Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

DsDNA'nın mekanik özelliklerini anlama, temel bilimler ve mühendislik uygulamalarında temel bir öneme sahiptir. Ardışık baz çiftleri arasına rulo, eğim ve büküm açıları dizisi ile değişebilir çünkü dsDNA'nın yapısı düz bir sarmal merdiven daha karmaşıktır. Termal dalgalanmalar dsDNA gibi, bükme büküm ve germe gibi yapısal dalgalanmalara farklı modları geçmesi neden olabilir. Bu eritme ve dolanmaya olarak geçişleri de aşırı koşullarda oluşabilir.

Bu hareketler arasında, dsDNA bükme en çok dikkat çeken biyolojik etkiye sahiptir ^1. dsDNA eğilme birbirine yakın iki uzak siteleri getirerek gen baskıyla veya aktivasyonu ile ilişkilidir. Ayrıca, DNA hücre çekirdeğinin içine ambalaj veya bir viral kapsid önemli bir rol oynar. DsDNA bükülmesi deformasyonu yüksek çözünürlüklü mikroskopisi (AFM ² ve ³ TEM) ve Thermodyn ile deneysel olarak görselleştirilebiliramics ve kinetik kimyasal dsDNA'nın yan yana sitelere link loop tahliller ile ele alınabilir.

Böyle bir deney, ligaz bağımlı siklizasyon ^4'tür. Bu testte, 'yapışkan' (yapışkan) uçları ile dsDNA moleküller sirküle veya DNA ligazı ile dimerize. Daire ve dimer oluşumunun oranlarını karşılaştırarak, bir J faktör olarak bilinen diğer ucu, yakın DNA'nın bir ucunun etkin bir molar konsantrasyon elde edebilir. Bu, J faktör diğer ucunda, kısa bir mesafede, DNA'nın bir ucu bulma olasılığı yoğunluğuna boyutlu eşdeğerdir ve bu şekilde DNA'nın bir esneklik göstermektedir. DNA uzunluğunun bir fonksiyonu olarak J faktörünün ölçülmesi kalıcı uzunluğu ^{4,5 'da} dahil olmak üzere bir DNA ile ilgili birçok mekanik özelliklerini ortaya koymaktadır.

Solucan benzeri zincir (WLC) modeli yaygın bir açıklamaya onun başarısına dayanan dsDNA mekaniği için kanonik polimer modeli olarak kabul edilmiştirDNA deneyleri ⁶ çekerek, doğru ve uzun 200 bp ⁷ daha dsDNAs arasında J faktörleri tahmin elde kuvvet-uzatma eğrileri adencilik. Bununla birlikte, 100 bp kadar kısa dsDNA moleküller üzerinde siklizasyon deneyi kullanılarak, Cloutier ve Widom WLC modeli tahmin ⁸ daha yüksek, birkaç kat olmak J faktörleri ölçülür. Bir yıl sonra, Du ve ark. ligazı düşük konsantrasyonları ile siklizasyon deneyi kullanılarak WLC modeli ile uyum içinde J faktörleri üretilen ve Widom gruptan ⁹ ligaz kullanılan yüksek konsantrasyonlara anormal sonucu bağlanabilir. Geleneksel tahlil ⁹ kullanırken bu tartışma siklizasyonudur kinetik DNA ligaz kaçınılmaz etkisini örneğidir. Ayrıca, DNA ligaz, aynı zamanda non-spesifik bağlanma ^10,11 aracılığıyla gerçekleştirilen DNA yapısı ve sertlik etkileyebilir.

Protein-bağımlı ilmek testlerin teknik endişelerini ortadan kaldırmak için, son zamanlarda bir prot gösterdiFlüoresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) ¹² göre ein içermeyen döngü deneyi. Bu yöntemde, döngüye konformasyonları bir DNA molekülünün yapışkan uçlarının yakınında bağlı verici ve alıcı arasında FRET ile tespit edilir. Objektif tipi toplam iç yansıma flüoresans mikroskobu (TIRFM) geri loop ve uzun bir süre için hareketsiz kılınmış yüzeye tek bir DNA moleküllerinden unlooping etkinlikleri yörüngeleri kaydetmek için kullanılır. Bu yöntem, Vafabakhsh Ha ve ¹³ ile benzer bir yöntem üzerinde çok önemli bir gelişmedir uyumsuzluk içermeyen DNA molekülleri oluşturmak için DNA moleküllerinin PCR tabanlı bir montaj sağlar. Bu protokol, tek moleküllü bir yönü, FRET yönü bir hatta ligaz aktivitesi bozabilir koşullarda, aynı molekülde tekrar tekrar DNA ilmek dinamikleri ölçmek için sağlar Buna ek olarak dağılımlarının ölçüm ortalamalar topluluğa sağlar.

