Yöntem makalesi

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama Drosophila Dokular Yerinde

DOI:

10.3791/51528

⸱

14 Ağustos 2014

 ,  , 
1Department of Biology, College of William & Mary

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila yapılan çalışmalar embriyo ve larva gibi hücre kaderi şartname ve organogenezis gibi gelişimsel süreçlerine önemli bilgi sağlar melanogaster. İmmünoboyama doku ve organların geliştirilmesi görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, embriyojenez sonunda oluşturan bir koruyucu üst deri geç dönem embriyo ve larvalarına antikorların geçirmesini engeller. Immün önce diseksiyon düzenli Drosophila larva dokularının analiz etmek için kullanılır iken, küçük dokular bulmak ve izole etmek zor olabilir çünkü, bazı analizler için verimsiz kanıtlıyor. Sonikasyon larva Drosophila immünoboyamasıdır protokoller diseksiyon için bir alternatif sağlar. Geç evre embriyo ve larvaların çok sayıda hızlı, eşzamanlı işleme izin verir ve yerinde morfolojisi tutar. Formaldehit içinde tespit sonra, bir numune ultrasonik banyoda tutulur. Numune, daha sonra antigen-spesifik primer ant ile imüno tabi tutuluribodies ve floresan etiketli sekonder antikorlar floresan mikroskobu ile hedef hücre tiplerini ve spesifik proteinlerin görselleştirmek için. Sonikasyon işlemi sırasında numunenin üstüne, bir sonikasyon probu, hem de sonikasyon süresi ve yoğunluğu, uygun yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Standart immünoboyama protokolleri Ek bir küçük değişiklikler, yüksek kaliteli lekeler için gerekli olabilir. Gürültü oranı düşük sinyalli antikorlar için, daha uzun inkubasyon süreleri tipik olarak gereklidir. Bu Sonication kolaylaştırdı protokol konseptinin bir kanıtı olarak, gelişim aşamaları bir dizi üç doku tiplerinin (testisler, yumurtalıklar, ve nöral dokular) arasında immunohistokimyasal göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila embriyoları ve larvaları birçok organda ve dokuda gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model sunmaktadır. Tek tek hücrelerin Görüntüleme hücrelerinin geliştiği karmaşık ortamları tespit etmek için, bu çalışmalarda genellikle gereklidir. Dokusunun Görselleştirme imüno yoluyla gerçekleştirilebilir. Protokolleri 17 saat Yumurtlayarak (AEL) 1-3 sonra embriyonik Drosophila dokular (1. safha (L1), 2. safha (L2) ve 3. instar (L3)) daha sonraki aşamalarında verimsizdir. Bu verimsizlik bu genişletilmiş gelişme döneminde 4 sırasında meydana dinamik süreçleri anlamamıza engel dayatır. Tissue diseksiyonu bu engeli 5-7 aşmak için bir yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Ancak, diseksiyon verimsiz kanıtlayabilirim. Ekstraksiyon bulma veya embriyonik ve larva dokuları izole güçlüğü ile ipotekli olabilir. Bundan başka, hedef dokuların fiziksel giderilmesi, bunları kırılması ya da tamamen bunları elde etmek için başarısız olarak zarar görmesine neden olabilir.

Sonikasyon arası etkileşimleri bozmak ses dalgaları kullanan bir yöntemdir. Nöral hücre tipleri 6 geliştirmek immunostain amacıyla Drosophila larva kütikül bütünlüğünü bozmak için kullanılmıştır. Bu protokol geç evre embriyonik ve çapı 8-10 50um kadar küçük olabilir larva organlarında, immunostain adapte edilmiştir. Bu çalışmaları sayesinde, erkek tohum çizgisi kök hücreleri (GSC) hücresi oluşum süreci sonunda aşamasında karakterize edilmiştir kök hücre gelişimini düzenleyen ve dif Drosophila embriyolar 8-10 ve mekanizmaGeç evre embriyonik gonadlar ve larvaları ferentiation 9-12 saptanamamıştır. Böylece, sonikasyon nedeniyle doku boyutu zor olabilir doku diseksiyonu etkili bir alternatif sağlar. Bundan başka, bütün organizmanın bağlamında hücreleri bırakarak ve in situ morfolojisinde muhafaza yerinde Drosophila dokuların imüno-boyanmasını sağlar. Burada, in situ / erken orta L3 dokular içinden geç embriyonik aşama floresanlığıdır immün için adım adım protokol açıklar. Drosophila gonadal ve sinir dokusunun analizi bu protokolün etkinliğini göstermek için Temsilcisi Sonuçlar gösterilir. Ayrıca, bu imüno protokol bir dış kütikül diğer organizmalardaki diğer Drosophila dokusunu ve dokularının analiz edilmesi için adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir Toplama Cage 1. Hazırlık

