Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

14.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51643

⸱

9 Temmuz 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unité d'Immunopathologie Virale, Centre de Recherche du CHU Sainte-Justine, Department of Microbiology, Infectiology & Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 2Infectious Diseases Service, CHU Sainte-Justine, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Department of Paediatrics, Université de Montréal

Bu makalede

Özet

Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV).

Özet

Varisella zoster virüsü (VZV) göbek kordon kanı nakli (UCBT) aşağıdaki morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Bu nedenle, antiherpetic profilaksi VZV enfeksiyonu ile ilişkili komplikasyonların önlenmesi için pediatrik UCBT alıcıya sistematik idare, ancak optimal süresini tanımlar hiçbir güçlü, kanıta dayalı görüş birliği yoktur. T hücrelerinin aracılık ettiği bağışıklık UCBT profilaksi muhafaza edilmelidir veya kesilmelidir olup olmadığını olarak endikasyonlar sağlayabilir aşağıdaki VZV spesifik T hücresi tepkilerinin değerlendirilmesi sulandırma, VZV enfeksiyonu kontrolünden sorumlu olduğu için. Bu amaçla, bir VZV belirli bir interferon gamma (IFN-γ) enzim-bağlı immünospot (ELISpot) deneyi ışınlanmış Canlı zayıflatılmış VZV aşısı ile in vitro uyarılmasına karşılık olarak T lenfositler tarafından IFN-γ üretimi karakterize etmek için geliştirilmiştir. Bu tahlil VZV özel c hızlı, tekrarlanabilir ve hassas ölçüm sağlarell klinik ortamda VZV spesifik bağışıklığın sulandırma izlenmesi ve VZV antijenlerine karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için uygun bir bağışıklık aracılı.

Giriş

İlk olarak 1989 yılında gerçekleştirilen UCBT giderek çocuklarda 1, çeşitli neoplastik ve neoplastik olmayan kan hastalıklarının tedavinin bir parçası olarak kullanılmaktadır. VZV iki farklı hastalıklar, suçiçeği (primer enfeksiyon sonrası) ve herpes zoster (reaktivasyonu) neden sitopatik insan alfaherpesvirüs olduğunu. Birincil enfeksiyonu takiben, VZV dorsal kök gangliyon duyu sinirlerinin içinde korunaklı konağın ömrü boyunca devam. UCBT izleyen en çok tehdit eden bulaşıcı komplikasyonlarından biridir VZV 2-4 ile ilişkilidir. Klinik merkezinde, VZV profilaksi yokluğunda, 3 yılda VZV hastalık VZV hastalığının kümülatif insidans postUCBT 46% 2 idi. Bu hastalarda, de novo enfeksiyonu ya VZV reaktivasyonu çoğu, merkezi sinir sistemi, akciğer ve karaciğer 5-7 için iç organ yayılması ile ilişkilidir. Bir sonuç, asiklovir, valasiklovir veya famsiklovire profilaksi yaygın UB ile yönetilmektedir gibiBT alıcıları 8,9. Bununla birlikte, bu tedavi stratejisi dikkate VZV spesifik T lenfositleri ya da VZV spesifik T hücre yanıtlarının sulandırma kinetikleri koruyucu potansiyelini almaz. Uzun vadeli antiherpetic profilaksi genişleyen kullanımı ile ilgili potansiyel sorunları a) hastanın tedavi alması içerir; b) antiviral ilaç direnci 10,11 geliştirilmesi; c) VZV spesifik bağışıklık sulandırma 12,13 bozukluğu. Fonksiyonel VZV spesifik T lenfositlerinin tespiti nakil sonrası dönemde VZV karşı hücre aracılı bağışıklık karşılıklarının izlenmesi, VZV enfeksiyondan uzun süreli koruma varlığı ve geliştirilmiş bir klinik sonuç ile ilişkilidir 4,14,15 için antiviral, daha rasyonel kullanımı neden olabilir VZV'nin yararlanacak hastaların ayırt hekimlerini sağlayarak tedavi bağışıklık sistemi VZV replikasyonu 4,13 kontrol edebilen olanlardan profilaksi.

