Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı

14.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51627

⸱

19 Haziran 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Bu makalede

Özet

In vivo ayrıntılı olarak T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi için önemlidir. Burada akış sitometresi ile eş zamanlı olarak> 250 parametrelerini değerlendiren bir in vivo T hücresi tahlilinde floresan hedef diziler (STA) kullanımını tarif eder.

Özet

In vivo T hücresi tepkilerini izlemek için yeteneği, bağışıklık tepkisinin anlamamıza geliştirilmesi ve immünoterapilerin tasarımı için önemlidir. Ve kırmızı lazer heyecanlı boyalar (Hücre Çoğalma Boya eFluor 670: İşte biz böyle carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE), mor lazer heyecanlı boyalar (CTV CellTrace Violet): hayati boyalar kullanır floresan hedef array (FTA) teknolojinin kullanımını tanımlamak CPD )> 250 belirgin bir floresan hücre kümeleri haline etiketli fare lenfositlerinin kombinasyon yöntemiyle için. Bu STA içinde hücre kümeleri ana doku uyumu (MHC) sınıf-I ve MHC smıf-II bağlama peptidleri ile doldurulan ve bu şekilde sırasıyla CD8 + ve CD4 + T hücreleri için, hedef hücre olarak hareket edilebilir. Bu hücreler, FTA uygulanabilir ve tamamen işlevsel kalır ve bu nedenle, FTA hedef hücreler ve CD4 + T hücresi tasarlandığını yardımseverli CD8 + T hücre aracılı öldürme değerlendirilmesini sağlamak için farelere verilebilirlerakış sitometrisi ile in vivo gerçek zamanlı olarak FTA B hücresi, hedef hücrelerin, s. > 250 hedef hücreler aynı anda değerlendirilebilir bu yana, çeşitli teknik konsantrasyonlarda ve birden fazla kez tekrarlanmış çeşitli epitoplara karşı antijen T hücresi tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar. Bu nedenle, bu teknik, bir sayısal (yanıtın örneğin kümülatif büyüklük) ve niteliksel (örneğin,. Fonksiyonel aviditesi ve yanıtı epitop çapraz reaktivite) seviyesinde hem de T hücresi tepkilerini ölçebilir. Burada, bu FTA inşa edilmiş ve bir rekombinant çiçek virüsü aşısı ile uyarılan T hücresi tepkilerini değerlendirmek için uygulanabilir bir örnek vermek vardır açıklanmıştır.

Giriş

T hücreleri, adaptif bağışıklık yanıtında merkezi bir rol oynar ve genellikle immünoterapide manipülasyon için hedeflenir. CD4 + efektör T hücreleri, bağışıklık birçok yönlerini düzenleyen ve aynı zamanda doğrudan antikor üretimi için B hücrelerinin yardımcı olabilir sitokin salgılayarak yabancı antijene yanıt. CD8 + sitotoksik T hücreleri (CTL 'ler) aynı zamanda sitokin salgılayarak hem de doğrudan yabancı bir antijeni eksprese eden hücreleri öldüren bir rol oynayarak, yabancı antijene yanıt verebilir. Bu T hücre efektör işlevi başlatır temel etkileşim hücre yüzeyi üzerinde MHC molekülleri üzerinde görüntülenen yabancı peptidler ile T hücre reseptörü (TCR) etkileşimini içerir. CD4 + T hücreleri, tipik olarak bir mikrop bulaşmış hücreler üzerinde gösterildi MHC sınıf I molekülleri üzerinde görüntülenen peptitlerin kabul antijen sunan hücreler ve CD8 + T hücreleri üzerinde MHC sınıf II molekülleri üzerinde görüntülenen peptitlerin tanır.

