Fare Embriyonik kök hücrelerden Mühendislik Sinir Dokular için Poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate)

Özet

Poli (gliserol-dodekanoat) adında yeni bir biyolojik polimerden bir yeni tasarlanmış toplayıcı aracılığıyla daha geniş bir alanı kapsayan mevduat electrospun uzun liflerin (PGD) Sentezi ve fabrikasyon bildirildi. Lifler fare pluripotent kök hücrelerinden türetilen hücrelerin büyümesini desteklemek mümkün.

Özet

Doku mühendisliği uygulamaları için, biyo-bozunabilir ve biyo-uyumlu iskeleleri hazırlanması en çok arzu edilen, ancak zor bir iştir. Çeşitli üretim yöntemleri arasında elektro sadeliği ve çok yönlülüğü dolayı en ilgi çekici biridir. Buna ek olarak, electrospun nanolifler hücre hayatta kalması ve büyümesi için ek destek sağlanması doğal hücre-dışı matrisin boyutu taklit. Bu çalışma Elektrospinning için, yeni tasarlanmış toplayıcı kullanılarak poli (gliserol-dodekanoat) adlı yeni bir biyo-bozunabilir ve biyo-uyumlu polimer için daha büyük bir alan depozito (PGD) ¹ yayılan uzun liflerin üretim canlılığı gösterdi. PGD ​​böylece sinir doku mühendisliği uygulamaları için uygun olan, sinir dokularının benzer mekanik özelliklere sahip eşsiz bir elastik özellikleri sergiler. Lifli iskele malzemeleri yapmak için sentez ve üretim set-up, basit ve yüksek tekrarlanabilir ve ucuz. Biyouyumluluktakitest, fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen hücreler uygun ve electrospun PGD lifleri üzerinde artabilir. Özet olarak, bu protokol, fare embriyonik kök hücre kaynaklı sinir soy hücrelerinin gelişimini desteklemek için PGD electrospun liflerin imalatı için çok yönlü bir üretim yöntemi sağlanmaktadır.

Giriş

Elektrospinning mikro-to-nanometre boyutlu yapı iskelesi fiber üretmek için etkili bir işlem yöntemlerden biridir. Elektrospinning temel prensibi iğnenin ucu ve bir kolektörü topraklanmış arasında yüksek voltaj uygulayarak bir iğne deliğinin tutulduğu bir solüsyon Taylor koni içerir. Çözelti içindeki elektrostatik itme yüzey gerilimini aştığında, yüklü bir sıvı jet iğne ucu dışarı atılır, çözücü buharlaştırma ile havada hareket ve son olarak topraklı toplayıcı üzerine yatırılır. Şırınga pompası, püskürtme memesinden çıkan sürekli bir solüsyon akışı sağlar ve electrospun elyafların bu şekilde birden fazla kopyası kısa bir süre içinde imal edilebilir. Toplayıcı varmak için meme çıkış seyri sırasında yüklü jet polimer çözeltisinin viskozite ve yüzey gerilimi içerir parametreleri, electrostati bir dizi uygun olarak uzanan ve çırpma uğrayacakc çözelti içinde kuvvet ve dış elektrik alanının etkileşimi, vb ^2..

Elektro işleminde, toplayıcı mikro-to-nanometre lifler biriktirilen bir iletken alt-tabaka olarak hizmet eder. Bu çalışmada, fiber toplayıcı yeni bir tür arzu edilen boyutu (uzunluk x genişlik) olan bir lif elde etmek için paspaslar tasarlanmıştır. Geleneksel olarak, alüminyum folyo, bir toplayıcı olarak kullanılan ama başka bir alt-tabaka için, düz bir yüzeye lifleri transfer etmek güçtür. Geleneksel toplayıcı sağlam bir fiber mat hasat zorluğu nedeniyle electrospun lifler toplayıcı yüzeyine güçlü bir şekilde bağlamak olmasından kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, dikdörtgen bir şerit halinde bir alüminyum folyo parçası katlanır ve düz metal plakasına dikey takarak toplayıcı değiştirilebilir. Electrospun lifler şeridin ucu ve kolay bir substratı transfer edilebilir metal plaka arasındaki alanı boyunca gerilire.

