Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Summary

Hücre dışı veziküller koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser ilaç uygulaması veya rejeneratif tıpta potansiyel terapötik maddeler dahil olmak üzere, fizyolojik ve patalojik sürece, önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokol ayarlanabilir direnç darbe algılama kullanarak çeşitli sıvıların izole ve izole olmayan hücre dışı veziküllerin miktar ve boyut karakterizasyonu için yöntemler sunar.

Abstract

'Microvesicles' ve 'eksozomlann' dahil Ekstrasellüler veziküller (AGH), vücut sıvıları oldukça bol. Yeni yıl AGH ilgi büyük bir artış tanık olduk. EVs koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser de dahil olmak üzere, çeşitli fizyolojik ve patolojik işlemlere, önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Buna ek olarak, AGH ilaç verme araçları olarak, örneğin bir ilaç olarak ya da rejeneratif, terapötik maddeler olarak potansiyele sahiptir. Çünkü kendi küçük boyutu (50 1,000 nm) doğru ölçümü ve AGH boyutu profil teknik açıdan zor.

Bu protokol qNano sistemi kullanılarak nasıl ayarlanabilir darbe dirençli algılama (tRPS) teknolojisini tarif EVs konsantrasyon ve boyutunu belirlemek için kullanılabilir. Nano ölçekli gözenek yoluyla transfer üzerine EVs saptanmasında kullanılır göre yöntem, nispeten hızlı bir küçük örnek hacimlerinin kullanılması yeterli ve pur gerektirmezification ve EVs konsantrasyonu. Alternatif bir yaklaşım kullanılarak açıklanmıştır normal çalışma protokolü aşağıdaki numuneleri, bilinen boyutları ve konsantrasyon polistiren boncuklar ile tutturuldu. Biyolojik akışkanlarda ölçümü sırasında doğrudan EV'lerini bir ayarlama tekniği teknik engellerin üstesinden gelmek için kullanılabilir Bu gerçek zamanlı karşılaştı.

Introduction

Hücresel kökenli kesecikler vücut sıvılarında ¹ oldukça bol. Bu sözde-dışı vezikülleri (EVS) (50 - 1000 nm boyutunda) hücre membranı ile çoklu vesiküler organların ikisi füzyonu veya hücre zarının doğrudan dışarı tomurcuklanma ile oluşturulmaktadır. Son yıllarda, AGH'ye bilimsel ilgi çok yeni fonksiyonlar ve EVs özellikleri tarif edilmektedir, ki ¹ EV odaklı yayınların bir bolluk ile sonuçlanan, artmıştır. AGH artık, sinyal iletimi, bağışıklık düzenlemesi, ve kan pıhtılaşmasının ^1-4 gibi fizyolojik ve patalojik sürece, geniş bir dizi dahil olmak inanılmaktadır. Kanserde, AGH premetastatik niş ^5,6, anjiyojenez ⁸ ön-kanserli içerik ^7,8 transferini ve uyarım oluşumunda rol oynamaktadır. Bunun yanı sıra, AGH terapötik ajanların ⁹ teslimi ajanlar olarak incelenmiştir.

Bu de rağmenyadaki gelişmeler, EVs güvenilir ölçümü zor kalır. Geleneksel olarak, dolaylı ölçüm yöntemleri toplam protein içeriğinin veya spesifik protein miktarının dayananlar kullanılır. Geniş kullanılmasına rağmen, bu teknikler protein başına EV farklar için hesap yoktur, ve AGH protein agrega ve proteinleri kirletici arasında ayrım yoktur. Ayrıca, bu teknikler çoğu durumda biyolojik numunelerde EV konsantrasyonlarının karşılaştırması yapmak imkansız hale EVs izolasyonunu gerektirir.

Bu nedenle, çabaları daha hassas ve doğrudan EV ölçümü için ¹⁰ yapılabildiği yeni yöntemler geliştirmek için yapılmaktadır. Bu rapor, güvenilir ölçümü ve AGH boyutu profil için ayarlanabilir rezistif darbe algılama (tRPS) kullanımını açıklar.