TIRFM düzeneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Özel bir-Tasarlanmış numune aşama bir Olympus IX61 mikroskop vücuda yerleştirilir. 532 nm ve 640 nm lazerler tarafından tanıtıldı ve lamel-su arayüzünde geliş kritik açıyı elde etmek için yüksek NA objektif içine küçük eliptik ayna ¹⁴ tarafından yansıtılır. Daha yaygın bir dikroik ayna veya prizma bazlı TIR kurulumları kullanılarak objektif TIR da FRET, bu uygulama için kullanılabilir unutmayın. Mikroskop ile oluşan floresan görüntü bir dikroik ayna, verici ve alıcı görüntüleri ayrılmıştır. Daha sonra, bir EMCCD iki yarısı üzerine yeniden görüntülü. Ek uzun geçiş filtresi emisyon arka plan sinyali azaltmak için kullanılır.

Sıcaklık kontrolü tekrarlanabilir kinetik verileri elde etmek için gereklidir. Sıcaklık kontrolü için, objektif, sıcaklık kontrollü bir soğutucu / ısıtıcı ısı transferi, ve su en aza indirmek için mikroskop vücudun burun parçası ayrılır sıkıca oturan bir pirinç bileziği yoluyla sirküle ediliramaç kılıfın altında iç metal etrafında. Bu kurulum 15 ve 50 ° C arasında lamel yüzey (Şekil 2) sağlam sıcaklık kontrolünü sağlamak mümkün. Bu çalışmada, örnek sıcaklığı 24 ° C'de muhafaza edilmiştir

Aşağıdaki protokol DNA yapımında, DNA şekil tahmini, tek molekül deney ve J faktör belirlenmesi için adım adım işlemi sunar.

1. DsDNA Numune Hazırlama

1. 10-mer dizisini tekrarlayarak küresel kavisli DNA'lar tasarlayın. Örneğin, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) ₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 ', bir 186-bp X kavisli rastgele bir ilave baz DNA ve tekrar 10-mer dizisini kuşatan sekans adaptör dizileri olmasıdır.
   Not:. Bu örnekte Kaplan ve arkadaşları tarafından, büyük ölçekli nükleozom doluluk çalışmaya dayanarak nükleozom oluşumuna karşı tercihler iki 10-mer ¹⁵ seçilmiştir. DsDNA sarmal tekrar 10 bp yakın olduğu için, 10-mer sarmal eksen herhangi bir net saptırma dairesel bir yay (Şekil 3A) gibi bir şekil üretilmesi için birikecektir. Sarmal süresi 10.5 bp yakın olduğundan, ekstra bir baz olabildiğince düzlemsel olarak kavisli yapısını korumak için her iki tekrarlar sonra eklenir. 200 bp daha kısa Bu diziler Companie sipariş edilebilirs sunan gen sentezi hizmet. Bu daha sonraki aşamalar için ortak bir adaptör dizisiyle birlikte, bu sekansları yan yüzey için uygundur. Bu prosedür Şekil 3B'de şematize edilmiştir.
2. Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) ve Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG) ile PCR yapın. Not: Primer 2 5 'ucunda FRET verici Cy3 ile etiketlenir. Tipik bir PCR protokol tarifi ve bisiklet Tablolar 1 ve 2'de sunulmuştur.
3. Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) ve Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG) ile PCR gerçekleştirin. NOT: Primer 3 5 'ucunda omurga ve biyotin bağlayıcı aracılığıyla FRET alıcı Cy5 ile etiketlenir. PCR tarifi ve bisiklet protokol yukarıdaki gibidir.
4. Bir PCR temizleme kiti kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır.
5. 0.4 ve nihai konsantrasyonlarda iplik değişimi için bir tampon (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA) içinde Cy3-etiketli ürün ve Cy5 etiketli ürünün karıştırın# 181; sırasıyla M ve 0.1 mcM. Not: aşırı Cy3-DNA şerit değişimi sonucu Cy3 ve Cy5 hem taşıyan çift yönlü konsantrasyonunu arttırır.
6. 2 dakika için 98.5 ° C 'de enkübe edilerek Değişim şeritler, yavaş yavaş 5 soğutulduktan ° C 0.1 ° C / sn bir artış hızı ile ve 5 de inkübe   2 saat boyunca ° C.

