Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

14.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51542

⸱

20 Ağustos 2014

 ,  ,  , 
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

Bu makalede

Özet

Optik cımbız, tek tek molekülleri 5' ve 3' uçlarından gererek RNA katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Burada, cımbızlama için RNA moleküllerini sentezlemek, aletin kalibrasyonu ve tek molekülleri manipüle etmek için yöntemler için yaygın prosedürler açıklanmaktadır.

Özet

İnsan genomunun büyük bir kısmı kopyalanmış fakat tercüme değildir. Bu Mesaja genomik çağda, RNA düzenleyici işlevleri giderek daha önemli olduğu gösterilmiştir. RNA işlevi çoğu zaman alternatif yapılarını benimsemek yeteneğine bağlıdır olarak, sırayla doğrudan RNA üç boyutlu yapılarını tahmin etmek zordur. Tek molekül bir seferde moleküler yapılarla bir molekül izleyerek RNA yapısal polimorfizmi sorunu çözmek için gösteri potansiyelleri yaklaşır. Bu çalışma, tam optik cımbız kullanarak tek RNA moleküllerinin, katlanma ve yapının manipüle etmek için bir yöntem sunmaktadır. İlk olarak, yöntemler tek moleküllü mekanik iş için uygun moleküller tanımlanmıştır sentezlenmesi için. Optik cımbız düzgün işlemleri sağlamak yanında, çeşitli kalibrasyon prosedürleri tartışılmıştır. Daha sonra, çeşitli deneyler açıklanmıştır. Tekniğin yararlılığını göstermek için, mekanik olarak saç tokası RNA açılımı sonuçlarını ve bir tek RNA öpmeyeceğing karmaşık delil olarak kullanılır. Bu örneklerde, bağımsız bir şekilde nanomanipulation tekniği, ikinci ve üçüncü dahil olmak üzere her yapısal etki katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Son olarak, sınırlamalar ve yöntemin gelecekteki uygulamalar tartışılmaktadır.

Giriş

Optik cımbız tekniğinin gelişmesi uzun biyolojik araştırma uygulaması ile eşlik etti. Optik yakalama etkisi ilk keşfedildiği zaman, Arthur Aşkın kirli suda bakteri lazer odak 1 sıkışan olamayacağı görülmektedir. O zamandan beri, bakteri biyofizik öğrenci nesiller için bir kasıtsız, eğlenceli deney yanı sıra mikrobiyal fizyoloji 2,3 incelemek için ciddi bir araştırma aracı haline gelmiştir hapsi. Optik yakalama tekniği mikroskobik 1 nesne hareketsiz hale getirmek için odaklanmış bir lazer ışını kullanır. Pratik olarak, aynı zamanda, tutucu (koyup Dx) merkezinden yer değiştirmesi tarafından tuzağa nesne üzerinde bir kuvvet (F) ölçen bir optik yayı gibi bir lazer tuzak çalışır. Κ kısa bir aralıkta, F = κ x Dx, içindeki tuzak yay sabittir. Optik tuzak MICROS için picoNewton (PN), kesinlik kuvvet uygulamak için kullanılabilirCopic nesne ve nanometre (nm) doğrulukla konumunu ölçmek. Son yirmi yılda, optik cımbız biyofizik en çok kullanılan tek-molekül tekniklerinden biri haline gelmiştir. Tekniği katlama ve DNA 4-6, RNA 7-9 ve proteinlerin 10,11 mekaniğini incelemek için istihdam edilmiştir. Optik cımbız da DNA replikasyonunu 12 RNA transkripsiyonu 13, 14,15 ve protein sentezi, hem de diğer birçok biyomoleküler bir etkinlik 16-18 gözlemlemek için kullanılmıştır.