Termal çapraz elastomerik polimerlerde ilgi hızla çünkü poli (gliserol sebasat) (PGS), 2002 ³ vulkanize kauçuk benzer. PGS benzer bir polyester tanıttı Robert Langer grubunun öncü çalışmalar büyüyen, başarıyla geliştirdik edilir poli (gliserol-dodekanoat) (PGD) gliserol ve dodekandioik asitin termal yoğunlaşması ile ve eşsiz şekil hafıza özelliğine ^1. gösterdi. Sert sentetik malzemeler, poli (hidroksi bütirat) ya da poli (L-laktid) (sırasıyla, 250 Mpa ve 660 MPa arasında Young modülleri) farklı olarak, PGD, sıcaklık 37 ° üzerinde 1.08 MPa arasında bir Young modülüne sahip, kauçuk gibi elastomer cinsi bir özellik arzetmektedir in-situ periferik sinir (0.45 MPa) yakın bir maç olduğunu C,. Ek olarak, PGD biyolojik olarak parçalanabilir ve bozunma süresi gliserol ve dodekandioik asit oranının değiştirilmesiyle ince ayarlı olabilir. Dodekandioik asit oniki-karbon subiki terminal karboksilik gruplar, HOOC _{(CH2) 10} COOH ile duruş. Sebasik asit ve dodekandioik asit gibi dikarbonik asitler, çift sayılı bir asetil CoA-ve trikarboksilik asit (TCA) / (sitrik asit) döngüsü girmek için metabolize edilebilir. Dikarboksilik asitlerin metabolik ürünü, süksinil-CoA, bir ön-madde gluconeogenetic ve TCA döngüsü ⁴ arasında bir ara üründür. Bu nedenle, bazı çalışmalar özellikle patolojik koşullarda enteral ve parenteral beslenme için bir alternatif yakıt alt-tabaka olarak kullanılabilir önerdi. Cam geçiş sıcaklığı 31 ° C olduğu için ek olarak, PGD, böylece oda ısısında ve vücut ısısında farklı mekanik özelliklerini göstermektedir, benzersiz şekil bellek sergiler. Sonuç olarak, PGD sinir dokuları benzer mekanik özelliklere sahip eşsiz bir elastik özellikleri sergileyen, biyo-bozunabilir ve biyo-uyumlu; Bu nedenle, bu sinir doku mühendisliği uygulamaları için uygun bir malzemedir. Bu protokolde, electrospunbüyük bir mevduat alanı kapsayan uzun elyaf PGD gelen yeni tasarlanmış toplayıcı ile imal edilmiştir. Lif iskeleleri fare pluripotent kök hücreler büyüme ve farklılaşma destekleyebilir.

Protokol

1.. Elektrospinning Toplayıcı Kur

1. Dikdörtgen bir parça halinde alüminyum folyo kesilir.
2. Dikdörtgen bir şerit içine dikdörtgen parça katlayın, ve bant ile düz metal plaka (Şekil 1) dik takın. Not: fiber mat boyutu, şeridin uzunluğu ve genişliğine bağlıdır. Gerektiğinde Bu nedenle, şerit boyutlar ayarlanabilir.

2.. Polimer çözeltisinden Preparasyon

1. PGD ​​polimerin elde edilmesi için 100 saat boyunca 120 ° C de bir çanak içinde 1:1 mol oranında, gliserol ve dodekandioik asit (DDA) karıştırın.
2. Bir 15 ml tüp içinde 1.5:3:95.5 bir ağırlık oranında olan etanol içinde% 65 poli (etilen oksit) (PEO) ve jelatin çözülür, kapağını sıkmak ve karıştırma ile 1 saat boyunca 60 ° C'de bir fırın içinde karışımın ısısının Bir homojen çözelti (Basal çözelti) kadar ısıtılır.
3. Elektrospinning için, PGD polimer ve 04:06 ağırlık oranında bazal solüsyon karıştırın. Not: PGT konsantrasyonunun bi varg lif çapına etkisi. % 30 -50 oranında% PGD daha artan lif çapları 5 cm'den elyafların üretilmesi için kabul edilebilir.
4. Polimer çözeltisine% 0.1 riboflavin ekleyin ve iyice karıştırın.

