Burada iki boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri içinde olumlu sinyal bölgelerine atanan en uygun elips sıralama dayanan faiz analiz protokolünün yeni bir bölge gösterilmiştir. Bu algoritma kapsamlı az kullanıcı girişi ve önyargı ile fizyolojik Ca 2 + sinyalleri analiz müfettişleri sağlayabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre içi Ca 2 + sinyalleri sık floresan Ca 2 + göstergesi boyalar ve mikroskopi teknikleri ile incelenmiştir. Bununla birlikte, Ca 2 + görüntüleme de niceliksel veri analizi, zaman alıcı ve önyargı tabidir. Ilgi (ROI) algılama bölgeye dayalı otomatik sinyal analizi algoritmaları tek boyutlu çizgi tarama ölçümleri için uygulanan olmuştur, ama iki-boyutlu görüntü dizilerinin optimize kimlik ve İB'nin analizini entegre hiçbir geçerli algoritma yoktur. Burada, resim dizilerinin hızlı elde edilmesi ve ROI analizi için bir algoritma tarif edilmektedir. Bu elips optimum ROI yerleşimini belirlemek amacıyla gürültü filtre sinyallerine uygun kullanır, ve genlik, süre ve mekansal yayılma Ca 2 + sinyal parametrelerini hesaplar. Bu algoritma ImageJ (NIH) bir yazılım için serbestçe kullanılabilir eklenti olarak hayata geçirildi. Birlikte açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar için yazılmış analizi komut ile,Bu yaklaşım, deneysel çıktı hızlı istatistiksel analiz yapmak için yüksek kapasiteli bir boru hattı sağlar. Yazarlar bu analiz protokolün kullanımı fizyolojik Ca 2 + sinyal bir daha tam ve tarafsız karakterizasyonu yol açacağını göstermektedir.
Giriş
Ca 2 + molekülü ve sitozolik Ca 2 + düzeyleri yüksek regüle edilen sinyalizasyon bir yerde ikinci bir elçisidir. Hücre içi Ca 2 + sinyalleri karmaşık ve izole geçişlerini, salınımlar ve dalgalar 1 çoğaltım dahil - 4. Ca 2 + mekansal ve zamansal kontrol Fizyolojik sinyal özgüllüğünü altında yatan düşünce, ve bu nedenle Ca 2 + sinyal şekillerinin analizi birden fazla alanlarda 5 araştırmacılara büyük ilgi olduğunu.
Bu tür Flu-4 ve Fura-2 ile Ca 2 + göstergesi boyalar genel olarak 5-12 floresan mikroskobu ile hücre içi Ca2 + sinyalleri ölçmek için kullanılır. 16 - Genellikle, geçici Ca 2 + sinyalleri zamana bağımlı kullanıcı tanımlı bir alanda ortalama floresan değişiklikler, ya da ilgi bölgesi (ROI) 5,6,13 olarak değerlendirilir. Şu anda, manuel ROI analizi zaman alıcı ve emek hem de bir19 - birçok İB'leri belirlemek ve tekrarlayan hesaplamaları 17 gerçekleştirmek için kullanıcılar gerektirir çünkü da oldukça kapsamlıdır. Bu teknikler aynı zamanda yapay sinyal modları ve düşük genlikli veya yaygın sinyallerinin 18,20 dışlanma tanıtımı dahil olmak üzere, önemli kullanıcı hatası tabi olabilir.
, Otomatik ROI algılama algoritmaları önceden optimum ROI yerleşimi belirlemek için istatistiksel yaklaşımlar çeşitli kullanarak uygulanan olmuştur, ama genellikle çizgi tarama ya da sözde-line zaman 17 tek bir mekansal boyut analizi kısıtlar tarama görüntüleri analiz sınırlı olmuştur 19-22. Ayrıca, birçok mevcut algoritmaları Ca periyodik, lokalize transientler dan yayılan dalgalar 23,24 aralığında 2 + serbest olaylar çeşitliliğini kapsayacak şekilde yeterli değildir. Fizyolojik Ca 2 + sinyalleri kapsamlı değerlendirme genellikle daha önemli görüntü artif varlığı ile komplikebirçok deneysel sistemlerde gürültü ayrımcılığa sinyalini karıştıran hareket.
