Burada, hayvan deneklerde hücresel ve hücre altı düzeylerde fizyolojik olayları anlamak için yenilikçi bir mod sağlayan lifli konfokal floresan mikroskobu (FCFM) tabanlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kemoterapi kaynaklı Vasküler Toksisite - Gerçek zamanlı
Bu makalede
Özet
Özet
Kemoterapiler bazı sınıfları vasküler morbidite riski hastayı zemin hazırlayabilir uzun vadeli koşulları içine ilerleyebilir akut vasküler değişiklikleri uygulamak olabilir. Ancak, montaj klinik kanıt olsa, vasküler toksisite ve bu nedenle damar / kardiyovasküler bozukluklar heterojen bir grup etiyolojisinde açık çalışmalar yetersizdir aydınlatılamamıştır gerekmektedir yoktur. Ayrıca, damar toksisite yatan mekanizma olabilir tamamen miyosit yaralanma doğrudan ilgilidir kemoterapi kaynaklı kardiyotoksisitenin, ilkelerinden farklı olabilir. Biz anti-kanser tedavilerinin olası akut vasküler toksisite değerlendirmek için in vivo moleküler görüntüleme platformu, gerçek zamanlı kurduk.
Biz uygun kapalı organ ve referans blo içinde damarsal görselleştirmek için in vivo, farelerde yüksek çözünürlüklü moleküler görüntüleme, bir platformu kurdunuzHer birey ise aynı bireyler içinde od gemiler kendi kontrolü olarak hizmet vermektedir. Kan damarı duvarları uç organ hasarı erken bir olay olabilir vasküler toksisite benzersiz bir mekanizma temsil, doksorubisin uygulamadan sonra bozulmaktadır. Burada, lifli konfokal floresan mikroskobu (FCFM) göre görüntüleme yöntemi, hayvan deneklerde hücresel ve alt-hücresel düzeyde fizyolojik olayları anlamak için yenilikçi bir mod sağlayan, tarif edilmektedir.
Giriş
Klinik kanıtlar kemoterapi çeşitli sınıfları Raynaud fenomeni, hipertansiyon, myocardialinfarction, serebrovasküler atak ve hepatik veno-occlusivedisease 1,2 ile kendini gösteren vasküler patolojilerin çeşitli ortaya belirtir. Başlangıçta bu amaçla 3-5 için geliştirilmiş, ancak az uygulanmasıyla tümör hücrelerini yok etmek için tasarlanmış olup, ancak "'kazara anti-anjiyojenik ilaçlar", "yan mümkün anjiyojenez inhibitörleri olarak etki geleneksel kemoterapötik maddeleri tarif oldukça yeni bir terimdir mümkün 3 gibi normal hücrelere zarar ". Serum biyomarkırları kullanarak klinik çalışmalarda görüldüğü gibi çeşitli kemoterapiler vasculo-toksik maddeler olarak ima edilmiştir. Bunlar arasında maddeler (örneğin, siklofosfamid gibi), platin (örneğin sisplatin gibi) bileşikleri ve antrasiklinler 1,2,5-7 alkile edilir.
Akut kardiyovasküler komplikasyonlar Bir resul olarak ortaya çıkabilirKemoterapi ile uyarılan vasküler toksisite t. Onlar geç vasküler morbidite riski ateroskleroz ve hesabına gibi kronik koşulları dikkate ilerleyebilir. Ancak, klinik kanıt montaj rağmen, damar toksisite mekanizması vurgulayan belirlenen çalışmalar yetersizdir olduğunu ve bu nedenle, onlar indirebilmek tam patogenezi daha aydınlatılması garanti edilir.
Kemoterapi kaynaklı vasküler toksisite mekanizması açığa büyük bir meydan okuma in vivo vasküler fonksiyonu soruşturma karmaşıklığı kaynaklanmaktadır. Biz burada kan akışını ve gemilerin özelliklerini yakalamak sağlayan farelerde in vivo moleküler görüntüleme yüksek çözünürlüklü bir platform açıklar. Bu platform, doğrudan tedaviye bağlı vasküler etkilerinin tespitini kolaylaştırır: gerçek zamanlı olarak, hem de aynı bireylerin içinde bir süre boyunca onları takip gibi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik deyimi: Bütün deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Hayvan bakımı kurumsal kurallarına göre oldu. (- 8 hafta eski 7, 25-30 gr) ICR dişi fareler Tel-Aviv Üniversitesi Sackler Tıp Fakültesi klimalı, ışık kontrollü hayvan tesislerinde muhafaza edildi. Vadede, hayvanlar anestezi doz aşımı ile ötenazi edildi.
1. lifli Konfokal Floresan Mikroskobu (FCFM) Kalibrasyon
- Aygıtı AÇIN.
- Mikroprob (mini0 / 30) bağlayın.
- Üreticinin talimatlarına göre cihazı kalibre edin.
2. Fareler Görüntüleme Hazırlık
- Her iki Ketaset (100 mg / kg) ve xyl-M2 (6 mg / kg) deri altından enjeksiyonu ile anestezi. Ayak-tutam tepkisizlik tarafından uygun anesthetization onaylayın.
- Sırayla için kasık altındaki cildi insizyon femoral arter damarları ortaya. Kesi aşağıdaki tuzlu su ile nemli kesi sitesini tutun.
- Yaklaşık 30 saniye için, ılık su (çok sıcak dokunma) ile dolu bir torba (ya da bir eldiven) ile kuyruk ısıtın. Tuz veya kemoterapötik ajanın ya kuyruk damarına bir iğne (30 g, 1/2 inç) sokulması ve buna 1 ml şırınga takılarak FITC dekstran (kontrast bir madde) verilmesi için bir damar içi (IV) şant hazırlanması ve . Ven tuzlu enjekte açık olduğundan emin olun.
