Optik cımbız, tek tek molekülleri 5' ve 3' uçlarından gererek RNA katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Burada, cımbızlama için RNA moleküllerini sentezlemek, aletin kalibrasyonu ve tek molekülleri manipüle etmek için yöntemler için yaygın prosedürler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan genomunun büyük bir kısmı kopyalanmış fakat tercüme değildir. Bu Mesaja genomik çağda, RNA düzenleyici işlevleri giderek daha önemli olduğu gösterilmiştir. RNA işlevi çoğu zaman alternatif yapılarını benimsemek yeteneğine bağlıdır olarak, sırayla doğrudan RNA üç boyutlu yapılarını tahmin etmek zordur. Tek molekül bir seferde moleküler yapılarla bir molekül izleyerek RNA yapısal polimorfizmi sorunu çözmek için gösteri potansiyelleri yaklaşır. Bu çalışma, tam optik cımbız kullanarak tek RNA moleküllerinin, katlanma ve yapının manipüle etmek için bir yöntem sunmaktadır. İlk olarak, yöntemler tek moleküllü mekanik iş için uygun moleküller tanımlanmıştır sentezlenmesi için. Optik cımbız düzgün işlemleri sağlamak yanında, çeşitli kalibrasyon prosedürleri tartışılmıştır. Daha sonra, çeşitli deneyler açıklanmıştır. Tekniğin yararlılığını göstermek için, mekanik olarak saç tokası RNA açılımı sonuçlarını ve bir tek RNA öpmeyeceğing karmaşık delil olarak kullanılır. Bu örneklerde, bağımsız bir şekilde nanomanipulation tekniği, ikinci ve üçüncü dahil olmak üzere her yapısal etki katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Son olarak, sınırlamalar ve yöntemin gelecekteki uygulamalar tartışılmaktadır.
Giriş
Optik cımbız tekniğinin gelişmesi uzun biyolojik araştırma uygulaması ile eşlik etti. Optik yakalama etkisi ilk keşfedildiği zaman, Arthur Aşkın kirli suda bakteri lazer odak 1 sıkışan olamayacağı görülmektedir. O zamandan beri, bakteri biyofizik öğrenci nesiller için bir kasıtsız, eğlenceli deney yanı sıra mikrobiyal fizyoloji 2,3 incelemek için ciddi bir araştırma aracı haline gelmiştir hapsi. Optik yakalama tekniği mikroskobik 1 nesne hareketsiz hale getirmek için odaklanmış bir lazer ışını kullanır. Pratik olarak, aynı zamanda, tutucu (koyup Dx) merkezinden yer değiştirmesi tarafından tuzağa nesne üzerinde bir kuvvet ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tek moleküllü tweezing için RNA moleküllerinin hazırlanması 1.
- Ilgi duyulan dizilimi klonlanması. Bir vektör, RNA yapıya tekabül eden DNA dizisini Clone.
- Sentez ve transkripsiyon şablon saflaştırılması. PCR ile bir transkripsiyon şablonu sentezlemek. [Burada yer Tablo 1] Şimdi, bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünlerinin saflaştırılması ve> 200 ng / ul örnek konsantre edilir. Saflaştırılmış DNA, transkripsiyonu için kullanıldığı için, RNazsız su yıkama ve konsantrasyon adımları kullanılmalıdır.
- In vitro transkripsiyonu ile. RNA, verimi maksimize etmek için gece boyunca 37 ° C'de in vitro transkripsiyon RN....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Boşluk ile sınırlıdır, tek RNA moleküllerinin nanomanipulation mekanik olarak saç tokası RNA açılımı örnekleri ve üç boyutlu yapıya sahip bir RNA göstererek gösterilmiştir.
Tek Firkete Moleküller işleyin
Bir ip boncuk arasına kurulduğunda, halata bağlı uzantısı ve kuvvet bir kullanıcı tanımlı protokolü kullanılarak manipüle edilebilir. Dört ortak manipülasyon protokolleri yaygın olarak kullanılmaktadır.
Kuvvet-ram.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tweezing Örnekleri Hazırlanmasında Modifikasyonu ve Sorun Giderme
Klonlama Vektör seçimi. Burada tarif edilen genel şema (Şekil 3), özel bir klonlama vektörü gerektirmese de, vektör, bir promotör istenilen pozisyonlarda durmasıyla PCR yoluyla dahil edilebilir şekilde transkripsiyonun kolaylığı için içsel T7 veya T3 için tercih edilmemektedir.
Dizi ve Kolları Uzunlukları. Kolları için özel dizi gereksinim y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, bir NSF hibesi (MCB-1054449) ve Albany Üniversitesi'ndeki RNA Enstitüsü'nden PTXL'ye işbirlikçi disiplinler arası Pilot Araştırma Programı ödülü ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
| Veri toplama kartı | National Instruments | USB-6351 | |
| Ekran kartı | National Instruments | PCI-1407 | |
| Labview programlama yazılımı | National Instruments | ||
| NI Vision Builder | Ulusal Aletler | ||
| Lazer gravür makinesi | Epilogue lazer sistemleri | Zing-16 | |
| PCR arıtma kiti | Qiagen | 28104 | |
| MEGAscript T7 kiti | Yaşam Teknolojileri | AM1334 | |
| MEGAclear kiti | Yaşam Teknolojileri | AM1908 | |
| Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | ||
| T4 DNA polimeraz | New England Labs | M0203 | |
| Streptavidin kaplı mikroküre | Spherotech | SVP-20-5 | |
| Antidigoxigenin kaplı mikroküre | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Boyut standart mikro küreler | Spherotech | PPS-6K | |
| Kapton bant | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
| 2 numaralı kapak camı | Thermo Fisher | 12-543D |
Kaynaklar
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
- Maier, B. Using la....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