  1. CO 2 genç, bereketli sinekler uyutmak. Bir kafese sineklere aktarın. Optimal verim elde 4 yaşı 2-7 gün arasında değişen 100-120 yetişkin sinekler kullanmak için: erkeklerin kadın 1 oranında. Sinekler uygun bir alışma dönemi Veren, ~ 24 saat tespiti için numune alınması öncesinde. 48 saat alışma dönemi - kafes bakire kadın ile kuruldu ise, erkeklere bir kullanımı 36 evlendirdi.
  2. Kafesin açık ucunda, kafesin açıklığın üzerine merkezi maya hamur bir bozuk para büyüklüğünde damla ile önceden hazırlanmış bir elma suyu agar plaka yerleştirin. Sonra, bant ile sabitleyin. Elma suyu agar plaka ve Parafilm ile kafesi arasında kavşak mühür.
  3. Baz olarak elma suyu agar plakası ile ikincil bir kap içinde kafes yerleştirin ve deney ile belirlendiği gibi sineklerin uygun bir zaman süresi için, belirli bir sıcaklıkta yeniden sağlar.
    Not: Örnek toplama kez wideğişir ll. Geç aşama embriyolar erken / L1 larvaları toplamak, örneğin, (17-24 saat), sinekler 25 ° C'de 17 saat boyunca önce numune yaşlanmaya karşı 25 ° C'de 7 saat boyunca elma sulu agar tabakları üzerinde yumurta bırakmaya izin verir. Benzer şekilde, orta-geç birinci değişim safhasındaki larva toplanması için (36-48 sa) sinekler 25 ° C'de 36 saat boyunca önce numune yaşlanmaya 25 ° C'de 12 saat boyunca yumurta bırakmaya izin verir.
  4. Süre tamamlandıktan sonra sinek anestezi olmadan uzakta elma suyu agar plaka damla böylece, bir masanın üzerine kafes dokunun. Çabuk maya hamur bir damla içeren bir taze, kullanılmış bir plaka değiştirin. Bant ve parafilm ile taze bir tabak Güvenli ve üs olarak elma suyu agar plaka ile kafesi saklayın.
  5. Dikkatlice bir metal spatula ile kullanılan plaka maya damla çıkarın. Deneysel gerekirse Yer kullanılan elma suyu plaka üzerinde kapak ve yaş embriyolar koydu izin verir.
    Not: numuneler, yaşlanma, levhalar 25 ° C'de muhafaza edilebilir, daha yüksek sıcaklıklar Experimenta olmadıkçaLly gerekli. Yukarıda açıklanan koleksiyonu için embriyolar yaş için nasıl örnekler (1.3 adım için nota bakınız). Yaşlanmayı örnek önce maya hamur çıkarılması mayaya tarama ve altında agar kesiliyor larvaları önlemek için yapılır. Kalan elma suyu agar ve maya yapıştırma kalıntı larva büyümesi için besin sağlar. Maya hamur direkt olarak belirtilen embriyolar maya hamur çıkarılması ile kaybolur da, bu kayıp boyama verimini azaltır numunede maya ve agar tortu tercih edilir. Bir maya macun kaldırmak için seçmek, maya, bir boya fırçası ile karıştırılmış Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) ile sıvılaştırılmış ve daha sonra önce tespit üzere bir hücre filtresinden ile numuneden uzaklaştırılabilir.