IFN-γ ELISpot deney sistemleri yaygın olarak deneysel ve klinik koşulların çeşitli izleme hücre aracılı bağışıklık tepkileri için kullanılır. Noktalar reaksiyonun yerinde görünür ve istikrarlı bir çökelti oluşacak şekilde, bir kromojenik substratın yarılması aşağıdaki oluşturulur. Her bir nokta ve böylece tek bir sitokin üreten hücrenin ayak izini temsil eder. IFN-γ ELISpot ortak kökenli bir antijen ile in vitro uyarılmaya yanıt olarak IFN-γ üretilmesi için, tek tek hücrelerin ex vivo yeteneğini ölçer değil, ama aynı zamanda, belirli bir hücre popülasyonu 16,17 hücreleri yanıt frekansının bir tahmin sağlar. Yüksek hassasiyet ek olarak, IFN-γ ELISpot antiviral tedavinin başlatılması veya bırakma rehberlik hedefleyen kişiye klinik protokollerin bağlamında muhtemel kullanımı hale gerçekleştirmek için basittir. Bu işlem aşağıda ayrıntılı olarak describes özellikle VZV antijenleri ile elde edilen in vitro uyarımı takiben periferal kan mononükleer hücreleri tarafından IFN-γ üretimini tespit etmek ve ölçmek için tasarlanmış bir ELISPOT deneyi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu araştırma protokolü çalışmanın yapıldığı CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Kanada, Kurumsal Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Aydınlatılmış onam aranan ve tüm katılımcıların, ebeveynleri ya da yasal velileriyle elde edilmiştir. Bütün prosedürler gün 1 ve 2 üzerinde gerçekleştirilir (bir laminar akış başlığı altında Kalkış) steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Insan kanı işleme için standart güvenlik prosedürleri kesinlikle uyulmalıdır.

1.. Tabaklar Kaplama

  1. Her bir kuyu için, 1 dakika boyunca% 35 etanol içinde 20 ul eklenmesi ile 96 oyuklu MultiScreen IP beyaz ELISpot plakaların altındaki (PVDF) membran geçirgenliği. Zarlar hafifçe saydam olmalıdır.
  2. Bir mul kullanan; hemen 1 x fosfat tamponlu tuzlu su içinde 200 ul (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 PBS) ile 3 kere yıkayın gözenekleripipet veya benzeri bir cihaz tichannel. Bu adım, etanol tortuları, hücre yaşayabilirliğini etkilemedi ve yakalama antikoru bağlanmasını olabilir verilen önemlidir. ELISpot plakalar kırılgan ve dikkatle ele alınmalıdır: Bir otomatik plaka yıkayıcı kullanılması tavsiye edilmez.
  3. Coat 10 ug / ml 'lik bir son konsantrasyona PBS içinde 1x seyreltilmiş saflaştırılmış fare anti-insan IFN-γ yakalama antikoru 10 ul ile gözler. Düzenli plastik wrap ile tabak örtün ve 4 ° C'de bir gece inkübe

2.. Plates Engelleme

  1. Onları kuru dokunarak, kuyular boşaltın ve 1x PBS 200 ul plakaları 5 kez yıkayın.
  2. Tam RPMI 1640 ortamı içinde 200 ul ile doldurun ve kuyu (adım engelleme) 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
  3. Plakalar 1x PBS 200 ul 5x'e ve hücreler kaplama için hazır olana kadar tam 1x PBS kuyuları tutmak yıkayın.