2.. Jel Elektroforez dsDNA Eğrilik Algılama

1. 29.2:0.8 oranında akrilamid ve bis-akrilamid solüsyon karıştırılarak bir poliakrilamid jeli ^16,17 dökün,% 5 (ağ / hac) pH 8.0 'de 1X Tris / borat / EDTA (TBE) tamponu. Not: jel solüsyonu 10 mi içerir: 1.217 ml% 40 akrilamit, 0.667 ml% 2 bis-akrilamid, 1 mi TBE 10X, 100 L amonyum persülfat (APS) 10,% 10, L TEMED, ve geri kalan dH ₂ O olduğu Jelin tam katılaşması yaklaşık 30 dakika sürer.
2. DNA örnekleri ve 1X yükleme tamponu içinde DNA merdiveni (% 5 gliserol,% 0.03 (ağırlık / hacim) bromofenol bl ile poliakrilamid jel yükue) ve 5-8 de jel de 45 dakika boyunca 4 ° C'de veya boya ön kadar V / cm jel sonuna yaklaşır.
3. 30 dakika için 0.5 g / ml etidyum bromid içeren 1X TBE tamponu kullanılarak jel leke. UV ışık altında DNA bantları belirlenmesi. DNA moleküllerinin belirgin boyutlarını hesaplamak için boyut markeri (100 bp DNA merdiven) ile bant pozisyonları karşılaştır. NOT: Kavisli DNA'lar genellikle düz DNA'ların daha yavaş hareket eder.

3.. Hücre Hazırlama Akış

1. Bir matkap basın ve elmas matkap kullanarak bir cam slayt iki zıt kenarları (3'' x 1'') boyunca delik 6-7 çiftleri delin. Delindikten sonra, görünür cam tozunu su akan slayt ovmak. NOT: delik perfüzyon giriş ve çıkışları olarak hizmet vermektedir. Sondaj esnasında su ile slayt soğutma çatlamasını önlemek için önemlidir.
2. Cam bir kavanoza dik slaytlar yerleştirin ve su ile doldurun. 15 dakika boyunca sonikasyon ve başka bir cam kavanoz de içine aktarabilirsinizaseton temizlik için endikedir. 15 dakika boyunca aseton ve sonikasyon ile doldurun. Daha sonra bir sprey şişesi ve su kullanılarak, etanol ile slaytlar durulayın. Polipropilen kavanoza koyun, 5 M potasyum hidroksit ile doldurun ve sonicate 15 dakika için. Son olarak, 15 dakika boyunca su içinde slaytlar sonikasyon. Aynı protokolü kullanarak lamelleri (No. 1, 24 x 40 mm) temizleyin. NOT: Temizlenmiş slaytlar ve lamelleri uzun süreli kullanım için dH ₂ O saklanabilir.
3. 0.1 M sodyum bikarbonat çözeltisi 340 L mPEG-silan 80 mg (MW 2000) ile biotin-PEG-silan, 1 mg (MW 3400) karıştırın. İyice karıştırın ve baloncuklar kurtulmak için kısaca karışımı santrifüj. NOT: Polietilen glikol (PEG) ile yüzeyin işlevselleştirme yüzeyine spesifik olmayan DNA bağlanma azaltmaya yardımcı olur.
4. Her slaytta PEG çözeltisi 80 L koyun ve hafifçe üzerine bir lamel düşük. 45 dakika boyunca bekleyin. , Cımbız ile slayt lamel ayırın dH ₂ O bol miktarda durulayın ve izin taçık havada hem kuru.
5. Kanallar oluşturmak üzere slaytta çift-çubuk ince şerit bant yerleştirin. Bunun üzerine bir lamel hizalayın ve sıkıca sıvı geçirmez kanallar oluşturmak üzere slayt karşı lamel basın. Kanalların kenarları mühür 5 dakika epoksi kullanın.