2. Sabitleme

  1. Elma suyu ağan plakası üzerine döşenmiş embriyolar Arzu edilen zaman noktasında yaş arası sonra, dikkatli bir şekilde th örneği almak için Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) bir eriyiği ile ıslatılır, küçük bir fırça kullanıne plakası.
    Not: Eski larva hareketlidir ve kapağın iç kısmına tarayabilir. Bu örnek, bir fırça ile uzaklaştırılarak elde edilmiş benzer şekilde elde edilebilir.
  2. Bir hücre süzgeç iç bakan sırt karşı örnek yüklü fırça silin. Ardından, süzgeç duvarları ve PBTx çözüm içeren bir bücür şişe fırça durulayın. PBTx çözümü yakalamak için süzgeç altında bir petri kapağı yerleştirin.
  3. Tüm numune filtresine transfer edilmesinden sonra, örgü kapalı numune yükseltmek için yeterli miktarda süzgeçten PBTx dökün. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz.
  4. Tekrarlayın Adım 2.3 üç kez maya kaldırmak ve numune ile birlikte aktarılmış olabilir atık uçmak.
  5. Örgü larvalarını yükseltmek için yeterli% 50 çamaşır suyu içine süzgeçten (NaOCI) / su (GKD 2 O) çözeltisi dökün. Larvaları 5 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Ardından, süzgeç kaldırın ve t dökmeko bir sıvı atık kabına petri içerikleri.
    Not: - koryonik membran kaldırmak amacıyla 22 sa Bleach sadece 0 yaş embriyonik örnekleri gereklidir. Büyük örnekler için çamaşır suyu uygulaması atlanabilir, ancak dahil zararlı değildir. Ihmal isteniyorsa, PBTx, bu aşamada ağartıcı değiştirin. Seyreltilmiş ağartıcı çözelti hazırlama, 24 saat içinde kullanılmalıdır.
  6. Örgü kapalı örneği yükseltmek için süzgeç içine yeterince PBTx dökerek PBTx ile süzgeç örnek yıkayın. Örnek 3 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz.
  7. Tekrarlayın Adım 2.6 beş kez.
  8. Hücre süzgecinden kuru alt Dab, daha sonra bir fırça ile PEMS çözeltisinin 1.75 ml'sini ihtiva eden bir parıltı şişesine içine örnek aktarmak.
  9. Bir havalandırılan bir duman başlığı içinde çalışan% 37 formaldehit ve 250 ul sintilasyon şişesine reaktif dereceli heptan 8 ml ekleyin.
    Not: Formaldehit ve heptan tehlikelidir. 3.3 - Güvenlik amaçları için, bir havalandırmalı davlumbaz çalışmak ve adımlar 2.9 uygun eldiven giymeye devam.
  10. Şişe 200 rpm'de ve 20 dakika için de benzer bir orta hızda çalkalanır izin verin.
  11. Önceki sulu fazın çıkarmadan sintilasyon şişesine 10 ml metanol eklenir ve şişe 1 dakika boyunca 500 rpm'de sallamak kuvvetli bir şekilde izin verir.
    Not: Metanol tehlikelidir. Havalandırılan bir davlumbaz çalışmak ve uygun eldiven giymeye devam.
  12. Kaputu bir sıvı atık kabına üzerinde bir hücre süzgeç içine içeriğini dökün hemen sallantýyý şişe çıkarın ve. Şişeye ilave metanol ekleyin ve bütün numune kaldırıldı temin etmek için önemli bir hücre süzgecinden çalıştırın.
    Not: Hücre süzgeçler yavaş boşalabilir. Bu sorunu çözmek için, daha hızlı bir şekilde süzgecinden çözelti çekmek için bir hücre süzgecinden altına laboratuar doku dokunun. Metanol, formaldehit, ve heptan 'dır olmalıdırkurumsal kurallarına göre uygun bertaraf kadar uygun bir atık kaplarda saklanır.
  13. Laboratuar doku kullanılarak hücre süzgecinden kuru alt metanol ve daha sonra 0.5 ml ihtiva eden 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süzgecinden yakalanan örnek aktarmak için bir fırça kullanılır.
    Not: Birden fazla ışıma flakon kullanımda ise, tam adımlar 2.12 ve bir seferde 2.13 bir şişe hücre süzgeçler üzerinde kurumasını örnek önlemek için.
  14. Örnek mikrosantrifüj tüpüne eklenmiştir sonra, bir pipetle, metanolün çıkması. Emin örnek tüpün dibine yerleşmiştir.
  15. Tüpe metanol yaklaşık 0,5 ml ilave etmek suretiyle mikrosantrifüj tüpü içinde örnek durulayın. Bundan sonra da dinlendirilir, bir pipet ile metanolün çıkması için numune bekleyin.
  16. Adım 15 tekrar üç kez.
  17. Bir tüpe metanol içinde 0.5 ml ilave edilir, ve daha sonra kaydetmek daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C sıcaklıkta dondurucuya.