Şu anda, qNano alet (Şekil 1a) tRPS için piyasada bulunan tek bir platformdur. TRPS olarak, iletken olmayan bir elastik zar wi noktalamanano-boyutlu bir gözenek inci iki akışkan hücrelerini ayıran. Diğer hücre partikülsüz elektrolit ile doldurulur ise sıvı hücrelerinden biri, söz konusu numunesi ile dikkatle doldurulmuştur. Bir voltaj uygulanarak, bir iyonik akış / elektrik akımı gözenekten partiküllerinin transferi üzerine değiştirilmiş olan (Şekil 1b) kurulur. Bu akım blokajının ('dirençli darbe') büyüklüğü parçacık ¹¹ (Şekil 1c) hacmi ile doğru orantılıdır. Blokajı süresi örneğin yük ya da ¹² gibi şekil parçacık özellikleri üzerine dayanır partiküllerinin zeta-potansiyelini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bilinmeyen parçacık büyüklüğü profil bilinen bir çapa sahip taneciklerin kalibrasyon kaynaklanan direnç darbelerle hasardan kaynaklanan darbeleri dirençli karşılaştırılmasıyla yapılabilir. Blokajın olayın büyüklüğü yanı sıra, bu ortaya çıktığı oranı ölçülür. Bu sayım oran dinleriparçacık konsantrasyonuna es. Konsantrasyon ve ablukaya oranı bilinen konsantrasyon ve tanecik büyüklüğü ile tek bir kalibrasyon numune kullanılarak doğrusal olarak orantılı olduğu için ¹³ konsantrasyon ¹⁴ ve bilinmeyen bir numune boyutu dağılımının ¹¹ ölçülmesini sağlar.

Nano-gözeneklere parçacıklarının hareketi elektro kinetik (elektroforetik ve elektro-ozmotik) ve akışkan kuvvetlerinin ¹⁵ tarafından belirlenir. Değişken basınç modülü (VPM) akışkan hücreler arasında bir basınç farkı kullanılarak ek bir kuvvet olarak indüklenebilir. Pozitif bir basınç uygulanması, parçacık konsantrasyon düşük olduğunda yararlı olabilir parçacıkların akış hızını artırır. Ayrıca, basınç elektro kinetik güçlerin etkisini azaltmak için uygulanabilir. Göreceli küçük bir gözenek çapına sahip olan nano-gözeneklerde kullanıldığında bu özellikle önemlidir (NP100 muhtemelen NP150 ve NP200) sıklıkta EVs tespiti için kullanılır.Bu nano-gözeneklerde için, önemli bir basınç uygulanması bile, elektro kinetik kuvvetler, partikül yüzey yüküne bağlı olarak, ¹⁶ nonnegligible kalabilir. Birden fazla basınçlarda parçacık hızını ölçerek, bir elektro kinetik düzeltilmiş, ve böylece daha hassas EV konsantrasyonu hesaplanabilir.

Burada ayrıntılı protokolleri, EVs boyut dağılımına ve konsantrasyonunu tespit etmek için temin edilmiştir. Numuneleri, bilinen boyutları ve konsantrasyon ¹⁷ polistiren boncuklar ile tutturuldu yerlerde normal çalışma protokolü yanında, alternatif bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bu gerçek-zamanlı bir ayarlama tekniği, idrar, plazma ve hücre kültürü üstte kalan sıvı ya da biyolojik sıvılarda, doğrudan EV'lerini ölçümü sırasında teknik sorunlardan bazılarını karşılaşılan üstesinden gelmek için kullanılabilir ölçüm uzun bir süre boyunca nano-gözeneklere stabilitesi olamaz zaman sağlanmalıdır.