Trolox Çözüm 4. Hazırlanması

1. Bir şişe içinde ~ 30 mg troloks ve 10 ml dH ₂ O koyun ve 18 saat süre ile açık havada solüsyonu karıştırmak için bir mıknatıs karıştırma çubuğu kullanmaktadır.
2. Bir 0.2 mikron filtre kullanılarak filtre edilir ve çözelti 1 M Tris bazı (pH 11)-6 ul ekleyerek pH 7'ye ayarlanır. Not: Trolox genel olarak ¹⁸ çalışmalar, tek bir molekül olarak kullanılan bir anti-yanıp sönen reaktiftir. Trolox ® solmaya hareket kısmen bozulmuş Trolox ® çözeltisi ¹⁹ içinde mevcut olan kendi oksitlenmiş türevi gelmektedir. Metanol ya da yüksek hızlı bir şekilde pH Tris Trolox ® çözeltisi içinde çözündürülmesi için yetersiz oksidasyon kaçınılmalıdır.

5. Tek molecule Görüntüleme

1. Kanala NeutrAvidin çözeltisi (0.5 mg / ml) 15 ul enjekte edilir ve T50 tampon 100 ul (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.0) ile yıkamadan önce 2 dakika boyunca bekleyin.
2. Kanalın içine DNA örneği (50-100 pM), 50 ul enjekte edilir. 5 dakika bekleyin ve T50 tampon 100 L uzakta ilişkisiz DNA durulayın. Not: DNA molekülleri, özellikle NeutrAvidin-biyotin etkileşimi yoluyla yüzeye bağlanacaktır.
3. Bir oksijen tutucu sistem ²⁰ (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox ve 500 mM NaCl) içeren bir görüntüleme tamponu ile kanal doldurun.
4. Saniyede 25 kare bilgisayara 2 x 2 binned görüntüleri (256 x 256) akışı çerçeve transfer modunda EMCCD ayarlayın.
5. Mikroskop objektif üzerinde daldırma yağ koymak, ve numune klipsler kullanılarak mikroskop sahnede akış hücresi düzeltmek. Duvara lazer yansıma şekline bakarak odağı kaba ayarlayın. Floresan im canlı görünümünü kullanarak odağı İnce ayarımonitörde yaş.
6. Üzerinde 532 nm lazer ile veri toplama başlar. Canlı görünümünü kontrol edin ve gerekirse odağı ayarlayın. En molekülleri photobleached olduğunda veri toplama durdurun.
   NOT: Bu tesiste, mikroskop kontrol ve sabit diske kaydedilmiş olarak monitörde canlı görüntüleri görüntülemek için bir laboratuvar-C yazılı programı kullanılmıştır.

6.. Görüntü İşleme ve Veri Analizi

NOT: 256 x 256 görüntülerin bir zaman serisi Cy3 ve Cy5 şiddetlerinde tek-molekül zaman izlerini oluşturmak için bir MATLAB kodu tarafından işlenir. Donör kanal ve bölünmüş görünüm görüntü alıcı kanal arasındaki pikselleri eşleştirmek için, Cy3 ve Cy5 noktalar 6-7 çifti, eşit görüş alanına yayılmış aynı molekülün her çifti, elle bir afin dönüşüm aldı, ve vardır çapa noktaları olarak bu noktalar koordinatları kullanılarak hesaplanır.

1. MATLAB komut dosyası kullanarak, tüm tek-molekül süre bakmak t izleridüşük ve yüksek FRET sinyalleri arasında şapka gösterisi çoklu geçişler. Döngüye ve unlooped durumlarını belirlemek.
   Not: FRET sinyali Cy5 yoğunluğu olarak tanımlanan (I _a) Cy3 ve Cy5 yoğunluklarının toplamı (I I _a + _d) bölünür. Unlooped hali düşük FRET değere sahip iken döngüye devlet yüksek FRET değeri vardır. Tek bir molekülden FRET sinyallerinin histogram bimodally için geri loop ve unlooping arasında dağıtılır.
2. İki monte Gauss eğrileri arasındaki kesişim belirleyerek iki dağılımları ayıran eşik bulun.
3. FRET verimliliği gibi hesaplayın ve yüksek FRET değerleri ve düşük FRET değerleri ile unlooped devletlerle döngüye durumları atayın.
4. MATLAB komut dosyası kullanarak, moleküllerin (N (t)) kümülatif sayısını analiz o döngüye (veyaveri toplama başından bu yana farklı zaman geçerse de yüksek FRET devlet) ulaştı. NOT: dsDNA molekül veri toplama başında unlooped devletin herhangi bir yapısındaki başlayabilirsiniz yana, ilmekli nüfus artış oranı ortalama döngü oranı ilk konformasyonlar üzerinden ortalama yansıtır. Üstel fonksiyonu ile N (t) takarak döngü oranı k _döngü Özü: Biphasically artarsa, o bir çift üstel fonksiyonu ile donatılmış olabilir: Bu durumda, k _döngü elde edilir: Not: Teorik olarak, bir polimer t zamanında döngüye olmadığını hayatta kalma olasılığı, tek veya çift üstel fonksiyon ¹² değildir. Üstel fitting ortalama döngü süresini elde etmek için pratik bir araç olarak kullanılır.