Tek molekül yaklaşımlar esas RNA engebeli katlama enerji manzara keşfetmek için RNA yapısal araştırma istihdam edilmektedir. Bir RNA dizisi nedeniyle genellikle RNA basit kimyasal bileşimi ve baz soyma kurallarına, birden fazla istikrarlı, birbirini dışlayan yapılar içine kat edebilirsiniz. Uzun RNA yapısal polimorfizm, bu riboswitches 19,20 meydana gelir, örneğin, gen regülasyonunda önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bir recent genom anket birkaç derece büyük ölçüde hücresel transcriptome 21 büyük bir kısmının yapısı ve protein sentezini etkileyen kadar küçük ki sıcaklık değişimlerini ortaya koymuştur. Bu örnek, daha önce tahmin edilenden daha alternatif RNA katlama biyolojik rolü belki de daha önemli ve yaygın olduğunu ipuçları. Yapısal polimorfizm, ancak birçok moleküllerinin ortalama özelliklerini incelemek geleneksel biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlar için bir sorun teşkil etmektedir. Örneğin, "üzerinde" bir riboswitch bir "kapalı" konformasyonlar bağdaşmıyor. Heterojen bir yapı elde edilen bir ortalama yapısı biyolojik ilgili şekillerin ya da benzer olası değildir. Ayrıca, çevrilmemiş RNA ve mRNA genellikle yapılar oluştururlar. Proteinler ve düzenleyici RNA'lar ile etkileşimi yaygın etkileşimin bir parçası olarak mevcut yapının açığa çıkmasını gerektirir. Bu nedenle, RNA açılma / yeniden katlanmasını okuyan bir ilgili olurRNA biyoloji sorunu. Böyle bir sorun karşılamak için, tek-molekül yaklaşımı bir anda 22-27 az bir molekül okuyan RNA yapısal polimorfizmini çözülmeye istihdam edilmiştir.

Popüler tek molekül fluoresans yöntemiyle karşılaştırıldığında, açılma mekanik göre cımbız tek tek moleküller konformasyonları uygulanan kuvveti ile manipüle edilebilir ve nanometre hassasiyetle ölçülebilir bir avantaj sağlar. Bu özellik, büyük nanomanipulation RNA hiyerarşik katlama 28 kesilmiş olabilir, bireysel yapısal alanın açılma / katlanır izlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, bir tek elyaf birçok konformerlerin birine katlanmasına yönelik olabilir; veya mevcut yapıya mekanik olarak farklı bir konformasyona 29 içine yeniden kapatmak için indüklenebilir. Biyolojik şartlar altında, bir RNA yapısı sıcaklık değişimi veya ligand bağlanması üzerine değiştirilebilir. Doğrudan manipüle moleküler s yeteneğikırılmalardan RNA yapısal çalışmanın yeni bir mekan açılıyor. Prensip olarak, böyle bir atomik kuvvet mikroskopu ve manyetik cımbızlar gibi diğer mekanik teknikler de, tek RNA moleküllerinin katlanmasını incelemek için kullanılabilir. Ancak bu gibi uygulamalar, nispeten düşük uzaysal çözünürlüğü 30 büyük ölçüde sınırlıdır.

Optik cımbız iş RNA yapılarının mekanik güç ile katlanmamış sağlar.

Açılımı mekanik avantajı birkaç yönlüdür. Metal iyonları ve ligand uyarılmış katlama ağırlıklı üçüncül yapıları ile sınırlıdır, oysa Kuvvet, ikincil ve üçüncül yapıların her ikisinin de açılmak için kullanılabilir. Sıcaklık ve denatüran önemli ölçüde su ve çözünenlerin faaliyetlerini etkileyebilir. Buna karşılık, kuvvet moleküler yapılarını perturb lokal olarak uygulanır; çevresini üzerine uygulanan kuvvet etkisi ihmal edilebilir düzeydedir. Buna ek olarak, termal erime en küçük RNA yapılarını katlama termodinamik çalışma için kullanılır,optik cımbız yedi temel-çift tetraloop firkete 28 ikinci bir 400-nükleotid ribozim 31 kadar farklı boyutlarda RNA yapılarının incelenmesi için kullanılmıştır gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, RNA yapıları mekanik mezofilik sıcaklıklarda açılabilirler. Buna karşılık, bir termal erime deneyde RNA açılmak için, sıcaklık tipik olarak daha da önemli olarak, özellikle Mg +2 iyonlarının mevcudiyetinde, RNA, hidroliz artar fizyolojik sıcaklıklarda, üzerinde yükseltilir.