Protocol

1. Standart Çalışma Protokolü

1.1 Cihaz Kurulumu ve Numune Hazırlama

1. Yüklü Izon Kontrol Suite yazılımı ile bir bilgisayara aleti bağlayın.
2. - Veya NP200 (hedef boyutu aralığı: 100 - 400 nm) en sık kullanılan bir NP150 (300 nm hedef boyut aralığı 85) EVs büyüklüğü ve konsantrasyon ölçümü için: kullanmak için nanopore boyut seçin. Bir 220 nm filtre boyunca geçirerek, numunenin, örneğin daha büyük bir EVs çıkarılmasını içeren bir protokol kullanılarak izole edilmiştir EVs çalışırken, bir NP100 gözenek (hedef boyut aralığı 70-200 nm) kullanılabilir. Bir biyolojik numunede EVs veya farklı protokolü kullanılarak izole EVs çalışırken daha az sıklıkla tıkanma gibi, NP200 kullanılabilir. Veya NP400 (hedef boyut aralığı 200-800 nm), örneğin - NP300 (600 nm hedef boyut aralığı 150) gibi diğer Nanopores ya da daha büyük olan nano-gözeneklerde, EVs büyük türleri için de kullanılabilir.
3. Polistiren KALİBR seçinAdım 1.1.2 seçilen Nanopore tamamlayacak tirme parçacıklar. Bir NP100 için, NP150 ve küçük gözenek NP200 sırasıyla CPC100, CPC200 ve CP100 parçacıkları kullanır. Doğru boyutlu tahmin için, kalibrasyon parçacıklar bilinmeyen parçacıklar gibi, benzer bir boyuta sahip olduğundan emin olun.
4. Kalibrasyon parçacıkların homojenlik, vorteks kısaca (30 sn) sağlamak. İsteğe bağlı olarak, agregatları uzaklaştırmak için sonikasyon uygulanır.
5. En az 40 ul lik bir hacim içinde, hedef konsantrasyona PBS içinde seyreltin kalibrasyon parçacıkları. Not: Hedef konsantrasyon adımda 1.1.2 seçilen nanopore göre değişir. Hedef konsantrasyonları nanopores birlikte verilir.
6. Uygula ve doğrudan alt sıvı hücre PBS 78 ul kaldırmak; nanopore konumda olduğunda alt sıvı elektrolit hücreye bir uygularken alt sıvı hücrenin bu nemlendirme nano-gözeneklere altındaki hava kabarcıklarının oluşması riskini azaltır.
7. Aletin 4 kolları üzerine Nanopore yerleştirin. Kullanımdijital kumpas iki zıt kolları arasındaki mesafeyi ölçmek ve "Stretch" girdi alanına mm mesafe girin ve nanopore streç kalibre etmek "streç kalibre" tıklatın.
8. Alt sıvı hücreye 78 ul PBS yeniden uygulanması öncesinde, cihazın karşıt kolların arasındaki mesafeyi arttırarak, böylece yan çarkı açıp kapatarak, 47 mm Nanopore gerin.
   Not: Elektrik paraziti önemli ölçüde ölçümlerin kalitesini etkileyebilir. Izon Kontrol Suite yazılımını çalıştırmak için bir dizüstü bilgisayar kullanırken, dizüstü bilgisayar, bir topraklı priz ve fişi kullanarak şebekeye bağlı olduğundan emin olun. Cep telefonları da elektrik girişim bir kaynak olabilir yakın enstrüman tuttu. Elektrik parazit çoğunlukla kök kare (RMS) ses> 10 pA Yani, temel akımı sürekli tekrarlanan zirveleri olarak görülmektedir.
   Not: Hemen hemen herhangi bir tampon tRPS characteri kalibrasyon parçacıklar ve EVs seyreltmek için kullanılabilenkıymetleştirme. Tuzların varlığı, bir elektrik akımının kurulması için bir ön koşuldur. EV ölçümleri için, bir tampon madde olarak PBS kullanın. EVs doğru şekilde sağlamak üzere kalibrasyon parçacıkların her zaman aynı tampon içinde seyreltilmelidir.

1.2. Ölçüm için Optimal Settings belirleyin

Not: Kayıttan önce, optimal ölçüm ayarlarını kurmak için önemlidir. Nano-gözeneklere geçen bir parçacık neden blokajı büyüklüğü uygulanan germe ve uygulanan gerilimine bağlıdır. Güvenilir ölçümler için RMS ses olmalıdır 0.1 nA <10 pA ve mod abluka büyüklüğü olmalıdır>.

1. Nano-gözeneklere üzerindeki üst sıvı, hücre ve koruyucu kafese yerleştirilir ve üst sıvı içinde seyreltilmiş hücre kalibrasyon parçacıkların 40 ul getirmektedir. ≥0.8 kPa pozitif basınç uygulamak için VPM kullanın.
2. Kalibrasyon neden abluka olayları analiz ederken 44 mm doğru yavaş yavaş uygulanan streç azaltınparçacıklar. Nano-gözeneklere yoluyla gözenek çapı parçacıkların hareketi azaltmak zaman olasılığı daha az olacaktır ve bu nedenle, partikül oranı azalacak: edin. Ancak, gözenek nispî blokajına daha büyük bir blokaj etkinliği gelişmiş bir sinyal-gürültü oranı ile meydana gelir. Gerilimi artırarak daha abluka büyüklüğünü artırabilir ama aynı zamanda RMS gürültü artırabilir.
3. Uygun blokajı olaylar (Şekil 1c) "Sinyal İz" panelinde gözlenen kadar streç azaltın. (Modu> 0.1 nA) ve tekabül eden partikül hızı> 100 / dakikadır. Not: parçacık hızı en az 500 parçacık ölçüleri, ancak ideal olarak, daha az sıkı bir kesme olduğu, <100 / dak tanecik oranı en az 5 dakika sürelerini kayıt neden olacaktır. (Örnek seyreltme yapılmalıdır mevcut olduğu takdirde) 2000 / dak daha yüksek oranlar daha az parçacık hassas ölçümler neden olabilir.