3. Elektrospinning

1. Bir 18 G ile bir 5 ml şırıngaya standart polimer çözeltisi Besleme paslanmaz çelik bir iğne köreltilmiş.
2. Bir şırınga pompası içine şırınga yerleştirin.
3. Metal plaka ve iğne için, pozitif yüklü kurşun için yüksek voltajlı güç kaynağının topraklı kurşun takın.
4. 15 cm İğne ve alüminyum folyo şeridi arasındaki mesafe ayarlayın.
5. Şeridin ön liflerin birarada toplanmasını önlemek üzere yatay ile yaklaşık 15 ° 'lik bir açıda şırınga pompası yerleştirin.
6. Şırınga pompası açın ve 0.6 ml / saat için pompa akış hızını ayarlayın.
7. Yüksek gerilim güç kaynağı açın ve 14.6 kV işletme gerilimi ayarlayın.

4.Fiber İşleme

1. Toplama işlemi tamamlandıktan sonra, çapraz bağlama için 60 dakika boyunca UV ışığına maruz fiber mat.
2. Bir 100 mm Petri kabı alüminyum folyo şeritten elyaf mat transferi, ve sterilizasyon için 20 dakika için, UV ışığına maruz kalmaktadır.
3. Bir biyo-güvenlik kabini, bir cerrahi bıçak ile aynı büyüklükte yuvarlak parçalar halinde kesilmiş ve fiber mat, bir 24-yuvalı plaka içine parçaları yerleştirin.
4. Hücre ön tohum tedavisi için, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 ml fiber örnekleri bırakın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
5. Ertesi gün, aspirat PBS dikkatli bir şekilde, her bir oyuğa (Malzemeler tabloda tarif bakınız) farklılaştırma ortamının 1 ml (DMEM/F12, N2 ve FGF2) ekleyin ve 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
6. Aspire farklılaşma ortam dikkatlice, her elyaf numunesi için 0.2 ml Matrigel ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Not: Laminin da elyaf kaplama için kullanılabilir. 20 ug / ml laminin 0.2 ml ilave edilirElyafa ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
7. Dikkatle her kuyudan aşırı Matrigel kaldırın. Bir kez farklılaştırma ortamının 2 ml ile durulayın. Not: Elyaf örnekleri, hücre kültürü için hazırdır.

Elyaf üzerinde 5. Hücre Serpilmesi

1. MES hücre kültürü tabağına Accutase 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe
2. 10 dakika sonra, MES hücreler kültür kaplarına ayrılır. Plakasına farklılaştırma ortamının 4 ml ekleyin. Koloniler (yaklaşık 15x) kırmak için yukarı ve aşağı bir 15 ml tüp ve pipet hücrelerin içine yüzen MES hücreleri toplamak.
3. Farklılaştırma ortamının 4 ml 5 dakika ve yeniden askıya hücreleri için 400 x g'de santrifüjleyin.
4. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Bir 15 ml tüp içine hücre süspansiyonu 200 ul ve farklılaşma transfer ortam maddesi ile o 10x seyreltin. Yerine bir kapak-slip ile hemasitometre üzerinde bir bölmeye seyreltilmiş hücre süspansiyonu 15 ul aktarın. Saymak1 mm merkez meydanı ve mikroskop altında hemasitometre dört köşe kareler hücreler. Not: ml seyreltme faktörü x 10 ⁴ x kare başına ortalama sayısı = Hücre başına
5. Her bir kuyunun üzerine yaklaşık 5 x 10 ⁴ MES hücreleri yerleştirin. Yavaş yavaş lifli keçe kapalı boşalmasını önlemek için bir çözüm yerine, kuyunun tarafına kapalı kayma, elyaf numunelerinin üzerine orta hücre süspansiyonu bırakın.
6. Her bir oyuğa farklılaştırma ortamının 1 ml ilave edilir, ve 37 ° C'de bir inkübatör içinde tutmak ve plaka% 5 _CO2 hücreleri bağlanma, büyümesini ve farklılaşmasını sağlamak için.
7. Her bir oyuktan aspire edin ve eski orta her gün taze farklılaştırma ortamının 1 ml'si ile değiştirin.