7. J Factor Belirlenmesi

Not: J faktörü dsDNA bir ucu diğer ucunda yaklaşık kadar konsantre edildi temsil eder. Bu döngü oranı olarak ölçülen diğer ucu bölümü ile aynı reaksiyon oranını üretecektir DNA'nın bir ucu diliminin konsantrasyonunu interpolasyonuyla belirlenebilir. Deneysel olarak, bir uç kademeli bir yüzeyi üzerinde immobilize edilir ve diğer uç kademeli bir belirli konsantrasyon ° C'de ilave edilir. Iki ucu arasındaki ölçülen bağlanma oranı k _tavlama ise, J faktörü ²¹ ile verilir . Tavlama oranı sabiti (k _tavlama = k _tavlama / C), prob konsantrasyonu bağımsızdır.

1. 30-50 pM biotin-Cy5 oligo 20 ul (Primer 3) akış iBir NeutrAvidin kaplı kanal nto. Ilişkisiz oligolarını yıkayacak 100 ul T50 ile kanal durulayın.
2. 50 nM'lik bir nihai konsantrasyonda Cy3 oligo (Primer 2) ilavesi ile kısmen 5'te tarif edildiği gibi görüntüleme tamponu hazırlayın. Kanala bu görüntüleme tampon akış.
3. Üzerinde 532 nm lazer tutarken, kısaca yüzey bağlı Cy5 Oligoların konumlarını belirlemek için 640 nm lazer açın. 640 nm lazer kapatın ve FRET sinyal izleme başlar.
   NOT: Bir yüzeye bağlı Cy5 oligo için bir Cy3 oligo hibridizasyon üzerine, Cy5 floresans FRET dan ortaya çıkacaktır.
4. MATLAB komut dosyası kullanılarak, ilişkisiz devlet (düşük yoğunluklu Cy5) başlar ama daha sonra Cy5 yoğunluk izlerinden zamanın bir fonksiyonu olarak tavlı devlet (yüksek Cy5 yoğunluğu) dönüşmesi moleküllerinin sayısını analiz.
5. Tavlı moleküllerin karşı zaman bu sayı çiziniz. Tek bir üstel fonksiyonu ile (bu eğrinin (k _anneal) elde edilmiştir.
6. Tavlama oranı ve reaktan konsantrasyonu arasında lineer teyit etmek için farklı oligo Cy3 konsantrasyonda (60, 100 ve 180 nM) bu deney tekrarlayın. Ikinci dereceden tavlama oranı sabiti (k _tavlama Özü ) Yamaç.
7. J faktör hesaplayın , K _döngü aynı tampon durumda ölçülen döngü hızıdır.

Ilmekleme çalışma için kullanılan DNA molekülleri değişken sırasının uzunluğu ve her bir diğerine tamamlayıcı olan tek şeritli çıkıntılarının bir çift yönlü bölge oluşur. 7-baz uzunluğunda olan çıkıntılar, ilmekli durumunu yakalamak için birbirine bağlandığı olabilir. Her bir çıkıntı sitidin kimya yoluyla DNA omurgada bağlantılıdır Cy3 veya Cy5 ya da içerir. Cy5-çıkıntı da hareketsizleştirme yüzeyi (Şekil 4A) için biotin-TEG (15-atom Tetra-Etilen Glikol aralayıcı) ile bağlantılıdır. Tüm bu modifikasyonlar, PCR tabanlı bir protokol (Protokol 1 ve Şekil 3B) sonra dsDNA katılabilecektir. Çıkıntılarının seçilen uzunluk ve sekans, normal deneysel koşullarda tespit ve geri dönüşümlü FRET olayları üretmek için iyi çalışır. Döngü ve DNA döngünün kinetik unlooping çevreleyen sıcaklığa duyarlıdır ve bu nedenle, bir sıcaklık kontrol cihazı yeniden üretilebilirlik için gereklidir. Böyle bir controller kolayca mikroskop (Şekil 2) içine dahil edilebilir.