Not: FITC dekstranın bir IV uygulama (yüksek molekül ağırlığı, 100 ul 10 mg / ml, 2,000 kDa) FCFM femoral mikrovaskuleterini görselleştirme kolaylaştırır. Doksorubisin (100 ul, 8 mg / kg, Adriyamisin) veya tuzlu su, aynı zamanda, daha sonra önceden ısıtılmış bir kuyruk venine IV tatbik edilecektir. - Bir polistiren sahnede supinely fareyi yerleştirin. Pad fare Güvenli ve cerrahi koli bandı kullanarak konumunu korumak.
NOT: (1) mikroprob (mini0 / 30): Bu çalışmada kullanılan lifli konfokal mikroskop iki üniteden oluşmaktadır. (2) Lazer tarama ünitesi (LSU-488; 488 nm dalga boyu).
- LSU 488 nm dalga boyunda lazer kullanarak analizler her zaman tur gerçekleştirin.
NOT: Ana ünite dedektörü, filtre tespit (500-650 nm) yayılan floresan. edinilen görüntüler daha sonra yeniden ve / sn 12 kare hızında görüntülenir. - Dikkatle iğneden şırınga ayırın ve FITC dekstran içeren yeni bir şırınga takın. FITC dekstran (IV) 100 ul yönetme.
- Karşılık gelen bir görüntü elde etmek için z ekseni uyum sonra, bakış uygun bir alanına mikroprob (mini0 / 30), Shift ve sabitleştirmek. Açık ve odaklanmış sinyal visi- kadar solmaya ilk sinyal bekleyinble.
- Kısa bir süre stabilizasyon (~ 30 sn) için bir temel kan akışını kaydedin. Sonra doksorubisin veya tuzlu ya içeren, iğne başka şırınga bağlayın. IV, 100 ul doksorubisin veya tuzlu yönetmek.
- 20 dakika boyunca sürekli olarak enjekte FITC dekstran akışını izleyin. FCFM ilişkili yazılım üzerinde, kan damarlarını ölçmek için üst cetvel üzerinde çapı düğmesini kullanın ve kategorize onları küçük (<15 mikron) veya büyük (> 15 mm).
- Anestezi doz aşımı ile hayvan Euthanize.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gerçek zamanlı olarak in vivo sürekli görüntülemede
Burada kullanılan görüntüleme aparatı, damar görselleştirme ve kemoterapi gibi çeşitli uyarıcılara verdiği cevap sağlayan bir sonda ile donatılmış bir yüksek çözünürlüklü, lifli konfokal mikroskop vardır. Derin damarlar ya da organ görüntüleme kolaylaştırabilir rağmen, sonda için küçük bir insizyon, bu yöntem minimal invaziv. prob demetleri onlarca lifleri, mikroskop optik ve hassas özel konnektörü binlerce oluşur. Şematik bi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kemoterapi ile indüklenen vasküler toksisitesinin değerlendirilmesi nedeniyle, gerçek zamanlı olarak bir uyarıcıya tepki olarak damar dinamiklerinin görüntülenmesi güçlüğü nedeniyle zordur. Birçok klinik çalışmalar birkaç kemoterapiler doğrudan vasküler yaralanmaya neden olduğunu ima var, ama bu toksisite mekanizması ve özellikleri tam olarak açıklığa kavuşmuş. Bu tarifnamede, 8-10 tarif edildiği gibi lifli konfokal floresan mikroskobu içeren farelerde kemoterapi potansiyel vasküler toksisitesinin değerlendir...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| genel anestezi | Fort Dodge Hayvan Sağlığı, IA, ABD ve Biove Laboratuvarları, Fransa | 100 mg/kg ketaset ve 6 mg/kg XYL-M2 | |
| tüy dökücü krem (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, İngiltere | ||
| 30 G, 1 ml şırıngaya | |||
| FITC dekstran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μ l hacim |
| Doksorubisin | Teva, İsrail | 8 mg / kg, Adriamisin | |
| paklitaksel | Taro, İsrail | 1.2 mg / kg, Medexel | |
| salin |
Kaynaklar
- Chow, A. Y., et al. Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study. J Clin Oncol. 24 (6), 925-928 (2006).
- Nuver, J., et al. Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer. J Clin Oncol. 23 (36), 9130-9137 (2005).
- Vos, F. Y., et al. Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects. Cancer Treat Rev. 30 (6), 495-513 (2004).
- Kerbel, R. S., et al. 'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur. J Cancer. 36 (10), 1248-1257 (2000).
- Soultati, A., et al. Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications. Cancer Treat Rev. 38 (5), 473-483 (2012).
- Tempelhoff, G. F., et al. Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer. J Clin Oncol. 14 (9), 2560-2568 (1996).
- Ben Aharon, I., et al. Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity. PLoS One. 8 (9), e7515(2013).
- Laemmel, E., et al. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy. Eur J Cell Biol. 85 (8), 837-845 (2006).
- Bar-Joseph, H., et al. In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels. PLoS One. 6 (9), e23492(2011).
- Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium. 11 (5-6), 253-258 (2004).
- Kim, E. J., et al. Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 7 (7), 1172-1183 (2009).
- Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin. Br J Haematol. 81 (4), 480-488 (1992).
- Kotamraju, S., et al. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species. J Biol Chem. 275 (43), 33585-33592 (2000).
- Vasquez-Vivar, J., et al. Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin. Biochemistry. 36 (38), 11293-11297 (1997).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
