Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde Hidrodinamik Gen Taşıyıcı Proteinlerin Geçici İfadesi

28.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51481

⸱

5 Mayıs 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

Bu makalede

Özet

Hidrodinamik gen aktarımı ile çıplak DNA vivo transfeksiyonu minimal bir enflamatuar cevap ile hayvanın doku içine genleri getirmektedir. Gen ürününün yeterli miktarda gen fonksiyonu ve düzenleme hem de protein yapısı ve fonksiyonu analiz edilebilir şekilde oluşturulur.

Özet

In vivo olarak etkin transgenlerin ifadesi gen fonksiyonu çalışmalarında ve hastalıklar için tedavi geliştirilmesinde kritik bir önem taşımaktadır. Geçtiğimiz yıllarda, hidrodinamik gen teslimi (HGD) kemirgenler transgenlerin sunmak için, basit, hızlı, güvenli ve etkili bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, perfüze edilmiş organ, hücre membran geçirgenliğini artırmak için fizyolojik bir solüsyon büyük hacimde hızla enjeksiyon ile oluşturulan kuvvetin dayanır ve böylece hücrelere DNA sağlar. HGD en önemli avantajlarından biri, çıplak plazmid DNA (pDNA) kullanılarak memeli hücrelerine, transgenlerin sokulması için yeteneğidir. Bir plazmid kullanılarak bir dışsal gen tanıtan son derece güvenli, minimal yüksek verimli, zahmetli ve viral taşıyıcılar aykırıdır. HGD Başlangıçta farelere gen teslim etmek için kullanılmıştır, artık oligonükleotitlerin, yapay kromozomlar, RNA, protein ve farelere küçük moleküller dahil olmak üzere, maddeler, geniş bir yelpazede, fare teslim etmek için kullanılırve sınırlı bir dereceye kadar, diğer hayvanlar. Bu protokol farelerde HGD açıklar ve başarılı bir işlemi gerçekleştirmeden için kritik olan yönteminin üç önemli yönleri üzerinde duruluyor: damara iğne doğru yerleştirilmesi, enjeksiyon hacmi ve teslimat hızı. Örnek olarak, salgılanan, primat özgü proteinleri kodlayan iki genin geçici ifadesi için, bu yöntemin uygulanmasını göstermek için verilmiş olup, apolipoprotein LI (APOL-I) ve haptoglobin-ilişkili protein (HPR).

Giriş

Tarafından ilk tanımlanmasından bu yana Liu ve ark. Ve Zhang ve diğ., Hidrodinamik gen teslimi (HGD) kemirgen model sistemleri 1, 2 gen fonksiyonunu incelemek için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Bu teknik, hedef organ 1, 2 hücreleri tarafından plazmid DNA alımını kolaylaştırmak için farelerin kuyruk venine çözeltinin büyük bir miktarda (% 8-12 vücut ağırlığı) hızla enjeksiyon (5-7 saniye) içerir. Bu koşullar, böbrek, dalak, akciğer ve kalp, karaciğer ve daha az gen ifadesinde sağlam gen ekspresyonuna yol açar.

10 ug pCMV-LacZ plazmid enjeksiyonu HGD tarihinden 1 en verimli, viral olmayan, in vivo gen dağıtım yöntemi yapma, hepatositlerin 40'a kadar% transfect olabilir. Viral taşıyıcılar farklı olarak, pDNA hazırlanması kolaydır, kemirgen ana 3 bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak yoktur ve sonu ile tekrar birleştirme ile bir sağlık riski teşkil etmezogenous virüsler. HGD tarafından sağlanan DNA molekülleri paketleme gerekmez çünkü ek olarak, bu yöntem, 150 kb 4 kadar büyük bakteriyel yapay kromozom (BAC) verilmesi için uygundur. Bir hidrodinamik yöntem ile teslim edilmiştir moleküllerinin diğer tür RNA 5-10, morpholinos 11, proteinler 12, 13, ve diğer küçük moleküller 12, 14 içerir. Diğer dağıtım yöntemlerine göre HGD avantajları ve dezavantajları literatürde 15-20 mükemmel incelemelerde tartışılmış ve yazarların bir dizi prosedür 21-23 ayrıntılı bir açıklamasını sağladı.