Bu kuvvet, bir mekanik etki yapısına tatbik edilir nasıl bağlı olduğunu not etmek önemlidir. Uygulanan kuvvet katlanan enerji manzara tenteli. Örneğin, saç tokası, bir kuvvet uygulandığında, baz çiftleri, sırasıyla, bir zaman (Şekil 1a) bir tane kırılır. Kopyalama çatal uygulanan kuvvete dik helezon ekseni boyunca ilerler. En az bir öpüşme karmaşık bir gerilim altında Bunun tersine, iki öpüşmeUygulanan kuvvet paralel olan baz çifti, bir güç yük paylaşımı (Şekil 1b). İkincil ve üçüncül katlama 28,32 ayırt etmek için kullanılabilir bunların farklı mekanik karşılık olarak uygulanan kuvvet sonucu firketenin ve öpüşme karmaşık ilişkide tutulur, dolayısıyla farklı geometriler. Açılımı mekanik teorik yönü önceden 8,9,30 gözden geçirilmiştir. Bu çalışma kurmak ve bir tek molekül mekanik açılımı analizini gerçekleştirmek için temel yaklaşımları özetliyor.

Deneysel Kurulumu. Bizim mekanik çekme deneyinde, tweezing için RNA numunesi iki çift bükümlü DNA / RNA kolları tarafından sınırlanan, ilgi konusu RNA (Şekil 2) oluşur 7. Tüm molekül sırasıyla streptavidin- biotin ve digoksijenin anti-digoksijenin antikor etkileşimleri, üzerinden iki yüzey kaplı mikron boyutunda boncuk (Spherotech) gergin olabilir. Bir boncuk bir kuvvet ölçme optik tr tarafından düzenlenenAP, diğer ise, bir mikropipet ucunda tutulur. Halkalar arasında göreceli mesafe tutucu direksiyon veya mikropipet ile hareket ya da değiştirilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, tek bir alana sıkıştırılmış boncuklar RNA molekülü gerilip serbest edilebilir.

Numune hazırlanması. Tweezing için RNA örneklerinin sentezi birkaç adımları içerir (Şekil 3) içerir. İlk olarak ilgili RNA'ya karşılık gelen DNA sekansı ilk olarak plazmid vektörüne klonlanır. Daha sonra, üç PCR reaksiyonu, iki kolları ve transkripsiyon için bir şablon üretmek için kullanılmaktadır. Transkripsiyon şablon sap bölümleri ve eklenen dizileri de kapsamına almaktadır. Tam uzunlukta RNA, in vitro transkripsiyon kullanılarak sentezlenir. Son olarak, RNA ve kimyasal olarak modifiye edilmiş kolları tweezing için molekülleri oluşturmak için bir araya tavlanır.

Kalibrasyon ve Cımbızlar Operasyonu. Minitweezers kullanımının temel tasarımBu çalışmada d ki çift-ışın optik cımbız 33 izler. İlk nesil optik cımbız ile karşılaştırıldığında pek iyileştirmelerle, Minitweezers olağanüstü dengeye sahiptirler. Birkaç ülkede araştırma grubu bir tek-molekül araştırmalarına 14,15,34-37 olarak Minitweezers kullanın. Talimat videolar dahil olmak üzere cihazın, inşaat, kalibrasyon ve operasyon bilgilerini, "Cımbız Lab" sitesinde (http://tweezerslab.unipr.it) mevcuttur. Burada, günlük bazda yapılması gereken iyileştirmeler ve kalibrasyon işlemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tek moleküllü tweezing için RNA moleküllerinin hazırlanması 1.