3. Rehidrasyon ve immün için Numune Hazırlama

  1. Tüp içinde örnek bırakarak bir pipet ile mikrosantrifüj tüpü ve metanol çıkarın. Uygun bertaraf zamanına kadar uygun bir atık konteynerine Mağaza metanol atık.
    , Sonikasyon verimliliğini artırmak için numunenin en fazla 3 mm, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü altındaki yerleşmiş kullanın: edin. Aşırı numunesi yukarıda adım rehidrasyon başlamadan önce bir pipet ile ayrı bir tüpe aktarılır. Temiz bir jilet ile pipet kesme pipet tıkanmasını önlemek için de kullanılabilir.
  2. 3 dakika boyunca tüp ve kaya için% 50 metanol / Fosfat Tampon Tween, (PBTw) çözeltisi 1.0 ml ilave edilir.
  3. Uygun atık kabına metanol çözüm çıkarın ve iki kez PBTw 1.0 ul ile yıkayın. Her durulama sonra, numune, bir pipet ile ortadan kaldırılmasından önce PBTw oturmasına izin verin.
  4. Sığır Serumu Albümini / Fosfat Tamponlu Tween (BBTw) 1,0 ml ilave edilir ve şişe kaya karıştırın. Bir rocker 3 dakika sonra, SAMP sağlarle yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için.
  5. Tekrarlayın Adım Son yıkamadan sonra, numune kaybetmeden mümkün olduğu kadar BBTw kaldırmak için dikkat 3.4 iki kere verilir.
  6. Tüpe BBTw 0.5 ml ilave edilir ve buz üzerinde tüp yerleştirin.

Örnek 4. Sonikasyon

  1. 10% maksimum genlik için sonikator ayarlayın ve 2 sn sabit sonikasyonun bir çalışma süresini tayin.
    Not: Bu ayarlar Malzeme ve Ekipmanları Tablo belirtilen sonikatöre özgü ve farklı sonicators için optimizasyon gerektirebilir.
  2. Önceki örnek, sonikasyon işlemine, prob temizlemek için deiyonize su ve çalıştırma sonikatör ile dolu bir 50 ml'lik konik bir tüp içine prob ucunu yerleştirerek sonikatör probu temizleyin. Koşudan sonra laboratuvar dokusu ile kuru Sonikatör prob.
  3. Bu numune üzerinde yaklaşık 3-4 mm konumlandığı şekilde numuneyi içeren mikrosantrifüj tüpü içine daldırın ve sonikasyon probu başlar.
  4. M çıkarınicrocentrifuge boru sonikasyon ısı dağılımı ve örnek mikrosantrifüj tüp dibinde biriken izin vermek için en az 30 saniye boyunca buz üzerine yerleştirin ve.
  5. Tekrar 4.3 ve işlenen numune yaşına göre gerektiğinde 4.4 adımları.
    Not: Optimum Sonication örnek hacmi için, Sonikasyon gerekmez daha genç 17 saat embriyolar, ancak bu saat 17 ila 24 (/ 17 aşama, erken-L1) iki sonikasyon gerektirir. Larva arası 24-36 (erken / orta-L1), 36-48, (orta /-L1 geç) 48 - 60 (erken / orta-L2), 60-72 (orta / geç-L2), 72-84 ( )-L3 erken, 84-96 (erken / orta-L3), 96-108 (orta / geç-L3) hr gerektiren 5, 9, 11, 13, sırasıyla 15, 18 ve 22 sonikasyon. Sonication kez daha hazırlanması için tartışma bakın.
  6. BBTw iki kez 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin.
  7. Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir.
  8. Tekrarlayın Adım 4.7 iki kez.