HGD ile farelere transgenleri güvenli ve 1-3, 24 etkilidir ve yöntem, benzer başarılar 25 sıçanlarda kullanılmıştır. Bazı değişikliklerle birlikte, proof-of-concept deneyleri tavuk 26, rab olarak yürütülmüştürDaha büyük hayvanlarda, bu tekniğin in vivo uygulama için bir sorun olmaya devam etmektedir, her ne kadar, 27, domuz ve 28 bit. Bu yöntemi kullanılırken, başka bir ortak sınırlama mevcut memeli ekspresyon vektörleri çok gen ekspresyonunun bir kalıcı, yüksek düzeyde elde etmek için bileşenleri eksikliği olmasıdır. Hedef organlarda bir plasmid pCMV-Luc, gen ekspresyonunu kullanarak ancak başlangıç ​​yüksek ifade seviyesi enjeksiyondan 1 sonraki ilk hafta içinde keskin bir şekilde düşmektedir, HGD on dakika sonra kadar erken belirgindir. Uzun vadeli bir transgen sentezleme plasmidi tasarım 3, 24. Bununla birlikte, yüksek düzeyde gen ifadesinin bakım gerektirir sık sık tekrarlanan enjeksiyonu kullanılan promoteri ve intron bağlı olarak değişiklik mümkündür. Bu nedenle, HGD zarar proteinler veya protein ürünlerine uzun süreli maruz kalmanın bir sonucu olan kronik hastalıklar incelemek için daha az uygun olabilir. Bu sınırlamalar, HGD po eğitim için son derece güçlü bir araçtırbir gen ve bunun etkisinin aşamasında potansiyel rolü (inceleme için, bakınız 15), in vivo, hem de tedavi edici etkileri ve proteinlerin düzenlenmesinde ve hastalığın hayvan modellerinde kurulması için mutantlarımn. Örneğin, tek tek HGD ilgili genlerin nakavt olan farelere çeşitli gen konstruktları getirerek etki ve proteinlerin amino asitlerine işlev atamak için kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik, bir fare türünde kullanılabilir.

Teslim ven, enjeksiyon hacmi ve hız içine doğru iğne ekleme: Bu protokol, başarılı transfeksiyonunu ulaşmak için gerekli teknik yönleri odaklanarak farelerde HGD açıklanır. Bu yöntemin uygulanması Afrika trypanosomiasis, insan ölümcül bir hastalık ve çiftlik hayvanları 29, 30 sahip bir fare modelinde gösterilmiştir. Trypanosom birkaç tür hayvan hastalığa neden olsa da, çoğu b immün komplekslerin doğuştansa nedeniyle insanlarda hastalığa neden olmazlood adı tripanosom litik faktörleri (TLFs) 29, 31, 32. Bu gözenek oluşturucu, yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) iki eşsiz, primat özgü protein içerir:. Trypanosom TLFs içine alınmasını kolaylaştıran HPR, ligand, ve APOL-I, litik bileşen 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense nedeniyle bağlanan ve insan APOL I-34, 39 nötralize eden bir serum direnci ile ilişkili protein (SRA) sentezlenmesi için insanları enfekte edebilmektedir. Babun TLF nedeniyle farklı APOL-I protein 40 SRA ile nötralize edilmez. Bir memeli ifade vektörü (pRG977), farelerde babun TLF bileşenlerinin transgenik ekspresyonunu kullanarak, daha önce belirtildiği gibi bir insan-enfektif trypanosom 40 karşı koruma sağlamaktadır. Burada sunulan veriler için temsili hidrodinamik gen verici bir proteinin tedavi edici etkilerini incelemek için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada anlatılan deneyler Hunter College Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, New York Şehir Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Endotoksin serbest plazmid DNA 'sının 1. Hazırlanması