  1. Ilgi duyulan dizilimi klonlanması. Bir vektör, RNA yapıya tekabül eden DNA dizisini Clone.
  2. Sentez ve transkripsiyon şablon saflaştırılması. PCR ile bir transkripsiyon şablonu sentezlemek. [Burada yer Tablo 1] Şimdi, bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünlerinin saflaştırılması ve> 200 ng / ul örnek konsantre edilir. Saflaştırılmış DNA, transkripsiyonu için kullanıldığı için, RNazsız su yıkama ve konsantrasyon adımları kullanılmalıdır.
  3. In vitro transkripsiyonu ile. RNA, verimi maksimize etmek için gece boyunca 37 ° C'de in vitro transkripsiyon RNA sentez. Transkripsiyondan sonra [burada yer tablo 2], I, 37 ° C'de 15 dakika boyunca DNA şablonu sindirimi 1 ul DNase ekleyin. Bir silis kolonu kullanılarak eğirme RNA'yı saflaştırmak.
  4. Biyotinile edilmiş kol sentezi A. Üretim, astar Af ve Ar ve konsantre kullanılarak PCR ile modifiye edilmemiş kol imaliAmplifiye DNA> 200 ng / | il için entrate. Daha sonra, bir primer uzatma reaksiyonu kullanılarak PCR ürünü içine biyotin modifikasyonlar. [Yer tablo burada 3] Not: biyotinile edilmiş bir kolu (biyotin-HA) saflaştırılmadan doğrudan tavlama kullanılabilir. Biyotin-HA RNA ile tavlanmış edilmesi olduğu için, her iki adımda RNazsız su kullanımı için çok önemlidir.
  5. Digoksigenin modifiye sapın B. Sentez Sentez astar Bf ve digoksigenin-modifiye oligo Dig-Br (Şekil 3) kullanılarak PCR ile kolu B (kazı-HB) modifiye Digoxigenin. Daha sonra, PCR ürünü saflaştırmak ve> 200 ng / ul örnek konsantre edilir.
  6. Kolları için tavlama RNA. Kulplu RNA tavlamak. [Burada yer Tablo 4 ve 5]
  7. Tavlı örnek arındırın. Tavlanmış numunenin 3 hacim etanol ekleyin ve iyice karıştırın. En az 1 saat boyunca -70 ° C'de saklayın karışımı. 15,800 xg'de Spin ve süpernatant atın. Bir toz haline kullanılarak topak ile kurutun. Pelet çözülür100 ul RNazsız su. Not: Örnek kullanılmaya hazırdır ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

Optik Cımbızlar 2. Kalibrasyon ve Operasyon

  1. Video Monitörü Piksel Boyutu kalibre
    1. Tuzak bilinen çapı (boyut standart) ile bir boncuk optik tuzak kullanın.
    2. Görüntüleme yazılımı kullanarak bir tuzak boncuk Yakalama görüntüleri (Şekil 4).
    3. Ağırlık merkezi yöntemine göre görüntüleme yazılımı kullanılarak kordonun çapı belirlenir.
    4. Farklı boyutta boncukların çapları belirlemek için bu işlemi tekrarlayın.
    5. Bir pikselin fiziksel boyutunu elde etmek üzere doğrusal regresyon ile boncukların ölçülür ve bilinen çapları takın.
  2. Mesafe Kalibrasyon doğrulayın
    1. Tuzak bir boncuk optik tuzak kullanın.
    2. Görüntü yakalama yazılımı tarafından sentroid piksel konumunu belirlemek ve Minitweezers kullanarak konumunu kaydedin.
    3. Diffe için boncuk Steer pozisyonları kira ve pozisyon tayinini tekrarlayın.
    4. Kalibre piksel boyutunu kullanarak m birimine piksel boncuk, X ve Y konumlarını dönüştürün.
    5. Video ile ve Minitweezers tarafından ölçülen pozisyonları arasındaki X ve Y karşılaştırın. Değerleri iki grup anlaşmalıdır. Görüntü çözünürlüğü> 0.1 mikron olduğu, doğruluğunu sağlamak için ölçümler arasındaki 1 mikron üzerinde boncuk hareket. Mesafe kalibrasyon Minitweezers saklanan bir karşılaştırılabilir değilse, aleti kalibre edin.
  3. Tuzak Sertlik Kalibrasyon
    1. Optik tuzak kullanarak boncuk yakalamak ve hala tutun.
    2. 3 sn için bir oran> 5 kHz bir baypas hızlı veri toplama kullanarak tuzak kuvveti kaydedin.
    3. Yazılımını kullanarak boncuk hareket kaydından bir güç spektrumu oluşturmak. Lorentz (Şekil 5) 38 güç spektrumu Fit:
      542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Denk. 1)
      burada S (f) f frekans gücü, f c köşe sıklığı, ve S 0 asimptotik güçtür. Köşe frekansı, c, f termal hareketinin güç asimptotik değerinin yarısına düşmüştür sıklığıdır. F c lazer güç ve boncuk boyutuna göre değişir gibi, tek tek her bir tuzak boncuk kalibre.
    4. F c tuzak yay sabitini, κ, hesaplayın:
      figure-protocol-1 (Denk. 2)
      burada γ boncuk (Denk. 3) arasında sürtünme katsayısıdır. Kuvvet değişimi bir RNA uzantısı değişikliklerini saptamak için yay sabitini kullanın.
  4. Stokes Kanunu Testi
    1. Optik tuzak kullanarak bir boncuk yakalayın. -Geri kuvvet boncuğu taşı farklı hızlarda.
    2. Boncuk hareketlerini kaydetmek ve Minitweezers kullanarak zorlamak.
    3. Boncuk yarıçapını hesaplayın.
      Not: sürtünme kuvveti, F d, bir akışkan içinde bir parçacığın küresel hareketi tarafından üretilen Stokes hakları ile tarif edilebilir:
      figure-protocol-2 (Denk. 3)
      burada r kürenin çapı, v hız ve h referans tabloları bulunabilir, akışkan dinamik viskozitesidir. F d olarak ölçülen kuvvet kullanarak, kordonun uzunluğu Denklem kullanılarak hesaplanabilir. 3 (Şekil 6) ve görüntü alma yazılımı tarafından belirlenen bu kabul edilmelidir. Stokes yasası testi etkili bir genel kalibrasyon ve aracın performansını test eder.