6.. Hücre Canlılık

1. Her kuyudan aspire eski orta.
2. Kültür ortamı ile Resazurin floresan reaktifi 1/10 hacim ^th karıştırın ve de her biri 1 ml.
3. Inkubasyon37 ° C ve direkt ışıktan korunan 4 saat için% 5 _CO2 yedi.
4. 4 saat sonra, 96 oyuklu bir plakaya her bir ikinci reaktifi 100 ul 3x transferi ve daha sonra numuneler 560EX nm/590EM filtre ayarları kullanarak bir floresan spektrofotometre üzerinde ölçüldü hazırdır.

7. Real Time PCR

1. Kültür 14 gün sonra, numunelere lizis tampon eklemek ve elyaf numuneleri üzerinde hücrelerden toplam RNA'nın izole edilmesi.
2. Ters transkripsiyon ile 20 ul reaksiyon ölçeklerde cDNA'yı sentezlemek için toplam RNA 4 ul kullanın.
3. 10 ul ana karışım (2x), 0.2 ul boya, 8 ul nükleaz içermeyen su, 1 ul cDNA, 1 ul primer (Bu çalışmada kullanılan primerler Tablo 1 'de listelenmiştir): her bir optik tüp içinde PCR reaksiyon karışımı hazırlandı.
4. Bir: PCR programı kurmak. 95 ° C 2:20 min, 1 döngüsü b. 95 ° C 3 sn → 60 ° C 1 dakika, 40 döngü, c. 95 ° C 15 sn, 1 döngüsü d. 60 ° C 1dak, 1 döngü e. 95 ° C 15 saniye, 1 döngü. Göreceli gen ekspresyon düzeylerinin karşılaştırmalı C _T yöntemi seçin.
5. PCR tamamlandıktan sonra, StepOne yazılımı ile gerçek-zamanlı PCR sonuçlarını analiz ve Excel sonuçları ihracat.

Sonuçlar

Elektrospinning en önemli bileşenleri, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bir büyük boyutlu elyaf mat, genellikle dikey olarak bağlanmış alüminyum folyo şerit ve metal bir plaka elde edilmiştir. Şekil 2, bu kollektör tasarım ve elektro Fiber mat gösterir. Genişliği ve uzunluğu, farklı uygulamalar için ayarlanabilir. PGD ​​polimer ve bazal solüsyon karışımı ile yapılan elyafın uzunluğu 10 cm'dir. Electrospun Elyafların morfolojisi, Şekil 3 'de gösterilmiştir.% 40 PG...

Tartışma

Basit koleksiyoncular veya şu anda bazı uygulamalar için istenilen uzunluğa ve fiber mat boyutunu elde kısıtlamayı arttırır elektroeğirme için kullanılan toplayıcıları dönen karmaşıklığı sınırlamalar. Buna ek olarak, kültür çanağı ya da başka alt-tabakalar için, zemin toplayıcı elyafların aktarımı bir meydan okuma ^5'tir. Bu raporda, topraklı toplayıcı bir alüminyum folyo şeridi takılarak sadece yapılan yeni tasarlanmış koleksiyoncu, bir defada 20 cm 10 cm büyük boy fiber paspaslar kadar almayı başardı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gliserol	Sigma-Aldrich	G7757
Dodekandioik asit	Sigma-Aldrich	D1009
Jelatin	Sigma-Aldrich	D1890
Poli (etilen oksit) (PEO)	Sigma-Aldrich	182028
Riboflavin	Sigma-Aldrich	132350250	% 0.10
Fare embriyonik kök hücreleri	GlobalStem	GSC-5002
Matrigel	Becton Dickinson	356234
DMEM/F12	Thermo Scientific	SH30272.02
N2 takviyesi	Invitrogen	17502048	% 1
FGF2	Stemgent	03-0002	10 ng / ml
Accutase	Invitrogen	A11105-01
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Invitrogen	10010-031
Resazurin floresan boya	Sigma-Aldrich	62758-13-8
SV Toplam RNA İzolasyon Sistemi	Promega	Z3100
GoScript Ters Transkripsiyon Sistemi	Promega	A5000
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001
Şırınga pompası	Fisher scientific	14-831-200
Yüksek voltajlı güç kaynağı	Spellman High Voltage Electronics Corporation		SL30
UV ışığı	Philips	308643	15W/G15T8
Synergy HT Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu	BioTek
Perkin Elmer GeneAmp PCR Sistemi 9600	Perkin Elmer	8488
StepOne Gerçek Zamanlı PCR Sistemi	Uygulamalı Biyosistemler	4376357