  1. Yeni boyanmış bir seçici levhasından bir memeli ifade vektörü içinde, ilgi konusu geni içeren bir bakteri tek bir koloni seçin.
  2. Bakterilerin büyüyen ve hasat için bir ticari olarak temin edilebilir, endotoksin içermeyen plazmid saflaştırma kitinin el kitabında bulunabilir uyun.
  3. Bir ticari olarak temin edilebilen, endotoksin içermeyen plazmid saflaştırma kitinin protokolü izleyerek bakteriyel hücrelerden endotoksin içermeyen plazmid DNA arındırın.
  4. Endotoksin içermeyen plastik eşya kullanın ve endotoksin çıkarma aşamasından sonra DNA örnek yeniden dahil değildir sağlamak için dikkatle DNA kolu.
  5. MICR kullanılarak 260 nm'de emiciliğin saptanmasıyla endotoksin içermeyen plasmid DNA konsantrasyonu ölçüno-ses UV aşağıda açıklandığı gibi spektrofotometre veya standart, küvet-tabanlı spektrofotometre.
    1. Aşağıdaki gibi mikro spektrofotometre numune tutma sistemi alt ve üst optik yüzeylerini temizleyin. Düşük bir optik sistem üzerine temiz deiyonize su Pipet 1 ul. Manivela kolunu kapatın ve üst optik sistemi yıkanmak için onu birkaç kez dokunun, daha sonra açma kolu ve bir doku ile silin.
    2. Mikro spektrofotometre yazılımını açın ve nükleik asitler modülünü seçin.
    3. Manivela kolunu indirin ve program yazılımından "başlatılamadı" seçeneğini seçin, alt optik sistemde 1 ul deiyonize temiz su koyun. Başlatma bir doku ile, tam bir temiz hem optik yüzeyler bir kez ..
    4. Ve program yazılımı, "boş" seçilmesi; endotoksin içermeyen TE tampon maddesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0) ve 1 ul yüklenerek boş bir ölçüm yapın. Bir ile boş ölçüm yapıldıktan sonra, temiz, hem optik yüzeyleridoku.
    5. Program yazılım endotoksin serbest DNA örneği ve seçme "ölçü" 1 ul yükleyerek örnek ölçümü gerçekleştirin. DNA konsantrasyonu kaydedin. Ekranda emme oranı 260/280 nm kaydederek DNA saflığı değerlendirin. HGD saf DNA (1.8 arasında 260/280 oranı) kullanımı yüksek ölçüde tercih edilir olduğundan, 1.7 altında bir 260/280 oranında bir DNA örneği kullanmayın. Ölçüm yapıldıktan sonra, bir doku ile hem optik yüzeyleri temizleyin.

2.. Farelerin Tartım

  1. Soyu için bir şekilde uygun Mark fareler. Not: kuyruk işaretlenmesi Bu işlem için tavsiye edilmez.
    1. Siyah bir işaretleyici ile sırtlarında beyaz kürkü (örneğin İsviçre Webster) sahip Mark fare türleri. Gerekirse zamanla işaretleri yeniden uygulayın.
    2. Kulak siyah kürk (örneğin C57BL / 6) sahip Mark fare türleri birkaç gün önceden delme.
  2. Fareler individua tartılırLly nazikçe bir hayvan tartı tava veya kova yerleştirerek bir dijital laboratuar denge üzerine yerleştirilir. Deney gününde, Deneyde kullanılan her fare ağırlığını kaydedin.