Kalibrasyon 1.3 ÖlçümüParçacıklar, Uper Sıvı Hücre ve Numune Ölçümü Yıkama

1. Habis beyin tümörü hücre çizgisi U87 mg / EGFRvIII hücre kültürü süpernatanından bu bölüm AGH'ye karakterize edilir. Bu EVs izolasyonu ve hazırlanması daha önceden tarif edilmiş ve ¹⁸ görselleştirilmiştir.
2. Üst sıvı hücreye kalibrasyon parçacıkları yerleştirin. (Örneğin 0.8 kPa için) basınç VPM ve kayıt> 500 parçacıkları kullanarak uygulayın.
3. Çok basınç ölçümünün gerçekleştirilmesi durumunda, (1.0 kPa örneğin) uygulanan basıncı artırmak ve ikinci bir kalibrasyon dosyasını kaydedin. Not: 0,2 kPa fark minimum gereklidir.
4. Üst sıvı hücreden kalibrasyon numune çıkarılmaktadır. Kalan parçacıkları çıkarmak için, üst sıvı hücreye 100 ul PBS ile 3 kez yıkayın. Üst sıvı hücreye örnek uygulaması başlamadan önce, üst sıvı hücreden herhangi bir kalıntı PBS kaldırmak için tüysüz bir doku kullanın.
5. Üst sıvı hücreye örnek tanıtmak. Bazal geçerli kalibrasyon parçacıkları ölçerken gözlenen temel akımın% 3 içinde olduğundan emin olun. Değil% 3 içinde ise, başlangıç ​​akımını stabilize etmek için aşağıda açıklanan stratejisini uygulamak. Kalibrasyon parçacıklara uygulanan kesin basınçlar uygulamaya ve örnek dosyaları kaydedin.
   Not: Parçacık oranı grafiği sabit bir partikül algılama (Şekil 2a) göstermelidir. Parçacık algılama, temel akımı ani bir düşüş, veya RMS gürültü ani bir artış ani kesilmesi durumunda, gözenek tıkanmış olabilir; Böylece, Kaydı duraklatmak. Bazal, dokunun geri yüklemek veya koruyucu kapağı bükün, dalgıç uygulamak, veya tamamen Nanopore çıkarın ve deiyonize su ile yıkayın ve cihaz üzerinde değiştirmek için.
   Not: Alternatif olarak, yaklaşık olarak 5 dakika boyunca VPM maksimum basınç ile birlikte 47 mm küçük gözenek gerilmesini arttırabilecekse.

1.4 Veri Analizi

1. Tıklayın ", Yazılımın analiz bölümüne girmek için Veri "sekmesini analiz edin. "İşlenmemiş Dosyaları" ve seçme "Süreç Files" sağ tıklayarak kalibrasyon ve örnek dosyaları işleyin.
2. Kalibrasyon kayıtları çift "Kalibre" sütununda numune yanında örnek dosyaları onay kutusunu tıklatın. İlgili örnek ve kalibrasyon dosyaları seçin ve "Tamam" ı tıklayın. Not: Çoklu basınç kalibrasyon seçeneği birden fazla kalibrasyon dosyaları çift birden numuneler için soldaki "Çok basınç Kalibrasyon" sekmesini seçin kullanırken.
3. Bir kez başarıyla birleştiğinde, Izon Kontrol Suite yazılım gibi bir boyut dağılımı gibi farklı örnek karakteristikleri (Şekil 2b) gösterecektir, bazal süreler, tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) ve konsantrasyon analizi. İsteğe bağlı: Bir virgülle ayrılmış dosya olarak her numune için, bireysel veri noktaları ihraç edilebilir.

2.lternative Protokolü - Kalibrasyon Boncuk ile Örnekleri Ani

Not: İzole AGH ile çalışırken Genel olarak, standart işletim prosedürü kullanılabilir. Biyolojik numunelerde, ya da büyük protein agrega ile kontamine izole EV hazırlıklarında izole olmayan AGH, çalışırken cihazı kullanmadan zor olabilir. Bu zorluklar özellikle Nanopore engelleme (temel akımı ani düşüş), kalibrasyon ölçüm veya özdeş örnekleri (Şekil 3a) arasındaki parçacık oranlarında önemli farklılıklar% 3 içinde temel akımlarını kurtarmak için yetersizlik yüksek bir orandır. AGH ölçmek için bu güçlükleri bir alternatif protokolü görüntülendiği numuneler için ¹⁷ geliştirilmiştir. Bu yöntem, ilgi (Şekil 3b) arasında daha büyük bir numune içine polistiren kalibrasyon boncuklar eklenmesine dayanır. Bu protokol için ayrıntılı bir işlem, aşağıda tartışılmıştır.

2.1. ÖrnekHazırlık

Not: alternatif bir yöntem kullanarak örnekler hazırlarken, yaklaşık aynı zamanda 1. EV-kadar-boncuk oranının sağlanması istenir, bu doğru "gating 'sağlamak için, örnek bir" sadece kalibrasyon boncuk' içeren esastır kalibrasyon boncuk ve tampon mevcut (örneğin protein agrega için) arka plan parçacıkların sayısını belirlemek için.