TIRFM kullanarak, Cy3 (verici) ve Cy5 yüzey hareketsiz dsDNA moleküllerinden (akseptör) sinyalleri gözlendi (Şekil 4B) dalgalanmaları anti-korelasyon gösterdi. Ilmekli halde, iki boyalar arasındaki mesafe nedeniyle, yüksek verimlilik, FRET (Şekil 4A ve 4C) yüksek Cy5 sinyali ve düşük Cy3 sinyali olmasına neden olur ki, 5 nm daha küçüktür. Çeşitli kontrol deneyleri yüksek FRET devlet ilmekli devleti temsil ettiğini kanıtlamak için yapılmıştır. Yüksek FRET devletin ömrü, yüksek FRET devletin iki çıkıntılar arasındaki baz eşleşmesi tarafından stabilize olduğunu göstermektedir ki, artan çıkıntı uzunluğu artmıştır. Yüksek FRET devletin ömrü de döngü olarak döngü serbest enerjisi artar 12 küçük olur çünkü beklenen DNA uzunluğu, azalmasıyla. Bu kanıtlar, yüksek ve düşük FRET sta dayanaraktes sırasıyla döngüye ve unlooped devletler atanabilir.

Döngü üzerinde dsDNA iç kavis etkisini test etmek için, farklı bir eğriliğe sahip iki 186 bp dsDNAs 'düz' (S-DNA) olarak adlandırılır, hangi inşa ve bunların kavis göre 'eğri' (Cı-DNA). Tekrar 10-mer sekans S-DNA için C-DNA ve TGACAGCAAC için TTTATCATCC olduğunu. Bu dsDNAs her birinin genel eğriliği PAGE dsDNA eğrilik 16,22 tahmin etmek için en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir (poliakrilamid jel elektroforezi) ile kontrol edilmiştir. Şekil 5 S-DNA aynı boyutta DNA benzer şekilde çalışır olduğunu göstermektedir DNA merdiveni (Şerit 1 ve Şekil 5'te şerit 2 karşılaştırın). Öte yandan, C-DNA, DNA merdiveni muadili ile karşılaştırıldığında daha geniş bir boyutlarını göstermektedir (~ gerçek boyutundan daha büyük 1.2, şerit 1 ve şerit 3). Bu gözlem, C-DNA daha büyük bir iç cu sahip olduğunu göstermektedirS-DNA daha rvature.

Şekil 6, C-DNA (Şekil 6A) ve karşılık gelen izleme FRET (Şekil 6B) için temsili bir floresan zaman izini gösterir. S-DNA (Şekil 4B ve 4C) ile karşılaştırıldığında, C-DNA zaman aynı dönemde daha yüksek FRET olaylar üretir; C-DNA, aynı zamanda satın alma esnasında S-DNA (Şekil 7) daha sık 4-kez döner. Bu sonuç, DNA içsel eğriliği anlamlı dinamiklerini döngü etkileyebildiğini göstermektedir.

Döngü oranından J faktörü çıkarmak için, bir ya da iki kesilmiş çıkıntılar arasındaki hibridizasyon için konsantrasyon bağımsız ikinci dizi oranı sabiti ölçülmesi gerekmektedir. Bu tür bir ölçü gerçekleşme Şekil 8A'da gösterilmiştir. Hareketsizleştirilmiş Cy5 oligo için Cy3 oligo hibridizasyonu FRET nedeniyle Cy5 yoğunluk patlamaları üretir. Birden mea GönderenFarklı Cy3-oligo konsantrasyonlarda surements (Şekil 8B bakınız), biri istatistiksel olarak sağlam bir şekilde elde edebilirsiniz. Deneyde, 500 mM NaCl, iki oligo arasındaki bağlanma oranı sabiti 0.45 ± 0.04 x 10 6 M-1 saniye-1 olarak belirlenmiştir. J faktörü ikinci dereceden tavlama oranı sabiti (k 'tavlama) ile döngü oranı (k döngü) bölünmesi ile elde edilmiştir. Bu, C-DNA için S-DNA ve 265 ± 48 nM için 61 ± 3 nM idi. S-DNA (Şekil 9) J faktörü benzer uzunlukta 7 de önceki ölçümler ile adil anlaşma olduğunu.