Şırınga 3. Hazırlanması

  1. Enjeksiyon karışımı hazırlanması
    1. Her bir fare, enjeksiyon için 50 ug endotoksin içermeyen plazmid DNA - 5 varsayarak gerekli DNA miktarını hesaplayın.
      1. Deneysel olarak plazmid DNA uygun miktarını belirleyin.
      2. Gerekli DNA miktarını belirlerken, şırınga uygun yükleme fazladan püskürtme karışımı gerektirir gibi, grup başına ek bir fare enjeksiyon varsayalım. Hesaplamalar yardımcı olmak için, aşağıdaki örneği düşünün: fare başına 50 ug plazmid DNA ile, 4 deney ve 4 kontrol fareleri, her birinin ağırlığı 25 g enjekte. Her bir grup için gerekli 5 x 50 ug = 250 ug DNA: Bu durumda gerekli DNA miktarını belirlemek için, her grupta 5 fare ile hesaplar.
    2. Her bir fare, enjeksiyon için vücut ağırlığının% 10 kabul edilerek gereken tuz miktarı (% 0.9 sodyum klorür) belirler.
      1. Yukarıdaki örneğe göre, 2.5 ml tuz çözeltisi (2.5 g, sıvı) içinde plasmid DNA, 50 ug her biri 25 g fare enjekte edilir.
      2. Farelerin bütün bir grup için gerekli tuz miktarı belirlerken, şırınga uygun yükleme sağlamak için grup başına ek bir fare enjeksiyon varsayalım. Verilen deney göz önüne alındığında, her bir grupta 5 fare için gerekli tuz miktarının hesaplanması: 5 x 2.5 mi = her grup için 12.5 ml tuzlu su (ya da 25 ml toplam) hazırlandı. Not: aynı grup içinde farenin aynı ağırlık (vücut ağırlığı% 10'dan fazla bir fark) değil ise, enjeksiyon karışımları ayrı ayrı hazırlanır.
    3. 10 ml viyaller içinde çoklu kullanım, insan kullanımı için onaylanmıştır koruyucu-ve endotoksin içermeyen, steril tuzlu su kullanın.
    4. 20 ml'lik bir şırınga bir Luer-kilit ucuna bağlı bir 20 gauge iğne (25 mm x 0.9 mm) kullanılarak,tuzlu su şişelerine sıvıyı çekmek ve 50 ml konik bir tüp içine şırınga boşaltın. DNA-tuz püskürtme karışımlarının hazırlanması sırasında tuzlu su doğru pipetleme yardımcı olmak için, bir deneyde, tüm farelerin enjeksiyon için gerekli olandan daha fazla tuz toplar. Deney için gerekli tuz hesaplanan miktarı sadece 25 mi olsa bile, yukarıda deney için, 3 ila 10 mi küçük şişeler (yaklaşık 30 ml 'lik bir toplam) tuz çözeltisi geri.
    5. Farklı bir 50 ml konik tüp içine DNA hesaplanan miktarı Pipet. Endotoksin giriş önlemek için pipet vücut ile tüpün yanından dokunmamaya özen gösterin. Örneğe göre, ayrı ayrı, konik tüplere deneysel plasmid DNA 250 kontrol ug ve 250 ug pipetle.
    6. Serolojik bir pipet kullanarak DNA salin gerekli miktarını ekleyin. Göz önüne alındığında, örnek bir deney, ana karışımlar (deney ve kontrol) her birine pipetle 12.5 ml salin enjekte edilmiştir.
    7. Tüm çözümleri ulaşmasına izinenjeksiyondan önce oda sıcaklığı.
  2. Şırınga hazırlanması
    1. Her bir fare için, steril, 20-gauge iğne (0.9 mm x 25 mm) kullanılarak DNA-tuzlu su karışımı ile steril, 3 mi, luer-lock şırınga doldurun. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkat edin. Enjeksiyon akış hızı çok iyi kontrol edilemez ve bu bir yandan daha büyük bir şırınga işlemek zor olduğu için daha yüksek hacimli şırıngalar kullanılarak kaçının. Bu yeniden kullanılabilir olabilir gibi geri konik tüp içine herhangi bir aşırı DNA-tuz karışımı çıkarın.
    2. Steril, 27-gauge iğne ile iğne geçin. Tamamen hava kabarcıkları tanıtan olmadan sıvı ile iğne doldurun. Fare ağırlığına göre hesaplanan DNA-tuzlu karışımı ses seviyesini ayarlayın.
    3. Değişkenliklidir iğne herhangi bir non-steril yüzeyine temas etmesine izin vermeyin. Diğer elinizle kapağı tutmadan iğne takın ve şapkalı iğne basın, düz bir yüzeye yerleştirin kap: Gerekirse, iğneler tek-el tekniği kullanılarak yeniden kapatılmış olabiliriğne üzerine kapağını sabitlemek için sağlam bir nesneye karşı. Şırıngalar artık kuyruk ven enjeksiyonlar için hazırız.