3.. Hücre Kaplama ve Uyarım

  1. P hazırlayınstandart prosedürler kullanılarak Ficoll-Paque üzerinde gradyan santrifüj ile insan venöz kan örneklerinden eripheral kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC). Alternatif olarak, standart yöntemler kullanılarak, sıvı azot altında dondurulmuş PBMC'nin alikotları eritin. Son santrifüjleme, tekrar süspansiyon ml 2 x 10 6 hücre / bir son konsantrasyonda hücre ve bir su ceketi, bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de gece boyunca inkübe sonra.
  2. Inkübatörden PBMC çıkarın ve tam RPMI 1640 ortamı içinde, 5 ml lik bir nihai hacim içinde bunları tekrar süspansiyon.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Serratia marcescens'in gelen genetik olarak endonükleaz 10 ul varlığında PBMC'nin inkübe edin.
  4. PBMC, 50 ul bir kısım çıkarın ve tripan mavi boya, 50 ul ile karıştırın. Hücrelerin sayısı ve bir hemositometre ve mikroskopik inceleme (boya dışlama yöntemi) kullanılarak% canlılığı tahmin. Hücre sayımı ve hücre viyabilite kutu al değerlendirilmesi için çeşitli otomatik yöntemlerböylece kullanılabilir. PBMC>% 95 uygun olmalıdır. Canlılığı% 95 daha düşük olduğu zaman örnek atın.
  5. 5 dakika ıskarta yüzer ve 2 x 10 6 hücre / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda% 2 (v / v) ile etkisiz hale getirilmiş insan serumu (HIS) ile desteklenmiş AIM-V ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri için 700 x g'de santrifüjleyin PBMC. Uyarım karışımları plakaya ilave kadar 37 ° C'de tutun.
  6. , Oyuklara her seferinde bir damla, uygun uyarım karışımından 100 ul ekleyin. Aşağıda tarif edildiği gibi üç uyarım karışımları da kullanılabilir olmalıdır:
    1. Kullanım AIM-V ortamı,% 2 (v / v) inaktive edilmiş insan serumu (IHS), negatif kontrol ile takviye edilmiştir.
    2. 0.5 ug / ml, pozitif kontrol olarak) bir son konsantrasyon elde etmek üzere% 2 (v / v) ile takviye edilmiş IHS AIM-V ortamı içinde seyreltilmiş anti-CD3 monoklonal antikoru (klon OKT3) kullanın.
    3. Γ-ışınlanmış ya biçiminde, VZV antijenleri için (10,000 Gy, 30 dakika maruz kalma süresi) zayıflatılmış aşı, VZV (1350 plak oluşturan birim [PFU] / ml) canlı dilüsyonuAIM-V ortamı içinde 1:200 ted% 2 (v / v) IHS) ya da hemen erken VZV'nin dizisi (IE63) fosfoprotein göre sentezlenen 67 peptidler (15 amino asit kalıntıları) eşmolar bir karışımı ile takviye edilmiş 1 ug . PBMC kültürlerinde 4 gün sonra sitopatik etkilerin gözle görülür yokluğunu izleyerek ışınlama etkinliğini kontrol edin.
    4. Iki kopya halinde her kuyu hazırlayın.
  7. , Oyuklara her seferinde bir damla, uygun oyuklara aşama 5.4 'de hazırlanan hücre 100 ul ekleyin. Iki kuyu hücre (negatif kontrol) olmadan bırakılmalıdır. Bir su ceketi, bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de 20 saat boyunca inkübe edin. , Sallamak, taşımak veya inkübasyon sırasında birbiri üstüne tabak koymayın.