5. immün

  1. Mikrosantrifüj tüpüne BBTw içinde seyreltilmiş,% 5, normal serumu ilave ederek örnek bloke eder. 1 saat boyunca sallanan sonra bloğunu çıkarın.
    Not: İkincil antikorlar uretıldığı türleri normal serum kullanın.
  2. % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk birincil antikorlar seyreltilir.
  3. 4 ° C'de ya da (yaklaşık 22 ° C oda sıcaklığında en azından 3 saat için primer antikor çözeltisi O kaya örnek / K.
    Not: Antikor inkübasyon süreleri ve sıcaklıklar değişebilir. O / N, oda sıcaklığında, 4 ° C'de inkübasyon ya da 3 saat tipik olarak yeterlidir. Bununla birlikte, iki günlük bir inkübasyon süresi, daha eski numune ya da düşük affiniteli primer antikorlar ile kullanıldığında, boyama kalitesini artırabilir. Daha uzun bekletme tipik olarak 4 ° C'de gerçekleştirilir. Sekonder antikor (5.10) kullanıldığında benzer sonuçlar elde edilmektedir gerekir.
  4. Örnek yerleşmek için izin vermikrofüj tüpün alt. Pipet ile primer antikorlar kapalı çizin. Arzu edildiği takdirde yeniden kullanım için antikorlar kaydedin.
  5. Iki BBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin.
  6. Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir.
  7. Tekrarlayın Adım 5.6 beş kez.
  8. Mikrosantrifüj tüpüne% 5 normal serumu / BBTw çözeltisi eklenerek Blok örneği. 1 saat 30 dakika boyunca sallanan sonra blok çıkarın.
    Bu ilave bir bloke etme adım gerekli değildir, ancak özel antikorlar için boyama kalitesini iyileştirebilir: edin.
  9. % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk sekonder antikorlar seyreltilir.
  10. Işığa maruz kalma nedeniyle solmasını azaltmak için bir alüminyum folyo içinde mikrosantrifüj tüpü sarın. 4 ° C'de 12 saat 48 için ikincil bir antikor ya da çözelti içinde, oda sıcaklığında (yaklaşık 22 ° C'de en az 3 saat boyunca Kaya örneği.
  11. Örnek mikrofuge'de tüpünün dibine yerleşmek için izin ver. Pipet ile ikincil antikorlar kapalı çizin.
  12. Iki PBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile PBTw kapalı çizmeden önce yerleşmek için izin.
  13. Flakon ve kaya PBTw 1.0 ml ekleyin. Kızağa üzerinde 5 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile PBTw kaldırmaktır.
  14. Tekrarlayın Adım 5.13 üç kez.
  15. İSTEĞE BAĞLI: 1,000 PBTw in: DAPI 1 seyreltilmiş ekleyin. Kaya örnek 3 dakika için alüminyum folyoya sarılmıştır; daha sonra bir pipet ile DAPI çözeltisi çıkarın. Örnek pipetle PBTw çıkarmadan önce çökmesine izin verdikten, PBTw 1.0 ml ile beş kez çalkalayın.
  16. -20 ° C'de mikrosantrifüj tüpüne ve saklamak için 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan (DABCO) çözeltisi 100 ul - 80 ekleyin.
    Not: Başka bir gliserol tabanlı bir anti-solmaya madde için ikame edilebilir.