4.. Hidrodinamik DNA verme

  1. Anestezi fareler canlılığı azaltabileceğini unutmayın. Bu da canlılığı azaltmak gibi, çok soğuk bir odada HGD performans kaçının. Oda 20 ° C ortam sıcaklığı veya anestezi kullanarak, eğer herhangi bir hayvan kaybını önlemek için 37 ° C sonrası prosedür ayarlanmış bir ısıtma yastığı fareler koyarsanız. Anestezi kullanıyorsanız, fare, ağız ve burun ısı yastığı kapatılmamış iken ve tamamen iyileşene kadar fareyi gözlemlemek emin olun. Önce HGD için farelerin yiyecek veya su kesintisi yok.
  2. Kan damarlarını genişletmek için fareler ısıtın.
    1. Yatak sıcaklığı, yaklaşık 38-39 ° C olacak şekilde 5 dakika için bir ısı pedi üzerinde fare kafes (yatak dahil) ile yerleştirin Sıcaklık, bir ısı için ped üzerindeki fareler tutmak için yeterince düşük olmalıdıruzatmıştır.
    2. Alternatif olarak, en az kısıtlama ile bir dorsal erişim süzgeç içine fare yerleştirin. Yavaşça sıcak suda nemlendirilmiş gazlı bir parça ile tutarak, 1 dakika boyunca fare kuyruk ısıtın. Gerekirse, yeniden pozisyon fare izin verin. Kuruması için bir doku ile kuyruk silin.
    3. Alternatif olarak, en fazla 2 dakika boyunca bir ısı lambası altında kafes yerleştirilerek sıcak mouse. Bir ısı lambası kullanıyorsanız, fare aşırı ısınmasını önlemek için dikkatli.
  3. Geniş hacimli kuyruk ven enjeksiyon
    1. Laboratuvar bant ile düz bir yüzey üzerinde bir dorsal erişim koruyucularını hareketsiz.
    2. Kuyruk tarafından tutarak, yavaşça süzgeç içine fare koyun ve fişi takın. Hareketsiz kuyruk tutmak için gerekli olduğu kadar az kısıtlama kullanın. Fare özgürce nefes emin olun.
    3. Fare işlem sırasında herhangi bir noktada ciddi bir sıkıntı içinde olduğunu, hemen süzgeç fare kaldırmak ve dinlenmeye bırakın.
    4. Fareyi yerleştirin böyleceyanal kuyruk damarlarının bir görülebilir. Kuyruğun her iki tarafındaki mavi çizgiler, yanal kuyruk damarlar iken kuyruk ortasında çalışan kırmızı çizgi, bir arter: fare arkasında aşağı doğru bakarak, yanal kuyruk venleri bulun.
    5. Iyice bir alkollü bez ile fare kuyruğu silin.
    6. Kuyruk orta ve üçüncü parmakları üzerinde ve küçük parmak altında, işaret parmağı altından geçecek şekilde olmayan enjekte elinizi kullanarak, işaret ve orta parmakları arasında sıkıca tutun kuyruk. Başparmak hareket serbest kalmasını sağlar. (Şekil 1A)
    7. Diğer elinizi kullanarak, bir alkollü bez ile tekrar enjekte edilecek bölgeyi silin. Alan kurumasını bekleyin.
    8. Enjekte el ile yüklenen şırınga Pick up ve başparmak ve diğer dört basamak arasındaki varil tutun. Pistonun üzerine tutmayın.
    9. Fare gövdesine doğru iğne işaret ile kuyruk şırınga paralel yerleştirin veyukarı bakacak şekilde iğne konik (eğik kenar).
    10. Kuyruk damarı içine iğne yerleştirin. Hiçbir direniş ile sürgülü iğne bellidir ven doğru bulunduğu sadece enjeksiyon ile devam edin. Iğne yerleştirme derinliği, ancak tam ekleme nedeniyle damar kesme riski tavsiye edilmez kişisel tercih meselesi olduğunu unutmayın. Iğne hareket kaçının.