1. 300 xg'de 7 dakika boyunca hücre kültürü süpernatanı Santrifüj 100 ul
2. PBS ve 20 ul 75 kez 10 ul süpernatan 20 ul 335 nm polistiren boncuklar (stok 7E10 / ml) ile seyreltilmiştir.

2.2. Numune Ölçümü

1. Optimum enstrüman ayarlarını belirlemek için 1.2 bölümünde tanımlanan strateji kullanın.
2. Örnek ilk 'sadece kalibrasyon boncuk' ölçün. Küçük olmayan boncuk parçacıkların arka tespiti mümkün olduğu kadar düşük olduğundan emin olun (
3. Her sa ölçünyapıldığı Örnek kez kayıt eşit farklı numuneler üzerinde küçük gözenek koşullarında dalgalanma dağıtmak için önceki çoğaltır. Her numunenin en az 3 suret ölçün.
4. Tüm örneklerin kayıt bittikten sonra 'kalibrasyon Kordona sadece' örnek yeniden ölçmesi.

2.3. Veri Analizi

Not: Alternatif protokolünü kullanırken, Izon Kontrol Suite yazılımının özel kullanımı konsantrasyonu hesaplama için yeterli değildir. Ek tablo yazılım gereklidir. Tablo 1, Şekil 3 'de gösterilen ters örneklerinin konsantrasyonunu hesaplama örneğini gösterir.

1. 'Kalibrasyon Kordona sadece' örnek ve bir veya daha fazla örnek dosyaları açın.
2. AGH ve polistiren boncuklar arasındaki ayrım için bir cut-off olarak kullanılabilir (nA) hangi abluka olay boyutu belirleyin. Polistiren boncuklar nüfusun sol tabanına karşılık abluka değerini (nA) (Belirlenmesi Şekil 3b). Not: Tüm ölçümlerin bin-boyutları eşit ayarını sağlamak ("Bireysel Abluka Trace" altında "pop-up" butonuna tıklayarak erişilen 'ViewSettings' ayarlanabilir).
3. Numunenin "Parçacık Analiz Özeti" sekmesini tıklayarak her bir numune için toplam tanecik sayımı değerlerini alabilir.
4. Adım 2.3.2 belirlenen eşik değeri kullanılarak, veri kümeleri filtre. "Veri Filtreleme" pop-up seçerek. Ekran sadece cut-off daha küçük olan parçacıklar.
5. "Parçacık Analiz Özeti" den her numune için EV sayımı değerlerini alabilir.
6. Kalibrasyon boncuk miktarını belirlemek için, toplam parçacıklardan EVs miktarını çıkarın.
7. Kalibrasyon boncuk sayımı EV sayısının bölünmesiyle EV-to-boncuk oranını belirler.
8. Her & için belirlenen oranları ortalamasını alarak ortalama arka oranını belirleme# 8220; sadece "kalibrasyon örneği boncuk. Her bir örnekten bu değerini çıkarın.
9. Her numune için EVs konsantrasyonunu belirlemek için kalibrasyon boncuk konsantrasyonu ile ayarlanmış EV-kadar-boncuk oranını çarpın.
10. EV örnek kalibrasyon boncuklarının eklenmesi ile ortaya EV seyreltme faktörü ile adım 2.3.9 bulunan konsantrasyonu çarpın. Not: Örnek örnek kurulumunda, PBS ve kalibrasyon boncuk numunenin toplam 2.5 kat seyreltme ve dolayısıyla aşama 2.3.9 bulunan konsantrasyon ham EV örnek konsantrasyonunu belirlemek için 2,5 ile çarpılmalıdır olduğunu.
11. Bu ortalamalar, standart sapma ve çoğaltır her grup için ortalamanın standart hatası olarak istatistikleri hesaplayın.
    Not: Bazı durumlarda görülmektedir AGH ve kirpi polistiren boncuklar birbiriyle örtüşmektedir. EV konsantrasyonunun düşük tahmin için düzeltme gerekli ise, kirpi polistiren boncuklar olmayan örnekleri de ölçülmelidir. Aynı kesilmeye kullanınBir "boncuk kadar EV" oranını belirlemek için aşama 2.3.2 belirlenen kapalı olarak, katkılı polistiren taneciklerin aralığı içinde kalan EVs oranını hesaplamak için kullanılır. Bu boncuk kadar EV oran basamağına 2.3.8 belirlenen EV-kadar-boncuk oranında eklenmelidir.

2.4. İsteğe bağlı: Alternatif Yöntemiyle EV Boyut Dağılımı.