SıraylaT hücreleri, bir immün tepkisi oynadıkları rolünü değerlendirmek için, onların efektör fonksiyonları, güvenilir ve hassas tekniklerle ölçülür esastır. T hücresi yanıtı değerlendirilmesi için yaygın yöntemler arasında; MHC class-I/II/peptide Tetramer tepkime; ELISPOT ve hücre içi sitokin lekelemesi ile sitokin üretimi; ve 51 Cr-salım deneyleri ile öldürme kapasitesi. Bu deneyler, ancak, tipik olarak in vitro stimülasyon ile ex vivo olarak veya T hücre fonksiyonunun içine sınırlı bir bilgi sağlar edilir. T hücresi tepkilerini ölçümü için in vitro uyarılması yoluyla oluşabilir fonksiyonel parametreler değişiklikleri önlemek için bu nedenle T hücrelerinin herhangi bir manipülasyon ile, ortaya İdeal olarak, bu in vivo, in situ onları değerlendirmek için yararlı olacaktır. En sık vivo T hücresi işlevsel tahlillerde kullanılan bazı in vivo olarak numaralandırılır MHC sınıf I-bağlama peptidleri ile darbeli hedef hücrelerin CTL aracılı öldürme, ölçme dayanmaktadırBöyle CFSE gibi hayati boyalar ile floresan etiketleme yoluyla algılama ile. Bunlar, in vivo deneylerde ne zaman bu tür hedefleri CTL aracılı öldürme izleyebilir olsa da, daha önce nitel parametreleri, izin vermek için gerekli olan, farklı konsantrasyonlarda ve peptit epitoplarının farklı sunulması, birden fazla hedefin öldürülmesini değerlendirmek için nispeten sınırlı bir kapasiteye sahip olması fonksiyonel aviditesi ve epitop varyant çapraz reaktivite değerlendirilecektir. Bu deneyler, aynı zamanda CD4 + T hücre aracılı tepkiler üzerinde herhangi bir bilgi vermemektedir.

Son zamanlarda tek bir hayvanda aynı anda> 250 hedef hücrelere karşı T hücresi tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar floresan hedef diziler (STA) göre çok katlı bir analiz geliştirdik, T hücresi tepkilerini değerlendirmek için kullanılan mevcut yöntem ile sınırlamaları birçok üstesinden gelmek için, 1, 2 akım sitometri. FTA sev ile etiketlenmiş lenfosit oluşmaktadırBenzersiz floresans> 250 hücre kümeleri elde edilecek sağlayan CFSE, CTV ve CPD gibi vital boyaların eral konsantrasyonları ve kombinasyonları yer alır. Bu hücreler, canlı ve bütünüyle işlevsel olarak kalmaları için, bunlar, in vivo 3 efektör T hücreleri ile etkileşimi izlenmesini sağlamak için hayvanlara enjekte edilebilir. Örneğin, FTA hücre kümeleri, hedef hücrelerin 1 antijen spesifik CTL aracılı öldürme değerlendirilmesini sağlamak için MHC sınıf-I-bağlama peptidleri ile pulse edilebilir. Buna ek olarak, FTA hücre kümeleri imkan veren, MHC sınıf II-bağlama peptidleri ile doldurulan edilebilir antijene spesifik T yardımcı hücresi örneğin CD69, CD44 ve / veya aktivasyonu ile değerlendirilmesi (aktivasyonunun değerlendirilmesi ile (T H) aktivitesinin değerlendirilmesi soydaş peptid 2 taşıyan FTA içinde B hücrelerinin CD62L). 250'den fazla hedefler aynı anda tespit edilebildiğinden, bu n ile doldurulan çok sayıda hedef hücre kümeleri karşı CTL ve T H tepkilerini ölçmek mümkündürfarklı konsantrasyonlarda ve pek çok kez tekrarlanabilir ve de dahil umerous peptidler. FTA tahlil bu nedenle in vivo T hücre efektör cevabının değerlendirilmesinde görülmemiş bir düzeyi sağlar.

Burada ayrıntılı olarak FTA yapımını tarif ve in vivo olarak T hücresi tepkilerini değerlendirilmesi uygulanabilir şeklini göstermektedir. Prosedür, MHC sınıf I ve II-bağlama peptidleri ile doldurulan 42 hücre kümelerinin 6 tekrarlar oluşan üç vital boyaların kullanımı yoluyla 252 belirgin bir hücre kümeleri içeren bir FTA birlikteliğinin yapımını da açıklar. Etiketleme miktarını azaltmak için gerekli olan 42 hücre kümelerinin etiketleme tüpleri dipli, 10 ml konik ortaya çıkar ve bu da Tablo 1 'de gösterildiği gibi bir tüp rafa bu hazırlamak için yararlıdır. Bu yöntem, ayırt kümelerinin daha küçük sayıları için ayarlanabilir her bir boya 1 uygulandı.