Daha önce, Ca otomatik ROI algılama algoritması çözüm 2 + (Sağlık, Bethesda, MD National Institutes), gelişmiş ve 25,26 valide NIH ImageJ yazılım için bir eklenti olarak uygulanan geçici algılama sinyal. LC_Pro denilen Bu algoritma, iki-boyutlu zaman atlamalı görüntü dizileri Ca 2 + sinyal geçişlerini kapsayan İB'leri tanımlamak ve analiz etmek için tasarlanmıştır. İşte pratik bir deneysel protokol ve domuz koroner arter endotelyumda algoritmanın bir uygulama temsili gösteri kullanılabilir grafik çıktısı oluşturmak için açık kaynak istatistiksel işleme yazılım Ar kullanarak ek komutlar ile sağlanır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Gemi Diseksiyon ve Görüntüleme
- Martens ve diğ 27 de tarif edildiği gibi iç çocuk domuz Hasat doku. Bir polidimetilsiloksanın (PDMS) HEPES fizyolojik tuzlu su solüsyonu (PSS) tamponlu içeren alt diseksiyon çanak içine hasat domuz sağ ventrikülleri yerleştirin.
- Bir stereomikroskopta yardımıyla, incelemek ve çevre kardiyak doku katmanlarından damar segmentini kaldırarak forseps ve yaylı makas kullanılarak çevreleyen dokudan koroner arter (~ 8 mm uzunluk, 0.5 mm çap) sol ön inen bir bölümünü kaldırın. NOT: damar duvarı delmek değil dikkat edin.
- Diseksiyon çanak içine PDMS bloğu (1 x 0.5 x 0.5 cm) yerleştirin, ve alt iğnelemekle bir iğne kullanın. Mikro iğnelerin şekillendirme, oniki ~ 0.3 cm uzunluk kesimleri içine yaklaşık 40 mikron çaplı tungsten tel kesme ve çanak bu yerleştirin. Forseps kullanılarak, bir micropi ile blok damar segmentinin bir ucunu güvenlin.
- Dikkatle damar lümenine küçük yaylı makas yerleştirin ve tamamen açmak için geminin bir tarafında aşağı uzunlamasına kesilir. Endotel yukarıya açılan damar segmentini yönlendirin.
- Damar düz bir dikdörtgen oluşturur, öyle ki engellemek için açılan damar segmentinin sınırları güvence altına almak için, geri kalan mikro iğnelerin kullanın. NOT: Micropin üstleri 90 ° eğildi ve blok yüzeyi ile aynı hizada kadar takılmalıdır. Care gerilmeden olmadan damar hazırlık uzatmak için alınmalıdır; Nihai genişliği ~ başlangıç esnetilmemiş genişliğini 1.5x edilmelidir.
- 134 NaCl, KCl 6: a HEPES içinde pluronik (% 0.03) ile DMSO içinde çözülmüş Fluo-04:00 (10 uM) karıştırılarak Fluo-04:00 yükleme çözeltisi küçük bir hacmi (~ 1 ml) hazırlayın mM ihtiva eden PSS (tamponlu , 1 MgCİ, 10 HEPES, 10 glukoz) ve karanlıkta oda sıcaklığında yaklaşık 40 dakika boyunca yükleme çözeltisi içine bütün bir blok yerleştirin.
- Yükleme işleminden sonra, HEPES tamponlu blok yıkayın5-10 dakika için PSS.
- HEPES PSS'ye tamponlu içeren bir coverglass alt odasına 50-100 mikron kalınlığında ayırıcılar üzerine bloğunu monte edin. NOT: Metal pimler ayırıcılar olarak kullanılan ve damar segment aşağı bakacak ve aralıklarına değmiyor emin olabilir.
- Konfokal görüntüleme için donatılmış bir inverted mikroskop sahnede odasına yerleştirin ve endotel hücre tabakası üzerine odaklanır.
- ~ 3 20X büyütme dakika ve konfokal görüntü sırası aquisition yazılımını kullanarak saniyede ~ 8 kare hızı için bazal göreceli floresan yakalama zaman atlamalı görüntü dizileri.
- Bazal floresans kayıt ~ 3 dakika sonra, bir HEPES addtional 3 dakika için aynı tampon HEPES içinde PSS çözündürüldü, Madde P (100 pM) hacimle (~ 1 ml), ve bir kayıt ile PSS tamponlu çözelti değiştirin.
2.. Otomatik Analizi
- 8 bit, g konfokal toplama yazılımı floresan kalsiyum aktivitesinin görüntü dizisi (ler) RenderHiçbir ölçekli bilgi rayscale '. tif' formatındaki dosyalar.
- Açık ImageJ, dosya menüsünde 'açık' tıklayın ve ImageJ görüntü dizisi (ler) görüntülemek için explorer penceresinde uygun görüntü dizisini seçin.
- Görüntü sekans (lar) içinde faaliyet mekansal yayılma üst ve alt sınırları tahmin etmek için dikdörtgen ROI aracını kullanarak, uygun bir ROI çapı belirler. NOT: ortalama dikdörtgen çapı ROI çapı için uygun bir seçimdir.
- Bilgisayarın sabit sürücüsünde yeni bir klasör oluşturun ve klasörü dizine görüntü dizisi (s) ekleyebilirsiniz.