1. Kontrol Suite Yazılımı iki kez örnek bir kayıt açın.
2. Yukarıda belirlenen kesme daha büyük bir göstergedir parçacıklarına örneklerinden birine filtre seçeneklerini ayarlayın. Bu kalibrasyon parçacıkları tek gösterecektir.
3. "Kalibrasyon dosyası" filtrelenmiş örnek ayarlayın ve kalibrasyon boncuk modu boyutunu girin.
4. Çift örnek dosya ve 1.4.2 tarif edildiği gibi aşama 2.4.3 oluşturulan "kalibrasyon dosyası". Örnek dosya artık çivili kalibrasyon boncuklar göre EVS ve kalibrasyon boncuk her ikisinin bir boyut dağılımına gösterecektir.
   Not: Standart operating protokol çoğunlukla EVs boyut dağılımlarının belirlenmesi için yeterli olacaktır. Bazı durumlarda bununla birlikte, kesin bir tampon komponentler imkansız ilgi EVS ile aynı tampon maddesi içinde kalibrasyon boncuk bir numune hazırlamak için yapar (plazma veya idrar gibi) bilinmemektedir. Kalibrasyon parçacıkları ile çivili bir EV örnek bu özel koşullarda EV boyut tahmininde kullanılabilir.

Results

TRPS aleti kullanmak için, iletken olmayan bir küçük gözenek makinesi (Şekil 1a) bir 4 kolları üzerine yerleştirilmiş olması gerekir ve bir voltaj (Şekil 1b) esas alınmalıdır. Bir elektrik akımı temel bir kez kurulduğunda Şekil 1c'de gösterildiği gibi, gözenek içinden geçen parçacıklar tarafından sebep mukavemet darbeler algılanır.

AGH ultra-santrifüj ile gliyoblastoma hücre hattı U87 mg / EGFRvIII kapsamındaki hücre kültür süpernatanından saflaştırılmıştır. NP100 bir nano-gözeneklere üzerinde izole EVS (Şekil 2a) ölçümü sırasında stabil bir parçacık hızı grafiği görülmektedir. Bu kararlı parçacık hızı arsa güvenilir EV konsantrasyon ölçümü için gereklidir. 115 nm polistiren kalibrasyon boncuklarının, bir boyut dağılımı (Şekil 2b) ve EV-numunenin konsantrasyonu hesabının bir kaydı EV-örnek kayıt eşleştirilmesi (veriler gösterilmemiştir) temin edilebilir.

(Figrue 3a) kesinti ve / veya dalgalanmalar sonuçlanır. Bu yanlış EV konsantrasyon tahminlerinde sonuçlanır. Bilinen konsantrasyon ve boyutta polistiren boncuklar ile numuneyi spike olarak, EV-kadar-boncuk oranı tespit edilebilir. Şekil 3b, boyut olarak 335 nm polistiren boncuklar ile hücre kültürü üst dip sonra, elde edilen sonuçları göstermektedir. İki net nüfus gözlenmektedir. Daha sonra, 0,46 nA bir blokaja yol açacak olan parçacıklar daha büyük parçacıklar polistiren boncuklar belirlenir, kararlı AGH bulunmaktadır. Polistiren boncuklara EVs oranı EVs (Tablo 1) ham konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılır. 3c çivili polistiren taneciklerin dayanan iki popülasyonlarının boyutu tahmini göstermektedir Şekil. Nanopore kurulum kullanılan yenidenboyutunda AGH> 140 nm tespiti neden olmuştur. Bu, küçük gözenek açıklığını düşürerek azaltılabilir, ancak bu aynı zamanda daha tıkanma olayları ile sonuçlanacaktır.