Biz, bu tepkiler kazanmakla ölçebilir gösteren ile tahlilin programı vurgulamakFarelerin bir küçük hasta birden fazla epitoplara karşı rekombinant çiçek hastalığı virüs aşısı tarafından üretilen es. Bu, FTA deney sırasıyla yoluyla eğrisi (AUC) değerlendirmeleri ve yarı maksimal tepkileri (EC 50) oluşturmak için gerekli etkili peptid konsantrasyonunun ölçülmesi altındaki alan kullanımını kümülatif yanıtları ve fonksiyonel avidite ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Bu protokol altında kullanılan Fareler Avustralya Ulusal Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu kurallarına ve farelere göre ele alındı ​​servikal dislokasyon ile ötenazi uygulandı.

1.. Boya ve Peptid hazırlanması

  1. Boya hazırlanması
    Not: Boyalar ayrık floresan yoğunluklarda hücre etiketleme izin farklı konsantrasyonlarda ovalanır edilir. CFSE 3.5-kat seri seyreltmeler ile yapılan yedi konsantrasyonlarda kullanılır ve CTV ve CPD (2-4 bakınız Tablolar), 3.7-kat seri seyreltmeler ile yapılan altı farklı konsantrasyonda kullanılmaktadır. Tablolar 2-4 listelenen boyaların stok konsantrasyonları Tablo 2-4 'de listelenen nihai boya konsantrasyonlarda hedef hücreleri etiketlemek için kullanılacaktır. Boyalar, sulu çözeltiye maruz kalma üzerine reaksiyona girmektedir. Bu küçük şişeler önce yoğunlaştırmaya maruz boyaların en aza indirmek için açılması için, oda sıcaklığına kadar dengelenmiş olması önemlidir.
    1. CFSE
      Not: CFSE carboxyfluorescein diasetat süksinimidil ester (CFDA, SE, MW 557,47) olarak satın alınan tipik olarak 25 mg / şişe olarak,.
      1. , 10 mM stok çözeltisi elde etmek için 4.48 ml DMSO içinde 25 mg CFSE yeniden süspanse edin.
      2. Seri olarak CFSE seyreltik: DMSO içinde 87.5 ul içine 10 mM stoklar CFSE 35 ul eklenir ve Tablo 3 'de her bir boya konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın.
    2. CTV
      Not: CTV, tipik olarak bir boya 10 mM çözelti elde etmek için 10 ul DMSO ile yeniden olabilir, her biri 9 küçük şişeler, büyük paketler halinde satın alınır.
      1. Sulandırın ve bir 10 mM çözelti vermek üzere 90 ul DMSO ile CTV'nin 9 şişe havuz.
      2. Seri olarak seyreltilmesi, CTV: DMSO içinde 29.7 ul içine 10 mM stoklar CTV 11 ul eklenir ve Tablo 2 'de her bir boya konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın.
    3. CPD
      Not: CPD (MW 792,6) tipikly 0.5 mg / şişe olarak satın.
      1. 10 mM bir çözüm elde etmek için 63 ml DMSO içinde yeniden süspanse CPD 0.5 mg.
      2. Seri olarak CPD seyreltik: DMSO içinde 29.7 ul CPD içine 10 mM stoklar 11 ul eklenir ve Tablo 4 'de, her bir boya konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın.
        Not: Boya hisse senetleri, birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir ve işlevde önemli bir kayıp olmadan birkaç kez çözündürüldü ve refrozen edilebilir.
  2. Peptid hazırlanması
    Not: 1 uM (Tablo 5), bir başlangıç ​​konsantrasyonundan 10 misli seyreltmeler kullanılarak yapılan MHC sınıf-I-bağlama peptidleri genellikle 6 farklı konsantrasyonlarda hedef hücreler pals için kullanılır. 400 uM (Tablo 5), bir başlangıç ​​konsantrasyonundan 3 kat seyreltmeler kullanılarak yapılan MHC sınıf II-bağlama peptidleri genellikle 6 farklı konsantrasyonlarda hedef hücreler pals için kullanılır. Her bir peptit PBS gibi tha 2x son konsantrasyon yapılırt, her peptid konsantrasyonu 250 ul bir minimum hacme sahiptir. Peptid stokları önce FTA yapı hazırlanmış ve işlevde önemli bir kayıp olmadan -20 ° C'de saklanabilir.
    1. Hazırlama stok MHC sınıf-I-bağlama peptidleri
    2. 2 uM stok çözeltileri (2 x 1 uM) için her bir peptit epitopunun en yüksek konsantrasyon hazırlamak
    3. Seri olarak MHC sınıf-I-bağlama peptidleri seyreltik: PBS içinde 400 ul içine 2 uM peptit stok çözeltisi 44.4 ul ekleyin. Tablo 5 'de her bir peptit konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarlayın.
    4. Hazırlama stok MHC sınıf-II-bağlama peptidleri
    5. 800 uM stok çözeltileri (2 x 400 uM) için her bir peptit epitopunun en yüksek konsantrasyon hazırlayın.
    6. Seri olarak MHC sınıf II-bağlama peptidleri seyreltik: PBS içinde 300 ul 800 uM peptid içine çözeltisi 150 ul ekle. Tablo 5 'de her bir peptit konsantrasyonu vermek üzere seyreltilmiş stok çözeltisi ile tekrarla .