Tek bir RNA molekülünün 3. Nanomanipulation

  1. Fluidics yapma.
    1. No 2 kapak camı ile altı delik (2 mm çapında her biri) ile (Şekil 7) ve matkap (7b Şekil) bir lazer gravür kullanarak, çift taraflı bant poliimid üç tane yarık (2 mm kalınlığında) kesilir.
    2. Çift taraflı bant Kapton iki kat cam tabaka iki sandviç tarzı bir akış bölme yapın. Bant (Şekil 7c) arasında bir mikropipet ve iki baypas tüpleri yerleştirin.
    3. Akışkan delikleri (Şekil 7d) eşleştirerek bir metal çerçeve üzerine akış odasına monte edin.
    4. Polietilen boru donanımları (Şekil 7e) ile seçilen tampon ile doldurulmuş 10 ml 'lik şırıngaya bölmenin akışkan kanalları bağlayın.
    5. İki amaçları arasındaki optik cımbız üzerine tüm odasını monte edin. Akışkan kanalları bölmenin ön sağa baktığından emin olun. Objektif çekin ve t montaj delikleri çerçeve (Şekil 7e) içinde pirinç işaretçilerine fişidiye cımbız. Odacık konumunu düzeltmek için vidaları sıkın.
  2. Tavlanmış örnek ve boncuk Karıştırma. , Anti-digoksijenin kaplı boncuklar (DIG-boncuklar) ile tavlanmış örnek karıştırın ve karışım 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında kalmak sağlar. Tipik olarak, tavlanmış numunesinin 1 ul, 1 ml tampon içinde 5 ul Kazı-boncuklar ile karıştırılır. Not: boncukların miktarı, akış bölme içine yüklenecek boncukların makul bir miktar baypas boru teslim edilecek sağlamak için seçilmelidir. Tanelere tavlanmış numune oranı kolaylıkla tahmin edilemeyen. İdeal durumda, çoğu boncuk boncuk, sadece küçük bir bölümü boncuk başına sadece bir RNA molekülü olabilir öyle ki herhangi bir RNA sahiptir. Tavlanmış örnekler ve boncuk süspansiyonu ölçmek zor olduğu için, tek yolu, şu anda ve karışım oranını değiştirmek ve cımbız üzerindeki karışımın test etmektir.
  3. Mil üstüne, yani, (nolu akış odacığı içinde bir reaksiyon sitesi için birkaç mikrometreden boncuk sununcropipette ucu, Şekil 7C).
    1. 1 ml'lik bir şırınga içine streptavidin kaplı boncuklar (strep boncuklar) bir süspansiyonu yerleştirin.
    2. Akış odası (Şekil 7a) alt kanalına giden akışkan borusuna enjektörü.
    3. Odasına strep boncuk akmasına şırınga itin.
    4. Alt baypas borusunun (Şekil 7b) bir açıklığın yakınında optik tuzağı motor kontrol yazılımı kullanılarak bütün bölmesini hareket ettirin. Sonra bir strep boncuk yakalamak için bir topunu ile optik tuzak çalışır.
    5. Motor kontrol yazılımı kullanılarak mikropipet ucuna yakın boncuk hareket ettirin.
    6. Mikropipet üzerine boncuk emmek için mikropipet bağlı şırıngayı çekin.
    7. Ekstra strep boncuk dışarı atılması için orta kanala şırınga basarak hafifçe akışını uygulayın.
    8. Benzer şekilde, numunenin karışımını odanın üst kanala kazı-boncuk (adım 3.2) sağlar.
    9. Bir kazı-boncuk yakalamak ve optik tuzak kullanarak strep boncuğa o yakın getirmek.
    10. Akışı uygulanmak suretiyle, orta kanal temizleyin. Not: strep- ve mikroskopik altında görsel olarak ayırt edilebilir, böylece boncuklar dig farklı boyutlarda olacak şekilde seçilir (Şekil 4).
  4. Balıkçılık "bir çift boncuk ile cepheye tek molekülü.
    1. Strep boncuk (Şekil 4) üzerine dikey olarak DIG-boncuk yerleştirin.
    2. Tuzak direksiyon aşağı strep boncuk doğru kazı-boncuk taşıyın. Kuvvet değişiklikleri görselleştirmek için bilgisayarda bir kuvvet-mesafe arsa penceresini açın.
    3. Iki boncuk temas üzerine, dikey olarak uzak strep topuk kazı-boncuk hareket eder.
    4. Belirli bir temas olursa, kuvvet, neredeyse sıfır kalır. İki molekül boncuklar ile bağlı, kuvvet önemli ölçüde artırır iki boncuk ayrıldığında. Genel olarak "balık" olarak anılacaktır Bu işlem, çoğu zaman perfboncuk her çift ormed birden çok kez etkili bir tek-molekül urgan bulmak için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Boşluk ile sınırlıdır, tek RNA moleküllerinin nanomanipulation mekanik olarak saç tokası RNA açılımı örnekleri ve üç boyutlu yapıya sahip bir RNA göstererek gösterilmiştir.