- ImageJ, 'Eklentiler' penceresini tıklayın, ardından analizi başlatmak için 'LC_Pro tıklayın.
- ROI çap değerini girin ve filtre eşik değerini (0.05 veya 0.01) seçin.
- 'Ilaç tedavisi' onay kutusunu tıklayın ve hemen önce ve sonra ilaç ilave edildi (saniye) zaman noktası değerleri girin.
- 'Tamam' düğmesini tıklayın vedosya gezgini penceresine görüntü dizisi dizini girin.
3.. Grafik Çıktı
- Den R sürüm 3.0.2 indir http://www.r-project.org/ .
- R. 32 bit sürümünü açın
- "Dosya", daha sonra 'açık komut tıklayın ve grafiksel deney raporları oluşturmak için' traceplot.R 'R komut seçin.
- 'Paketler' seçerek kalibre ve gplots paketleri yüklemek, 'paketleri yüklemek', ve uygun sistemlerin paketleri seçerek.
- 'Change directory' komutu ardından, 'dosya' tıklayın ve LC_Pro analiz çıkışına karşılık dizini seçmek için kaşif penceresini kullanın.
- Komut penceresinde tıklatın ve sonra da 'çalışan tüm' komut dosyasını çalıştırmak için komut.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Özel bir algoritma, LC_Pro, gelişmiş ve Ca otomatik analizini gerçekleştirmek amacıyla hayata geçirildi konfokal görüntü dizileri üzerinde 2 + dinamikleri. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, algoritma A) algılar ve dinamik Ca parça siteleri ardışık işleme modülleri kullanır 2 + <0.01), gürültü, B) aktif bölge merkezlerinde otomatik olarak (ROI) bölgeleri tanımlar ve istatistiksel (p yukarıda değiştirmek C) Belirli bir olay parametreleri belirlemek için ROI'ler ortalama flore...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücresel ve çok hücreli düzeyde karmaşık Ca 2 + sinyalleri çözme titiz deneysel ve analitik yaklaşımlar gerektirir. Burada, bir yaklaşım Ca 2 + bağımlı floresans çözülmesi konfokal resim dizileri sunulan spesifik durumda sağlam hücre alanları içinde istatistiksel olarak ilgili Ca 2 + sinyalleri tespit eder ve miktarını belirler otomatik analizine tabi tutulur ve bu süre de açıklanan, bir arter kademeli bir izole edildi domuz kalbinden, tutturulmuş konfokal görüntüleme tabi Ca 2 +
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen Sağlık Hibeler HL-085.887, HL-092.992, S10RR027535 ve MOP-93.676.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Diseksiyon kabı | Fisher Sci | #08-772-70 | |
| Polidimetilsiloksan (PDMS) | Fisher Sci | #NC9644388 | elastomer kiti, tabaklara kalıplanmalıdır |
| HEPES tamponlu PSS | Sigma | #H3375-250G | HEPES asit |
| Stereomikroskop | Nikon Inst. | ||
| Forseps | Güzel Bilim Araçları | # 11223-20 | |
| Bahar makası | Güzel Bilim Araçları | 15003-08 | |
| Tungsten tel | Bilimsel Inst Svcs | # 406 | |
| Fluo-4 | Yaşam Teknolojisi. | #F-14201 | |
| Pluronic F-127 | Yaşam Teknolojisi | ||
| Metal pimler | Güzel Bilim Araçları | # 26002-10 | |
| Kapaklı cam alt hazne | Özel tasarlanmış | ||
| Eğirme diski konfokal mikroskop | Perkin Elmer | RS-3 | |
| ImageJ software | download: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | ||
| imageJ | şu adresten indirin: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html | ||
| R software | download: http://www.r-project.org/ | ||
| R traceplot script | download: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing |
Kaynaklar
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Berridge, M. J., et al. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Delisle, S. The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes. Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).
- Dupont, G., et al. Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level. Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).
- Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, (2009).
- Hong, J. H., et al. Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes. PloS One. 5 (3), (2010).
- Kuga, N., et al. Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo. J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).
- Mumtaz, S., et al. The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries. Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).
- Paredes, R. M., et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Silei, V., et al. Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green. Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).
- Simpson, A. M. Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations. Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).
- Gaspers, L. D., Thomas, A. P. Calcium signaling in liver. Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).
- Hellman, B., et al. Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells. Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).
- Kansui, Y., et al. Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries. Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).
- Tatsumi, H., et al. Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2. Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).
- Lorenz, J. J., et al. Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images. J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).
- Mukamel, E. A., et al. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Reidl, J., et al. Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains. Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).
- Wegner, F., et al. Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform. Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).
- Cheng, H., et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method. Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).
- Picht, E., et al. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).
- Abramoff, M. D., et al. Image processing with ImageJ. Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).
- Francis, M., et al. Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).
- Qian, X., et al. Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).
- Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
- Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