2.. FTA Hazırlık

Not: Aşağıdaki prosedür 252 belirgin bir hücre kümeleri vermek üzere 6 kez tekrar 6 farklı konsantrasyonda (. Örneğin, hücre kümeleri 42) 7 farklı peptit epitopları ile pulse hücre içeren bir FTA yapımını açıklamaktadır. Her bir tekrar içinde, herhangi bir epitop (Nil) ile doldurulan bir zigot, bir kontrol olarak dahil edilir. FTA analiz zamanda antikor etiketleme alıcı hücrelerin kendi ayrımı sağlamak için bir ev sahibi hayvanlar, bir CD45 allotip fark sahip olması yararlıdır. Aksi takdirde, FTA (adım 2.6 de tarif edilmiştir), bu amaçla örneğin PKH-26 gibi diğer boyalar ile etiketlenebilir. Tipik olarak, FTA hazırlama işlemi bir oturma süresince baştan sona gerçekleştirilir.

  1. Etiket 42, 10 ml konik (örneğin, Tablo 1 'de olduğu gibi) Plastik borular 1-42 dipli.
  2. Hücrelerin hazırlanması
    1. Dalak ve / veya lymp izolefarelerden hnodes. 5 ml şırınga pistonu ile elek gözenekli bir 70 mikron ile ezme dokuların tek hücre süspansiyonu hazırlayın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
    2. (RPMI ya da eşdeğeri),% 5 fetal buzağı serumu (FCS) ihtiva eden Rochester Park Memorial Institute 1640 11.5 ml 200 x 10 6 hücre / ml 'de yeniden süspanse lenfositler. Not: Bu hücre 3'e boya toksisitesini en aza indirmek için, yüksek amin içerikli bir tampon kullanmak önemlidir.
  3. CTV etiketleme
    Not: Hücreler başlangıçta CTV'nin 6 konsantrasyonları ile etiketlenir.
    1. Iyice tüpü birkaç kez ters çevrilerek hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. Tüplerin üst yarısı ıslak dikkat ederek, 37-42 etiketli 10 ml tüpler 6 hücre süspansiyonu, 1.9 ml ilave edilir.
    2. CTV ile hücreleri etiketlemek için, tüp kapağı çıkarın ve yatay tüp yatıyordu.
    3. Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına PBS içinde 83 ul ve bu stok CTV 17 ul ekle (TAB bakınızStok Çözelti tüp) atanmış olduğu için le 2. Not: A non ıslatılmış tüp boya çözeltisi ile hücre süspansiyonu hareket ve hücre çözeltisinin prematüre karışmasını önlemek için önemlidir.
    4. Tüp kap ve vorteks ile hızlı bir şekilde ve iyice boya ile hücre süspansiyonu karıştırılır.
    5. Adımları tekrarlayın 2.3.2-2.3.4, Tablo 2'de tarif edilen tayin tüplerine CTV'nin stok çözeltileri için.
    6. , Oda sıcaklığında (20 ° C), 5 dakika içinde, en az hücreleri inkübe edin.
  4. CFSE etiketleme
    1. CTV etiketleme işleminden sonra, her bir tüpe,% 5 FCS ihtiva eden RPMI içinde 5 ml ekleyin ve iyice girdaplanır hücreleri tekrar süspansiyon.
      1. Tüp 37 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 31, 25, 19, 13, 7 ve 1.
      2. Tüp 38 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 32, 26, 20, 14, 8 ve 2.
      3. Tüp 39 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 33, 27, 21, 15, 9 ve 3.
      4. Hücrenin boru 40 devir, 1 ml kaynaktantüpler 34, 28, 22, 16, 10 ve 4 süspansiyonu.
      5. Tüp 41 aktarma hücre süspansiyonu 1 ml itibaren 35, 29, 23, 17, 11 ve 5.
      6. Boru kaynaktan 42 ve transfer tüpleri 36, 30, 24, 18, 12, ve 6'ya hücre süspansiyonu 1 mi
        Not: adımları 2.4.1.1-2.4.1.6 sırasında tüplerin üst yarısını ıslak dikkat edin.
    2. CFSE ile hücreleri etiketlemek için, tüp kapağı çıkarın ve yatay tüp yatıyordu.