4. Nokta Gelişim ve Algılama

  1. Atın hücreleri ve 1 x PBS ile yıkayın plakaları 10x% 0.05 (v / v) Tween 20 (PBST) ile takviye edilmiştir. Tween 20 PVDF bana yapışmış hücreleri ayırmak olurgece boyunca inkübasyonu takiben mbrane.
  2. Bir çok kanallı pipet kullanarak, 0.5 mg, 100 ul ekle / ml biyotin konjuge edilmiş anti-IFN-γ monoklonal antikor (w / v) inek serum albümini (BSA) ihtiva eden% 0.5 1x PBS içerisinde seyreltilmiş (4S.B3 klon). Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin.
  3. Oyuklar PBST ile 6x yıkayın ve her bir (ağırlık / hacim),% 0.5 BSA ihtiva eden PBS içinde 1 x 1:1,000 seyreltilmiş alkalin fosfataz ile streptavidin conjugatd 100 ul ilave edin. Kapak plakaları ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
  4. Plakalar, PBST ile 3 kez yıkanır ve 1 x PBS ile 3 kez. Bir 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP) / nitro blue tetrazolyum klorid (NBT) alt-tabaka çözeltisi 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
  5. Distile akan su altında plakaları yıkayın. ELISpot levhasının alt bölümü çıkarın ve damıtılmış su ile, zarın her iki tarafında yıkayın. Hava plakaları kurutunuz.
  6. Kuyuları incelemek ve bir stereoskopik d kullanarak noktalar numaralandırmakissection mikroskop veya otomatik bir nokta sayacını kullanarak plakaları tarayın. Aynı gün incelenebilir edemez ışıktan uzakta plakaları tutun.
    1. Karşılık gelen bir çift kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı ortalama ve test kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı, negatif kontrol kaynaklar içerisinde sayılmıştır lekelerin sayısı (hücre yok), çıkarın.
    2. 10 6 PBMC başına nokta oluşturucu birimlerinin sayısı (SFU) halinde IFN-γ üretimini ifade eder.
    3. SFU sayısı, negatif kontrol üzerinde> 50, 10 başına 6 PBMC ve 2 standart sapma (SD) ise, bu test numune pozitif düşünün (hücreler + AIM-V ortamı,% 2 (v / v), HIS ile takviye edilmiştir).
    4. Noktalar sayılacak kadar çoktur olduğunda kuyunun başına 400 SFU bir değer kullanın.
  7. Test ELISpot veriler normal Kolmogorov-Smirnov testi kullanılarak dağıtılan olsun veya olmasın. Veriler normal dağıldığı zaman, Student t tes kullanılarak istatistiksel karşılaştırmalar yapmakt (2 grup) ya da ANOVA ve Bonferroni post-testi (çoklu karşılaştırmalar). Veriler normal dağılım değilseniz, Mann-Whitney U testi (2 grup) ya da Kruskal-Wallis testi ve Dunn post-test (çoklu karşılaştırmalar) kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda ayrıntıları verilen IFN-γ ELISpot protokol büyüklüğünü ve VZV 4 karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerinin kalitesini ölçmek için geliştirilen ve laboratuarımızda optimize edilmiştir. VZV antijenin çeşitli kaynaklardan stimülasyon aşaması için kullanılabilir. Bunlar aşağıdakileri içerir: a) VZV den ticari olarak temin edilebilen inaktive edilmiş deterjan özleri Vero hücreleri 18, enfekte olmuş; IE63 15 ve 19 dahil olmak üzere belirli orf4 VZV kodlanmış proteinlerin, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Değişiklikler ve sorun giderme: IFN-γ ELISpot deneyleri, insan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1), 24,25, hepatit C virüsü (HCV), 26 dahil olmak üzere, mikrobiyal patojenler, çeşitli karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini incelemek için kullanılmıştır, 27, ve Mycobacterium tuberculosis 28,29, sadece birkaç isim. Burada çocuk UCBT alıcıları kurtarma VZV spesifik immün rekonstitüsyon etkenleri tanımlayan ümidiyle, karşı olan hücresel bağışıklığın ölçülmesi iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Yazarlar Çalışma katılımcıları ve velilerine teşekkür ederiz. Biz de onun ELISpot okuyucu, istatistiksel analiz için Dr Lubo Alexandrov'da erişim için Dr Rejean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) teşekkür etmek istiyorum, ve Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois ve teknik uzman için Martine Caty olur yardım. Le Fonds d'operasyon la Fondation Merkezi de cancérologie Charles-Bruneau tarafından, HS ve PO les projets de recherche clinique et d'Evalution des teknolojileri (CHU Sainte-Justine) dökün, ve Lösemi ve Lenfoma Derneği tarafından hibe tarafından desteklenmektedir Kanada. ISF la Fondation CHU Sainte-Justine ve le Fonds de la recherche du Québec-Sante (FRQS) burs tarafından desteklenmiştir. AJG Mikrobiyoloji, Infectiology ve İmmünoloji, Université de Montréal (Cebrail-Marquis Burslu), FRQS Bölümü burs alıcı oldu, ve Sağlık Kanada Enstitüler RPiyasaları Araştırması (CIHR). NM la Fondation CHU Sainte-Justine, Cole Vakfı ve FRQS tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lökozep tüpVWR89048-936/89048-932Kan hacmine bağlı olarak 12 ml veya 50 ml'lik tüpler kullanılabilir.
Ficoll-PaqueGE Sağlık17-1440-02Işıktan koruyun.
Benzonaz nükleazNovagen70746-3-20 & # 176;C'de tutun.
MultiScreenHTS-IP Filtre PlakasıKırlangıçMSIPS4W100,45 &m.  gözenek boyutu ile steril;
Fare anti-insan IFN-&gama; antikorBD Biosciences551221NIB42 klonunu yakalayın.
Pepmix VZV IE63 JPT Peptit TeknolojileriPM-VZV-IE63Bir şişenin içeriğini 40 &# 956'da çözün; DMSO'nun l'si. 6 ay içinde kullanın.
Biyotin konjuge anti-IFN-&gama; monoklonal antikorBD Biosciences5545504SB3 klonu.
Alkalin fosfataz ile konjuge streptavidin & nbsp;Bio-Rad Life Science170-3554Aynı gün kullanım için seyreltin.
BCIP/NBTBio-Rad Yaşam Bilimleri170-6432Işıktan koruyun.

Kaynaklar

  1. Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
  2. Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
  3. Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
  4. Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
  5. Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
  6. Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
  7. Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
  8. Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
  9. Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
  10. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  11. Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
  12. Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
  13. Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
  14. Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
  15. Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
  16. Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
  17. Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
  18. De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
  19. Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
  20. Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
  21. Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
  22. Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
  23. Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
  24. Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
  25. Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
  26. Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
  27. Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
  28. Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
  29. Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
  30. Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
  31. Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
  32. Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  33. Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
  34. Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
  35. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
  36. Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
  37. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  38. Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
  39. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  40. Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
  41. Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
  42. Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
  43. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  44. Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
  45. Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
  46. Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
  47. Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
  48. Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

IFN-gamma ELISpot AnaliziT Lenfosit YanıtıVZV Antijen StimülasyonuIFN Gamma DeteksiyonuPBMC İzolasyonuSpot SayımıCD4+ T Hücreleri
Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.