Şekil 1: qNano alet ve çalışma modu. Aletin (A) fotoğrafı. Bir küçük gözenek bir üst sıvı hücreden bir alt sıvı ayırma hücresi, alet üzerine yerleştirilir. Sıvısı hücre koruyucu kapak ile çevre elektrik müdahalesinden korunmaktadır. (B) İllüstrasyon ayarlanabilir direnç darbe algılama (tRPS) özetleyen. Bir iletken olmayan elastik Nanopore iki akışkan hücrelerini ayıran. Bir voltaj uygulanarak, bir elektrik akımı nano-gözeneklere delinmiş gözenekten kurulur. Ekstrasellüler veziküllerin nanopore ile hareket ederken, iyonik akışı değişir ve bir direnç darbe olarak algılandı. TRPS olarak nanopore açıklık büyüklüğü aygıtının karşıt kolların arasındaki mesafeyi artırarak ya da bu mesafenin azaltılması ile Nanopore gerilmesiyle (azaltılabilir veya artırılabilir) ayarlanabilir. (C) dirençli darbeleri Açıklayıcı Örnek. Tek bir direnç darbesinin büyüklüğü parçacığın hacmine orantılıdır:. Büyük bakliyat büyük parçacıkları gösterir , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: Tane saymak-arsa ve U87-MG / EGFRvIII hücre kültürü süpernatanından izole AGH ölçüm elde boyut dağılımı genel sabit bir partikül algılama gösteren (A) Partikül sayım arsa.. Katılımı ile kısa azalmale algılama kaydın 80 ve 100 saniye arasında gözlenmiştir. Koruyucu kapağı kaydının durdurulması ve basıldıktan sonra, parçacık oranı, bundan sonra, kayıt devam edildi stabilize. (B) izole EVs boyutu dağılımı, 115 nm polistiren kalibrasyon tanelere bilinmeyen bir örneği (EVS) kalibre sonra işaretlenir. (5 nm kutu boyutu). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Alternatif protokolü kullanılarak hücre kültür tortusu içinde EVs tRPS ölçümü. Bir biyolojik sıvıda doğrudan EV'lerini ölçülürken elde edilen (A), tipik tanecik hızı çizimleri. Gözenek tıkanması parçacık algılama oranı kısa kesintileri ve dalgalanmalara neden olur. Herarsa aynı numunenin bir tekrarlanan ölçümü ifade eder. 335 nm polistiren kalibrasyon boncuklar ile hücre kültürü üst katmanını spike sonra elde edilen (B), üç adet eş büyüklüğü dağılımı grafik. En az 0.46 nA bir darbe dirençli indükleyen tüm parçacıklar EVs seçilir. (C) kirpi polistiren taneleri, numunenin bir boyut dağılımını elde etmek için kullanılabilir. (5 nm kutu boyutu). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ölçme	Kalibrasyon sadece # 1	Kalibrasyon sadece 2.	Supernatant # 1	Supernatant # 2	Supernatant # 3
Ortalama akım (nA)	117	120	116	118	120
Parçacık hızı	172	194	250	246	196
kullanılan kesme (nA)	0.46	0.46	0.46	0.46	0.46
Toplam parçacıklar	303	317	489	488	454
Hücre dışı kesecikler	3	1	213	215	213
Çivili kalibrasyon boncuk	300	316	276	273	241
AGH / kalibrasyon boncuk	0.01	0.003	0.772	0,788	0.884
Örnek - arka plan			0.765	0.781	0.877
Extracelullar vezikülleri (10 7) / Ml			7.14	7.29	8.18
Örnek 2.5x seyreltilmiş
Ham konsantrasyon AGH (10 7) / ml			17.85	18.22	20.46

Tablo 1:. Alternatif protokolü kullanılarak EV konsantrasyon Örnek Hesaplama cut-off değeri kalibrasyon boncuk AGH ayırt kararlıdır. Daha sonra, EVS ve boncuk toplam sayısı alınabilir. Her ölçüm için EV-to-boncuk oranı hesaplanır. (Örneğin protein unsurlarının için) elektrolit içinde arka parçacıkların miktarı "kalibrasyon taneler, sadece 'numunesinin tek ölçümler için, EV-kadar-boncuk oranının ortalaması alınarak hesaplanır. Her numune için, arka plan oranının elde oranı çıkartılmaktadır. Bu adjusteD oranı (: 9.33e7 / mL bu örnekte) numunede kalibrasyon boncuk konsantrasyonu ile çarpılır. EVs ham konsantrasyonunu belirlemek için, elde edilen konsantrasyon (: 2.5 Bu örnekte) toplam AGH seyreltme faktörü ile çarpılır.

Discussion

Miktar ve tRPS kullanarak EVs boyutu karakterizasyonu için bu el yazması teklif metodolojileri tarif protokolleri. TRPS platformunun önemli avantajları küçük örneklem büyüklüğü, göreceli kısa ölçüm süresi ve gerekli numune manipülasyon yokluğu vardır.

Doğru tRPS ölçümü için önkoşuldur kalibrasyon ve numune ölçümleri arasındaki özdeş koşullar tutmaktır. Bu, aynı tampon kullanımının yanı sıra küçük gözenek büyüklüğü, gerilim ve uygulanan basınç gibi aynı cihaz ayarlarını kapsamaktadır. Orijinal VPM bu şekilde, örnekler arasında uygulanan basınç arasındaki farklılıklar küçüktür neden uygulanan basıncın tam ayarı için bir mekanizmayı barındırmamaktadır. Farklı zaman noktalarında ölçülmesi Ayrıca, VPM hazırlama sıvısı içinde buharlaştırılması, küçük basınç farklılıkları neden olabilir ve bu nedenle sık sık yeniden VPM ile prime edilmiş olmalıdır. Bu kısıtlamalar, potansiyel olarak VPM2, zerk edilmesi ile çözülmüştür hangiBir tıklama bazlı ölçeğe sahip ve hava basıncı dayanır.