6. Analiz

  1. DABKO / p-phen 10 ul - slaytlar üzerine numuneyi monte etmeden önce, ekstra 5 ekleylenediamine (PPD) mikrosantrifüj tüpüne antifade çözüm.
    Not: Örnek diseksiyonu olmadan slaytlar eklenebilir. Bir slayta eklenen Numune hacmi kapak kayma boyutuna göre değişir. Slayt üzerine örnek pipetlerken, pipet ucu numune kesme önlemek için bir jilet kullanarak kesilebilir. Bu kolay analiz için satırları örnek sıraya genellikle faydalıdır. Ilave madde olarak antifade DSD eklenmesi gerekli olmayabilir, ancak örnekler uzun süreli saklandığı takdirde, ışıkla önleyebilir.
  2. Yavaşça numune üzerinde cam kapak kayma yerleştirin. Sonra, yerde güvenli kapak kayma oje kullanarak.
  3. Görünüm floresan mikroskopi kullanılarak örnek monte edilmiş.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geç evre embriyonik ve larva in situ dokularının analizi içinde sonikasyon bazlı imüno etkinliğini göstermek için, vahşi tip embriyoları ve larva testis, yumurtalık immün ve nöral doku için işlenmiştir. Numuneler konfokal mikroskobu ile görüntülendi ve temsili sonuçları (Şekil 1 ve Şekil 2) gösterilmiştir. Sonuçlar tarif edilen protokol Drosophila gelişiminin geç embriyonik erken aracılığıyla / orta L3 aşamalarında morfolojik özelliklerin yanı sıra, tek tek hücrelerin ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, böylece başarılı bir diseksiyon için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, in situ Drosophila embriyonik ve larva hedef dokulara immunostain için bir yöntem sağlar. Erken embriyolar 1,2,3 boyanması için önce protokoller gereğince, koryonik membran% 50 çamaşır suyu (NaOCl) kullanılarak kaldırılır. Numuneler formaldehit ve metanol giderilmiştir. Larva kütikül yüzer eski numune neden olduğu için, bütün numune daha sonra larva tutulmasını sağlamak için bir hücre süzgecinden geçirildi. Örnek kimy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz nazik Vasa ve Trafik Jam antikorlar temin Ruth Lehman ve Dorthea Godt minnettarız. Biz NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi tarafından tutulan sağlanan hisse senetleri ve Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası korumak için Indiana Üniversitesi Bloomington Stok Merkezi'ni kabul etmek istiyorum. Biz onların tavsiye ve destek için Wawersik laboratuar tüm üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma Monroe Scholars Program Grant ve NSF (AF ve LB) (MW) IOS0823151 hibe ile finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tablo 1: Reaktifler ve Tamponlar
Fosfat tamponu Triton X-100 (PBTx)5 L için: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton %10. RT'de saklayın.
Fosfat tampon tuzlu su 10X (PBS 10X)dH'de 1 L için2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Bileşenleri ekleyin ve uygun hacme kadar doldurun. 4 ° C'de saklayın.
Triton %50 ml için: 5 ml Triton, 5 ml PBS 10X, 45 ml ddH2O. Karıştırmak için kaya. RT'de saklayın.
PEMS0,1 m borular (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. RT'de saklayın.
Borular400 ml'lik 0,25 M'lik bir çözelti (pH 6,9) için: 30,24 g Borular dH20 NaOH. Boruları 300 ml dH2O'da çözün ve ardından NaOH ile pH 6.9'a ayarlayın. dH2O ve otoklav ile toplam hacmi 400 ml'ye getirin. RT'de saklayın.
FormaldehitMetanol cinsinden ağırlıkça %37 formaldehit. Formaldehit, heptan ve metanol atık karışımını, kurumsal yönergelere göre atmadan önce çeker ocakta sıkıca kapatılmış bir kapta saklayın.
HeptanCAS 142-82-5n-Heptan. Formaldehit, heptan ve metanol atık karışımını, kurumsal yönergelere göre atmadan önce çeker ocakta sıkıca kapatılmış bir kapta saklayın.
MetanolCAS 67-56-1RT'de saklayın. Formaldehit, heptan ve metanol atık karışımını, kurumsal yönergelere göre atmadan önce çeker ocakta sıkıca kapatılmış bir kapta saklayın.
Fosfat tamponu Tween (PBTw)1 L yapmak için: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween %10. Tüm bileşenleri ekledikten sonra filtre sterilize edilir. 4 ° C'de saklayın.
Tween 10%50 ml için: 5 ml Tween, 5 ml PBS 10X, 40 ml ddH2O. Karıştırmak için kaya. RT'de saklayın.
Sığır serum albümini / fosfat tamponu Tween (BBTw)1 L yapmak için: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2< / sub>O, 10 ml Tween% 10, 1 g Sığır Serum Albümini (BSA). BSA ekleyin, ardından 0.2 & mu kullanarak sterilize edin; M vakumlu filtre ünitesi. 4 ° C'de saklayın.
Normal keçi serumu (NGS)ackson ImmunoResearch Laboratories005-000-12110 ml yapmak için: Normal keçi serumu 10 ml ddH2O. NGS şişesine ddH2O ekleyin ve 0.2 & kullanarak sterilize edin; m syrninge filtresi. Alikotları -20 ° C'de saklayın.
1,4-diazabisiklo[2.2.2]oktan (DABCO)CAS: 281-57-9100 ml yapmak için: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g DABCO katı, 3.5 ml 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 ml gliserol. Karıştırma çubuklu 250 ml'lik behere ddH2O, Tris HCl ve DABCO ekleyin. Karıştırın ve ardından 6N HCl, 10 N NaOH ve gliserol ekleyin. Daha sonra çözelti pH 7.5'e ulaşana kadar damla damla 10N NaOH ekleyin. Aliquot. Alikotları -20 ° C'de saklayın.