    3. Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına PBS 103 ml ilave edilir, ve buna, (stok çözelti ki boru tahsis edildiği için bakınız Tablo 3) stok CFSE 7 ilave edin.
    4. Tüp kap ve vorteks ile hızlı bir şekilde ve iyice boya ile hücre süspansiyonu karıştırılır.
    5. Tablo 3 'de tarif edilen tayin tüplerine CFSE stok çözeltileri için adımlar 2.4.2-2.4.4 yapın.
    6. , Oda sıcaklığında (20 ° C), 5 dakika içinde, en az hücreleri inkübe edin.
    7. Hücreler Yıkama: 20 ° C'de 9 ml hücre süspansiyonu ile seyreltinRPMI% 5 FCS, 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile katı madde ve bir transfer pipeti ile aspirasyon ile süpernatantlar çıkarın.
  5. Peptit pulsing ve hücre yıkama
    Not: hücreler CTV ve CFSE ile etiketlendi sonra, MHC sınıf I ve / veya MHC sınıf II (1.2 hazırlandı) bağlama peptidleri ile birlikte titreşim uygulanır. Hücre popülasyonlarının Bir de (Tablo 1 'de, örneğin. Nil) peptit ile doldurulan ve T hücre yanıtlarının hesaplanması için bir negatif kontrol olarak kullanılmamalıdır.
    1. Peptit darbeli
      1. % 5 FCS içeren RPMI, 250 ul toplam hacim içinde süspanse hücreler. Not: Genellikle hücre süspansiyonu, 50 ul, aşama 2.4.7 sonunda, süpernatan aspire sonra kalan bu nedenle pelet hücre ortamının 200 ul ekleyin.
      2. Uygun (Tablo 1 gibi) tüpler belirlenen için (Tablo 5 gibi) önceden hazırlanmış peptid stoklarının 250 ul ekleyin ve olmak surPBS kontrol tüpünü eklemek için bir e Nil kontrol olarak peptid olmadan tek başına ilave edildi.
      3. Bir girdap ile hücre süspansiyonları karıştırın. Not: Bu, her bir peptit epitopunun, ve her bir peptid konsantrasyonu tek bir tüp ve atanan kritik olan bu kümenin floresan imza Tablo l'de olduğu gibi (bu peptidi tanımlayan çünkü bu boru içinde, hücrelerin floresans beklenen göre net bir şekilde kaydedilir örneğin, 1).
      4. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
    2. Hücre yıkama
      1. Buzla soğutulmuş 5 ml (4 ° C) RPMI tüp ters çevrilerek hücre süspansiyonu ve tekrar süspansiyon hücreleri,% 5 FCS içeren ekleyin. Dikkatlice buzla soğutulmuş (4 ° C) FCS 3 ml hücre süspansiyonu altında yatan.
      2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler tortu FCS arayüz sağlamak için yavaş hızlanma ve fren kullanma ve hücre süspansiyon solüsyonu korunur.
      3. Sonra dikkatle RPMİ'de aspire verahatsız yıkanmış hücre peletleri kalacak şekilde bir transfer pipeti ile FCS,. Not: Hücreleri yıkamak için bir altlık FCS kullanılması kadar peptid solüsyonu mümkün olduğu, hücrelerden çıkarılır sağlamak için yardımcı olur ve hücreler toplanmış olduğunda böylece çok sayıda serbest peptidler hücre popülasyonlarının maruz kalmasını kısıtlar.
      4. Yine hücreler yıkayın:% 5 FCS ihtiva eden RPMI 4 ° C, 10 ml hücre topakları yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler tortu Süpernatantlar kapalı dökün.
      5. Havuz tüm cep birlikte,% 5 FCS ihtiva eden RPMI 4 ° C arasında 6 ml kullanarak bir pipet ile tek bir tüp içine popülasyonu. Tortu, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler toplandı Bir transfer pipet ile süpernatant aspire.
  6. CPD Hücre etiketleme