    11. Kuyruk tutan elin başparmağını kullanarak, pozisyonda İğneyi tutmak için kuyruk karşı iğne ve basın göbeğin göbeği üzerine kapatmak. Aşırı basınç uygulamayın ve bu ven içine sıvı akışını engelleyeceği gibi, iğne miline tutmayın. Enjeksiyon (Şekil 1A) engel olmayacak şekilde gevşek bu noktada parmağı ile kuyruk tutun.
    12. Parmağı ve orta parmak flanş tutunarak ve başparmak pistonun ucunda (Figür üzerine böylece şırınga tutan el yeniden konumlandırmake 1A).
    13. Biri, sürekli hareket halinde piston üzerine bastırın ve 6-8 saniye içinde sıvı dolu hacmi enjekte.
    14. Damardan iğne çıkarın ve bir doku ile kuyruk hafif bir basınç uygulayarak kanamayı durdurun.
    15. Bir ısıtma yastığı üstüne yerleştirilen bir kurtarma kafesine restrainer ve yerde fare fareyi çıkarın (yatak 37-38 ° C olmalıdır.) Enjeksiyon odası soğuk ise, bu adım fare hayatta kalmak için çok önemlidir. Kanama tamamen durana kadar fare kuyruğu üzerine tutun.
    16. Hidrodinamik DNA doğumu takiben 1 saat boyunca fareyi gözlemleyin. Soluk soluğa ve hareketsizlik bir başlangıç ​​dönemi nedeniyle HGD nedeniyle geçici aritmi normaldir ama fare, yaklaşık 5 dakika içinde iyileşme belirtileri gösterir emin olun. Fare nefes derece sığ olur, yavaşça nefes kolaylaştırmak için fare karın masaj. Iyileşme bu oran biraz kullanılan fare suşu etkilenmiş olabilir edin.
    17. Dönüş farekonut kafesine ve fare yiyecek ve su bol miktarda kaynağı vardır emin olun.
  4. Alternatif bir el konumunu kullanarak büyük hacimli kuyruk ven enjeksiyon
    1. Süzgeç fare içine yerleştirin ve daha önce tarif edildiği gibi, 4.3.5 arasındaki adımları 4.3.1 izleyerek enjeksiyon için hazırlar.
    2. Bir doksan derecelik bir açıyla bükülmüş dört parmak ile düz bir yüzeye olmayan enjekte elini dinlendirin. Parmaklar (başparmak hariç tüm) bir platform oluşturarak, birbirlerinin üstüne durmalıdır. Başparmak ve işaret parmağı (Şekil 1B) arasındaki fare kuyruğu tutun.
    3. Diğer elinizi kullanarak, bir alkollü bez ile tekrar enjekte edilecek bölgeyi silin. Alan kurumasını bekleyin.
    4. Enjekte el ile şırınga kapmak ve flanş ve enjeksiyon için hazır pistonun, sonuna tutun.
    5. Daha önce açıklandığı gibi, adım 4.3.17 boyunca adım 4.3.9 bu protokolü izleyerek prosedürü uygulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fare kuyruk venine iğnenin doğru pozisyonu (Şekil 1 'de gösterildiği gibi) başarılı bir hidrodinamik bazlı transfeksiyon ile bir transgen sağlanması için bir ön koşuldur. Enjeksiyon hacmi tüm bir 6-8 s bir süre içinde teslim edilebilir, böylece genellikle tekniğin en zor parçası, ancak hareket olmadan kuyruk damarı içinde iğnenin tutma olduğunu. , Enjeksiyon işlemi sırasında küçük hatalar çok düşük transfeksiyon verimi ve protein ekspresyonu neden olabilir. Bu nedenle, her bir deney için HGD başarıs...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Doğru yapıldığında, HGD transgen teslim derece güvenli ve etkili yoludur. Başarılı HGD için kritik adım vardır: 1) en az 8 saniye içinde fare 3) kuyruk damarına) tuzlu su taşıtı 2 büyük bir hacim içinde DNA doğru miktarda da sunmaktadır.