DABCO + p-fenilendiamin (PPD) çözeltisi1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). PPD'yi NaHCO3 ve NaCO3 çözeltisinde çözün. 60 &mu ekleyin; l 500 & mu'ya PPD çözeltisi; DABCO'nun l. Alikotları -20 ° C'de saklayın.
Elma suyu tabakları~200 tabak yapmak için: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g toz şeker (mağazadan satın alınmış), 500 ml elma suyu (mağazadan satın alınmış), 15 ml Tegosept %10, 1.5 ml ddH2O. 4 L'lik şişede ddH2O'ya agar ekleyin ve ardından 30 dakika otoklavlayın. Isıtılmış karıştırma plakasında elma suyu ve şekeri karıştırın. Yavaş yavaş elma suyu karışımını otoklavlanmış agar'a ekleyin. Isıtılmış karıştırma plakasında karıştırın, ardından 10 ml'lik hacimleri 35 mm'lik petri kaplarına alın ve katılaşması için RT'de bekletin. 4 ° C'de saklayın.
Tegosept %10100ml yapmak için: 10 g Tegosept, 100 ml etanol. Alikotları -20 ° C'de saklayın.
Maya macunu~ 50 g kuru aktif maya. Macun kıvamına gelene kadar karıştırırken maya içeren behere ddH2O'yu yavaş yavaş ekleyin. 4 ° C'de saklayın.
Tablo 2: Boyama Malzemeleri
DAPIInvitrogenD35711:1000, 5 mg / ml'de stok.
Tavşan anti-Vasa1:250, Ruth Lehmann'dan bir hediye.
Fare anti-Faşilin IIIGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)7G101:10
Fare anti-1B1Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)1B11:4
Guniea domuzu anti-Trafik Sıkışıklığı1:2500, Dorthea Godt'tan bir hediye (Li ve diğerleri, 2003).
Fare anti-ProsperoGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)Prospero MR1A1:10
Sıçan anti-ElavGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)7EBA101:30
fare anti-RepoGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)8D121:10
Keçi anti-tavşan Alexa546InvitrogenA110101:500
Keçi anti-fare Alexa488InvitrogenA110291:500
Keçi anti-guniea domuzu Alexa633InvitrogenA211051:500
Keçi anti-sıçan Alexa488InvitrogenA110061:500
Tablo 3: Malzeme ve
Ekipman Sinek KafesleriEl yapımı; Genesee Scientific CorporationUygulanamaz; Şişeler: 32-130; Önceden yapılmış kafes: 59-101Şeffaf dökme akrilik borunun (1 3/4 inç çapında) 400 rpm'de bileşik gönye testere ile 4 inç boyunda segmentler halinde kesilmesiyle yapılmıştır. Ultra ince paslanmaz çelik elek (küvetin bir ucuna akrilik bileşen yapıştırıcı ile tutturulmuştur. Boş bir sinek maması şişesi kullanan alternatif bir yöntem Drosophila Protokoller ISBN 0-87969-584-4'te bulunabilir. Kafesler ayrıca Genesee Scientific Corporation'dan da satın alınabilir.
Sonikatör: Branson 250 Dijital SonifierBransonModel: Branson Dijital Sonifier 250
Sonikatör probuBransonModel #: 102C (CE)EDP: 101-135-066; S / N: OBU06064658
Şırınga filtresiNalgene190-25-200.2 & mu; m selüloz, asetat membran filtre
Görüntüleme sistemi: Multikromatik ışık kaynağı, dijital CCD kamera ve görüntüleme yazılımı ile dönen diskli konfokal mikroskopMikroskop: Olympus, Işık kaynağı: Lümen Dinamiği, Kamera: Q-Görüntüleme, Görüntüleme Yazılımı: Intelligent Imaging Inc.Mikroskop: DSU eğirme diski ile donatılmış BX51, Işık kaynağı: X-Cite 120Q, Kamera: RETIGA-SRV, Görüntüleme Yazılımı: Slidebook 5.0
Vakum filtre ünitesiNalgene450-00200.2 & mu; M Selüloz Nitrat Membran Filtre
10 :

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
  2. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
  3. Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
  4. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
  5. Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
  6. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
  7. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
  8. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
  9. Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
  10. Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
  11. DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
  12. Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
  13. Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
  14. Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  15. Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
  16. Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
  17. Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
  18. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45(2011).
  19. Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
  20. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
  21. Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202(2011).
  22. Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
  23. Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
  24. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  25. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
  26. Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
  27. Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
  28. Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
  29. Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
  30. Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sonikasyon mm nofloresansFloresan MikroskobuAntikor PenetrasyonuK tikula Uzakla t rmaNumune FiksasyonuBirincil Antikorlarkincil AntikorlarKonfokal MikroskopiDoku Montaj

İlgili makaleler