    Not: Bu noktada, altı intra tahlil replika CPD 6 farklı konsantrasyonları ile etiketleme, peptit darbeli hücreleri tarafından üretilebilir.
    1. 20 ° C'de 11.4 ml ekleyinRPMI iyice bir pipet kullanılarak bir araya getirilmiş ve hücre peleti tekrar süspansiyon% 5 FCS ihtiva etmektedir.
    2. Tüplerin üst yarısı ıslak dikkat ederek, 10 ml tüpler AF etiketli, 6 hücre süspansiyonu, 1.9 ml ilave edilir.
    3. SMG ile hücreleri etiketlemek için, tüp kapağı çıkarın ve yatay tüp yatıyordu.
    4. Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına PBS içinde 92 ul ve bu için (her bir tüpe tahsis stok çözeltisinin miktar için Tablo 4) hazır CPD ekleyin.
    5. Tüp kap ve vorteks ile hızlı bir şekilde ve iyice boya ile hücre süspansiyonu karıştırılır.
    6. . CFSE ve CTV farklı olarak, CPD etiketleme konsantrasyonu tam olarak doğrusal etiketlenmiş hücrelerin, elde edilen flüoresan yoğunluğu ile ilgili değildir ve: Tablo 4'te tarif edilen tayin tüplerine CPD stok çözeltileri için adımlar 2.6.3-2.6.5 not mi çok çeşitli etiketli popülasyonlarının eşit floresan tepe elde etmek için kullanılan etiketleme konsantrasyonu olmuştur(bkz. Tablo 4) ampirik olarak belirlenir.
    7. , Oda sıcaklığında (20 ° C), 5 dakika içinde, en az hücreleri inkübe edin.
    8. Iki kez hücreleri yıkayın: süspanse hücreleri 10 ml 20 ° C RPMI% 5 FCS içeren. 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler tortu Bir transfer pipet ile süpernatant aspire. Tekrarlayın.
    9. Havuz birlikte bir pipet ile% 5 FCS içeren 8 ml 4 ° C RPMI kullanarak tek bir tüp içine tüm hücreler. Tortu, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler toplanmış ve bir transfer pipeti ile Süpernatantı aspire.
  7. (İsteğe bağlı) PKH-26 Hücre etiketleme
    Not: STA'lar fareler barındırmak için bir CD45 alotipik farkı ifade hücreleri ile inşa edilemiyorsa, bunlar, alıcı hücrelerin kendi ayrımcılığa izin PKH-26 ile etiketli olabilir.
    1. Havuza alınan hücre pelletine 2,9 20 ° C ml PBS ilave edin ve bir pipet ile iyice yeniden süspanse edin.
    2. Bir hayır hücre süspansiyonu ekleyinn tüpünün üst yarısı ıslak dikkat ederek, 10 ml tüp ıslatılır.
    3. Tüp kapağını çıkarın ve yatay tüp yatıyordu.
    4. Tüpün üstündeki olmayan ıslatılmış kısmına (PKH-26 boya setinde) seyreltici C 58 ul ve bu 1 mM stok PKH-26 42 ul ekle.
    5. Tüp kap ve iyice karıştırın boya ile hücre çözümü karıştırın.
    6. , Oda sıcaklığında (20 ° C), 10 dakika içinde en az hücreleri inkübe edin.
    7. Iki kez hücreleri yıkayın: süspanse hücreleri 10 ml 20 ° C RPMI% 5 FCS içeren. 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler tortu Bir transfer pipet ile süpernatant aspire. Tekrarlayın.
  8. Konak hayvanların içine enjekte STA
    Not: in vivo T hücresi tepkilerini ölçmek için, FTA aktif bir bağışıklık tepkisi ve en fazla 24 saat boyunca yerinde kalan hayvanlara enjekte edilir. Bu FTA de negatif bir kontrol olarak saf bir hayvan içine enjekte edilir önemlidir.
    1. Toplamı ve PBS içinde ml başına 2.5 x 10 8 hücre hücreler tekrar süspansiyon. , Bir kontrol olarak saf bir hayvan da dahil olmak üzere, damar konakçı hücrelerin farelere 200 ul enjekte edilir.