Bu yazıda tarif edilen alternatif protokol olmayan saflaştınlmış biyolojik numuneler ¹⁷ EVs ölçümü için uygundur. Bu şekerler, lipidler, proteinler ve bazı durumlarda, diğer daha büyük parçalardan tampon bileşenleri, geçerli olmak üzere standart bir protokol için çok fazla ölçüm koşulları etkileyebilecek inanıyoruz. Numunenin iki ayn yapı yerine değerlerle karşılaştırılarak kalibrasyon boncuklarının ilavesinin, "gerçek zamanlı kalibrasyon 'getirmektedir. Farklı ve / veya bilinmeyen bir akışkan arka plan içeriğini numuneler (örneğin, farklı vericilerden kan plazması) karşılaştırırken Bu yöntem özellikle uygundur. Farklılıklar AGH ve polistiren parçacıkların (örneğin, parçacık yoğunluğu ve yüzey yükü), teorik modellerin yanı sıra deneysel veriler arasındaki mevcut olmasına rağmen miktar ve AGH boyutu profil için polistiren boncuk kullanılabilirliğini altını,önkoşul altında olduğu önemli bir basınç ^15,19 uygulanır. Elektrokinetik güçlerin etkisini en aza indirmek için, göreceli olarak daha yüksek NP150 / nano-gözeneklere NP200 ve önemli bir basıncın kullanımı tavsiye edilir.

AGH ve kalibrasyon boncuk boyutuna göre ayırt edilir. Sonuç olarak, çok küçük gözenek EVS ve daha büyük partiküllerin kalibrasyon her ikisinin tespit gözlenen bir çapa, gerilme uygulayarak açılmalıdır. Gözenek açılması küçük parçacıklara karşı hassasiyetini azaltacaktır yana, yalnızca kaydedilir belirli bir boyutta (genellikle AGH> 120 nm bir 335 nm kalibrasyon boncuk kullanılarak) daha büyük EVS. EVs için en düşük saptama sınırı bir NP150 nano-gözeneklere 203 nm kalibrasyon boncuklar kullanılarak, yaklaşık 90 nm'ye düşürülebilir. Büyük AGH nanopore sık sık tıkanma neden Ancak, bu kurulum geçerli olmayabilir. Bu engellemekten EVs varlığı kurulum kullanımını zorlamaktır nerede rea çok küçük AGH bir nüfus,bulgulama eşiğine ch, tespit edilemez.

Boyutu 100 nm daha küçük partikülleri ölçmek için çalışırken zorluk sistemi artar çalıştırmak için. Bu gibi durumlarda, belirleme elektrolit tuz konsantrasyonunun arttırılması yoluyla iyileştirilebilir. Artan iyon konsantrasyonu küçük parçacıklar için nispeten artmış abluka büyüklüklerini (büyük sinyal-gürültü oranı) neden olacaktır. EVs ölçümleri için bu tekniğin yaşayabilirliği yüksek tuz konsantrasyonları EVs hacmini etkileyebilir gibi olsa da güncellenmelidir.

Sonuç olarak, bir platform tRPS doğrudan miktar ve EVs büyüklük bakımından kullanılabilir. Herhangi bir izolasyon veya EV manipülasyon (antikor bağlama veya floresan etiketleme) gerekli olduğundan, platform, biyolojik sıvılar içinde, doğrudan EV ölçümü için uygundur. Alternatif bir protokol bellek bileşenleri önemli ölçüde gözenek cloggin neden burada numuneler için yararlı olabilir sağlanmıştırişlersiz standart protokol güvenilir kullanımını sağlayarak g olaylar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qNano instrument	Izon Science Ltd.	N/A
Değişken basınç modülü	Izon Science Ltd.	N/A
Nanopore	Izon Science Ltd.	NP100, NP200	Nanopor seçimi hedef partiküle göre değişir. Farklı hedef boyutlar için farklı nano gözenekler mevcuttur.
Kalibrasyon Parçacıkları	Izon Science Ltd.	CPC100, CPC200, CPC400	Kalibrasyon partikülleri farklı boyutlarda mevcuttur.
Sonikasyon banyosu	Çoklu mevcut		Temel sonikasyon banyosu yeterlidir
(Mini) girdap	Çoklu mevcut
Asansörsüz dokular	Çoklu mevcut
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Çoklu kullanılabilir
Windows tabanlı bilgisayar
Izon Control Suite 2.2	İzon Bilim Ltd.	N/A
Elektronik Tablo Yazılımı	Çoklu kullanılabilir	N/A