Şekil 1. Objective-tipi TIRFM. A) Uyarma optik. 532 nm ve 640 nm lazerler benzer fiyatları ayrı ayrı collimated edilirar çapı, bir dikroik ayna ile aynı yolu birleştirilecek ve objektif arka diyafram altına yerleştirilen küçük bir eliptik ayna üzerine odaklanmıştır. Bu renk sapmaları. B) Mikroskop optik en aza indirmek için, odaklama için bir akromatik lens kullanmak önemlidir. Minyatür aynanın yanal konumu minimal floresan emisyonu bloke ederken bu amaç ile lazer ışınını yansıtmak, böylece ince ayarlanmalıdır. Bu nedenle, küçük bir çeviri aşamasında monte edilmelidir. Karşı tarafında bir başka ayna optik algılama girmesini önlemek için giden lazer yansıtır. Mikroskop vücut dışında görüntü düzleminde, ayarlanabilir bir yarık CCD algılama alanının yarısı boyutuna görüntüyü kırpmak için yerleştirilir. Floresans emisyon iki kanal içine bir dikroik ayna tarafından bölünmüş, ve röle lensler 01:01 büyütme ile CCD üzerinde ikinci bir görüntü oluşturmak edilir. Yansıtan aynalar biri biraz donör dengelemek için döndürülürve alıcı görüntüler. Bir bant geçiren ve bir longpass filtreleri sırasıyla verici ve alıcı kanallarda arka plan azaltmak için kullanılır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Tek-molekül deneyler için Şekil 2. Sıcaklık kontrolü. Set sıcaklığı (T ler) su soğutucu / ısıtıcı üzerinde okuma. Gerçek sıcaklık (T a) mikroskop lamel üst yüzeyine temas eden bir termokup ile ölçülmüştür. Gerçek sıcaklıklara karşı altı farklı set sıcaklıkları (siyah kareler) arsa mükemmel doğrusallık (yeşil kesikli çizgi) gösterir. Kontrolörün sağlamlığı sonraki zamanlarda (kırmızı elmas) yapılan rastgele ölçümler gösterilir. Inset sıcaklık co resimnihai montaj birimi ve objektif ntrolling. Kırmızı çizgi birlik bir eğim gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3.. DNA Tasarım. A) dsDNA'yı Eğri. Bir 10-mer dsDNA kavisli boru kesimi, ve kesikli çizgiler olarak iki tek şerit olarak temsil edilir. Herhangi bir 10-mer DNA sarmal eksen mükemmel düz değildir ve bu nedenle bu tür bir 10-mer, her birleştirme ile aynı yönde sarmal ekseninin artan eğim yol açacaktır. Bu etki bir düzlemsel, süpersarmal molekül. B) dsDNA'nın PCR tabanlı hazırlık oluşturmak için kullanılabilir. Tek-kollu DNA'lar, yatay bir çizgi olarak gösterilmiştir. Bunların gerçek eğrilik burada tasvir edilmemiştir. Siyahlı merkezi kesimi temsil DNA fragmanının eşsiz bir parçasıdır. Bu çalışmada kullanılan tüm DNA'lar için ortak adaptör dizileri açık gri renkte gösterilmiştir. Ön ve arka adaptörlere Primer 1 ve 4 tavlama sırasıyla. Primer 2 5'-ucunda Cy3 ile etiketlenir. Primer 3, 5'-ucunda bir biyotin etiketi ve içsel olarak bağlanmış Cy5 sahiptir. Primer 2 ve 3'ün açık mavi bölgeler olarak işlev yapışkan uçlarını tamamlayıcı olan dizileri içerir. Ilgilenilen dizisini içeren bir plasmid ya da genomik DNA ya iki ayrı PCR reaksiyonlarında şablon olarak kullanılır. Cy3-etiketli dsDNA astar 1 ve 2 kullanılarak üretilir ve biyotinile Cy5-etiketli DNA astar 3 ve 4 kullanılarak üretilir. Bu iki PCR ürünleri ısıtılır ve iplik değişimi için bir araya getirilmiştir. Dört farklı dsDNAs Cy3, Cy5 ve biotin içeren yalnızca bir tanesi, oluşur. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