3.. Sitometrisi

  1. FTA enjeksiyon hasat kan ve dalak (ya da ilgili diğer dokularda) ana farelerden sonra 18-24 saat.
  2. Bir 70 um ile ezme dokulardan tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması 5 ml şırınga pistonu ile gözenekli elek.
  3. % 0.1 BSA içeren PBS içinde 65 x 10 6 hücre / ml 'de tekrar süspansiyon hücreleri.
  4. Antikor etiketleme için bir mikro-titrasyon plakasının oyuklarına hücre süspansiyonu 100 ul alikotları dağıtın.
  5. CFSE, CTV ve CPD Işıksal uyumlu floresan ile florokromla etiketli antikorlar ve floresan canlılığı probları ile etiket hücreleri. Not: B220 ve bu CD69 gibi aktivasyonu gibi hücre işaretçileri B antikorlar FT kullanılıyorsa B hücresi aktivasyonunu ölçmek için gerekli olanA T H hücresi tepkilerini ölçmek için 2. STA'lar ve ev sahibi fareler bir CD45 alotipik fark varsa CD45.1 ve / veya CD45.2 bir antikor içerir.
  6. Karıştırın ve 30 dakika boyunca buz (4 ° C) üzerinde inkübe, hücre 100 ul alikotları (% 0.1 BSA içeren PBS içinde) antikor / uygunluğu boyaların 2x stok çözeltisi 100 ul ekleyin.
  7. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler ve süpernatant Sediment çıkarın: hücreleri yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile 200% 0.1 BSA ihtiva eden PBS ul, tortu hücrelerinde hücreler yeniden süspanse edin ve supernatant çıkarın.
  8. Bir 70 um ağ üzerinden% 0.1 BSA, filtre hücrelerini içeren ve ilgili floresan boyalar ve eşlenikleri saptayabilen bir akış sitometresinde akış sitometrisi ile analiz PBS içinde 400 ul toplam hacim içinde süspanse hücreler. Her FTA hücre küme çözmek için 3 x 10 6 lenfosit olaylara kadar toplayın ve istatistiksel için yeterli hücre eldecal analizi. Not: akışı için (örneğin tek lekeli kontrolleri gibi) tüm tipik kontrolleri olun sitometri istihdam edilmektedir. Tipik olarak, CFSE bir mavi lazer kaynağı (tipik olarak 488 nm) ve 520 nm üzerinde merkezli bant geçiren filtreler ile algılama uyarma gerektirir; CTV mor bir lazer kaynağı (tipik olarak 405 nm) ve 450 nm üzerinde ortalanmış bant geçiş filtreleri ile uyarılmasını gerektirir algılama; ve CPD kırmızı bir lazer kaynağı (tipik olarak 633 nm veya 640 nm) ve 670 nm üzerinde merkezli bant geçiren filtreler ile algılama gelen uyarma gerektirir.