Tek Firkete Moleküller işleyin

Bir ip boncuk arasına kurulduğunda, halata bağlı uzantısı ve kuvvet bir kullanıcı tanımlı protokolü kullanılarak manipüle edilebilir. Dört ortak manipülasyon protokolleri yaygın olarak kullanılmaktadır.

Kuvvet-ram...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tweezing Örnekleri Hazırlanmasında Modifikasyonu ve Sorun Giderme

Klonlama Vektör seçimi. Burada tarif edilen genel şema (Şekil 3), özel bir klonlama vektörü gerektirmese de, vektör, bir promotör istenilen pozisyonlarda durmasıyla PCR yoluyla dahil edilebilir şekilde transkripsiyonun kolaylığı için içsel T7 veya T3 için tercih edilmemektedir.

Dizi ve Kolları Uzunlukları. Kolları için özel dizi gereksinim y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, bir NSF hibesi (MCB-1054449) ve Albany Üniversitesi'ndeki RNA Enstitüsü'nden PTXL'ye işbirlikçi disiplinler arası Pilot Araştırma Programı ödülü ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MinitweezersSteven B. Smith Engineeringhttp://tweezerslab.unipr.it
Veri toplama kartıNational InstrumentsUSB-6351
Ekran kartıNational InstrumentsPCI-1407
Labview programlama yazılımıNational Instruments
NI Vision BuilderUlusal Aletler
Lazer gravür makinesiEpilogue lazer sistemleriZing-16
PCR arıtma kitiQiagen28104
MEGAscript T7 kitiYaşam TeknolojileriAM1334
MEGAclear kitiYaşam TeknolojileriAM1908
Biotin-11-UTPThermo Fisher
T4 DNA polimerazNew England LabsM0203
Streptavidin kaplı mikroküreSpherotechSVP-20-5
Antidigoxigenin kaplı mikroküreSpherotechDIGP-20-2
Boyut standart mikro kürelerSpherotechPPS-6K
Kapton bantKaptontape.comKPPTDE-1
2 numaralı kapak camıThermo Fisher12-543D
FERR0081

Kaynaklar

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101(2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624(2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

RNA KatlanmasıTek MolekülKuvvet UzatmasıRNA Saç TokasıBoncuk BağlamaAkış OdasıMekanik AçılmaTersiyer Yapı
Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.