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
  2. Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
  3. Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
  4. Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
  5. Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
  6. Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
  7. Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
  8. Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
  9. Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
  10. Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
  11. Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
  12. Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
  13. Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
  14. Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
  15. Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
  16. Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
  17. Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
  18. Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
  19. Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lipid Tabanl Oksijen MikrobaloncuklarOksijen Hacim Y zdesiPartik l Boyutu Da l mGaz Konsantrasyonu l mEm lsiyon Viskozite AnaliziKapal D ng SistemSantrif gasyon KonsantrasyonuI k Sa l m Teknolojisi

İlgili makaleler