Enjeksiyon kendisinin işlem inkar edilemez bir el becerisi gerektirir, bu altı ikinci prosedürün başarısı genellikle Deneyin dikkatli bir hazırlık yatmaktadır. Maksimal gen ekspresyonunu elde etmek için gerekli pDNA miktarı, kullanılan plazmid ve bu nedenle ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Biz başlangıçta bize teknolojinin çeşitli alanlarında yaptığı sürekli rehberlik HGD tekniği ve Dr Russell Thomson (Albert Einstein Tıp Koleji) öğretim için Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) teşekkür ederim. Bu çalışma Hunter Koleji tarafından finanse edildi, CUNY fonları kurmak ve NSF Ekmek ödül IOS-1249166. Biz fare karaciğerleri üzerinde histoloji için NYULMC Histopathology Çekirdek NYUCI Merkezi Destek Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alkol Hazırlama MendilWebcol6818
AST kiti, Amplite KolorimetrikAAT Bioquest13801
Konik Tüp, 50 mlBD Falcon352070
EndoFree Plazmid Maxi KitiQiagen12362
KimWipesKIMTECH34120
Fare Kuyruğu AydınlatıcıBraintree ScientificMTI RSTVeya eşdeğeri
İğne, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)BD305175
İğne, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)BD305109
pRG977 (memeli ekspresyon vektörü)Regeneron PharmaceuticalsMalzeme Transfer Anlaşması gerekli
Sodyum Klorür, %0.9 INJ USP 10 ml, Hospira FisherNC9054335
Şırınga, 3ml, Luer-Lok TipBD309657Luer Kilidi, HGD'den gelen basınca dayanmak için gereklidir

Kaynaklar

  1. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  2. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  3. Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
  4. Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
  5. Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
  6. Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
  7. Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
  8. Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
  9. McCaffrey, A. P., et al. RNA interference in adult mice. Nature. 418, 38-39 (2002).
  10. McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
  11. McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
  12. Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
  13. Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
  14. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
  15. Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
  16. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
  17. Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
  18. Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
  19. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
  20. Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery. Adv Genet. 54, 65-82 (2005).
  21. Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
  22. Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
  23. Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery of DNA. Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).
  24. Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
  25. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
  26. Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
  27. Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
  28. Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
  29. Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
  30. Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
  31. Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
  32. Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
  33. Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
  34. Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
  35. Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
  36. Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
  37. Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
  38. Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
  39. Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
  40. Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
  41. Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
  42. Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
  43. Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Geçici Protein EkspresyonuÇıplak Plazmid DNAKuyruk Venine EnjeksiyonWestern Blot AnaliziFare Kan Örneği AlmaPlazmid DNA HazırlamaŞırınga Doldürme Tekniğiİğne Pozisyonunun KorunmasıAPOL-I HPR Tespiti
Farelerde Hidrodinamik Gen Taşıyıcı Proteinlerin Geçici İfadesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.