4.. Veri Analizi

  1. Standart akış sitometri yazılımı kullanarak veri akış sitometri analiz (istihdam yolluk strateji türüne bir örnek için temsili bir sonuç bakınız).
  2. % Spesifik öldürme için, MHC sınıf-I ve-bağlama peptidleri ("Nil") pulse peptidler değildi FTA kümeleri ile doldurulan her FTA hücre kümedeki hücre sayısını hesaplar ve hesaplamak için aşağıdaki formül kullanılarak% Spesifik Öldürmek.
    % Spesifik Killing figure-protocol-1
    Not: "astar", yukarıdaki formül "naif", "peptit" ve peptidler "sıfır" ile darbeli hedefleri belirtir, naif hayvanları hedeflere belirtir, hedef peptide karşı bir bağışıklık tepkisi olduğu düşünülen hayvanlardan hedefler belirtir olarak Herhangi bir peptidlerle pulse olmayan hedeflere anlamına gelir.
  3. B hücre aktivasyonu, T H aktivitesinin bir ölçüsü olarak, en GMFI çıkarma "prime" hayvanlarda MHC sınıf II-bağlama peptidleri ile ve bu darbeli FTA B hücrelerinde CD69 antikor Horasanın geometrik ortalama floresan yoğunluğu (GMFI) hesaplamak T H etkinliğinin bir ölçüsünü vermek üzere "naif" hayvanlarda karşılık gelen FTA B hücreleri üzerinde CD69 ekspresyonu.
  4. Adımları 4.2 ve 4.3, kullanım üretilen istatistiklerindenBu tür eğri ve EC 50 altındaki alanda (EAA bu hesaplamalar için yapılır nasıl derinlemesine açıklama gibi diğer nicel ve nitel parametreleri hesaplamak için böyle GraphPadPrizmasındaki gibi matematiksel hesap tablosu yazılımı bulunabilir
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm ve EC50 için: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

FTA deneyinin kullanımına ilişkin bir örnek olarak, BALB / c fare, HIV-I CTL epitopuna HIV-I epitopların (VV-HIV) ile ifade edilmek rekombinant aşı virüsü (VV) ile bağışıklı hale getirilmiştir, Gag, Gag mut, Env ve Pol, VV CTL epitopları F2L ve F2L mut ve HIV-I T H hücresi epitopu, Gag Th (2 de tarif edildiği gibi) bir 252 parametre FTA deneyi (Şekil 1 B) kullanılarak değerlendirildi. Gag (Gag mut) ve F2L (F2L mut) epitop varyantları VV-HIV vektörü içinde ifade edilir ve bu nedenle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

FTA bazlı deneylerde avantajı, akış sitometrisi ile, tek bir konak hayvandan> 250 uygulanabilir ve tamamen işlevsel bir hedef hücre popülasyonlarının ayrımcılık sağlamasıdır. Bu, daha önce mümkün olmamıştır in vivo akış sitometri esaslı tahliller için karmaşıklık düzeyi sağlar. Bu 6 konsantrasyonlarda 7 farklı viral epitoplara yanıtlar, AUC ve EC 50 gibi parametreler in vivo T hücresi tepkileri için belirlenecek izin veren tek bir hayvanda aynı anda 6 tekrarlı takip edilebilir, yukarıda g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma Proje Destek # 1010395 (BQ ve CP) ve # 525431 (CR), ve Avustralya, Hepatit ve HIV Viroloji EOI için bir Avustralya Merkezi Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, bir Programı Hibe # 455395 (CP) tarafından desteklenen 2012 hibe (CR ve RJJ) ve Gordon ve Gretel Çoban Vakfı (BQ ve CR) bir hibe. Biz JCSMR FACS laboratuvar mükemmel bakımı için Harpreet VOHRA ve Michael Devoy teşekkür etmek isterdim, peptid sentezi için Avustralya Kanser Araştırma Vakfı Biyomoleküler Kaynak Tesisi, JCSMR, IAS, ve Dr David Boyle, CSIRO Hayvan Sağlığı Laboratuarları, Geelong, Avustralya ana HIV aşısı stokları sağlamak için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RPMISigmaR8758
Fetal buzağı serumuSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anti-CD69 parlak menekşe 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
SantrifüjEppendorf
Akış sitometresi (Fortessa veya mavi, kırmızı ve mor lazer kaynağı ile eşdeğeri)BD Bioscience

Kaynaklar

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Floresan Hedef DizisiAk SitometrisiCanl Boya EtiketlemeMHC Peptit Y klemeCellTrace VioletCFSE BoyamaCPD Proliferasyon BoyasDeney i Tekrarlarn vivo De erlendirme
T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.