hep ">
Şekil 4. Deneysel şeması. A) Tek molekül FRET deney. diğer bir yan ve Cy5 (kırmızı) Cy3 (yeşil) ile etiketlenmiş dsDNA molekülleri, PEG (polietilen glikol) ile kaplanmış yüzey üzerinde immobilize edilir. DsDNAs Tersinir loop ve unlooping yüksek FRET (döngülü) ve düşük FRET (unlooped) devletler, sırasıyla. B) donör (yeşil Tipik bir tek-molekül zaman iz) ve alıcı (kırmızı) floresan yoğunlukları sonuçlanabilir. Yüksek ve düşük FRET devletler sırasıyla döngüye ve unlooped devlet olarak tanımlanır. Ayrıca, döngü oranını hesaplamak için kullanılan ilk döngü zamanı göstermiştir. (Ankastre) zoom-in şekil. C) donör ve alıcı yoğunluğu hesaplanır FRET verimliliği bir zaman iz B izleri Cy3 ve Cy5 yoğunlukları, anti-korelasyon göstermektedir. Şekil 4B ve <s , ana metinde açıklandığı gibi trong> 4C düz DNA (S-DNA) alınmıştır. 0.2 de düşük FRET 532 nm lazer Cy5'in doğrudan uyarılması nedeniyle, ve floresan aktif Cy5'in varlığını onaylar. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,. Poliakrilamid jel elektroforezi (29.2:0.8 akrilamid / bis-akrilamid, TBE tampon maddesi, pH 8.0 içinde% 5), sentetik DNAların. Soldan sağa, kulvarlar 1 kb işaretleyici, 186 bp DNA düz ve 186 bp içerir Eğri DNA. Bu rakam kısmen izni ile bir önceki yayın 12 uyarlanmıştır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

"fo: keep-together.within-page =" _content hep ">
Şekil 6,. Eğimli DNA (Cı-DNA) (A) ve karşılık gelen izleme FRET (B) Örnek izler. Yoğunluğu karşılaştırılması ve S-DNA (Şekiller 4B ve 4C) ve C-DNA (Şekil 6A izleri arasında FRET ve 6B) açık bir şekilde kavisli DNA daha sık aynı tampon durumda düz DNA'dan daha döngüler olduğunu göstermektedir. (Ankastre) zoom-in şekil Cy3 ve Cy5 yoğunlukları, anti-korelasyon göstermektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 7,. Düz ve kavisli DNA'ların ortalama ilk döngü kez. Her time 5 farklı alanlarda ~ 500 moleküllerinden ekstre edilmiştir. Hata çubukları 3 bağımsız deneyler hesaplanan ortalama (SEM), standart hata temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 8,. Oligo melezleştirme arasındaki bağlanma oranı sabiti belirlenmesi. Tavlama hızı ölçümü A) şematik görünümü. Cy5 astar yüzeyi üzerinde hareketsiz, ve Cy3 primer 50-180 nM'de mevcut olmasıdır. 50 nM'de bağlama ve Cy3 primerin unbinding tersine çevrilebilir ortaya çıkar ve tavlama oranı, serbest oligo konsantrasyonuna doğrusal olarak bağlıdır ek. B) 'de gösterilen tespit alıcı patlamaları, yol açar. Çizginin eğimi, ikinci dereceden tavlama oranı sabiti (k 'annea temsil eder l). resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 9 nM hesaplanan düz ve kavisli DNA'ların J faktörler J faktör iki measurables göre belirlendi:... DsDNA döngü ve ücretsiz tamamlayıcı çıkıntılarının tavlama sabit oranının döngü oranı büyük resmi görebilmek için tıklayın .

Sekiz: 25px; width: 351px; "> Su

Bileşen	Volume/50 ul reaksiyon	Nihai konsantrasyon
36 ul
5x Phusion tampon	10 ul	1x
10 mM dNTP	1 ul	200 uM her bir
İleri primer (25 uM)	1 ul	0.5 uM
Ters primer (25 uM)	1 ul	0.5 uM
Phusion sıcak başlangıç ​​DNA polimeraz (2 U / ul)	0.5 ul	0.02 U / ul
Şablon DNA	0.5 ul	~ 1 ng

Tablo 1. PCR reaksiyon karışımı. Protokol Phusion DNA polimerazı için optimize edilmiştir. Öğeler, bu sırayla ilave edilmelidir.

"> 95 ° C

Döngü adım	Sıcaklık	Zaman	Döngü Sayısı
İlk denatürasyon	30 sn	1
Denatürasyonu	95 ° C	5 sn	30
Tavlama	60 ° C	10 sn
Uzatma	72 ° C	15 sn / kb
Final uzantı	72 ° C	5 dakika	1
4 & #176; C	tutmak

Tablo 2. PCR çevrim talimatlar. Tavlama sıcaklığı primerlerin erime sıcaklıklarına göre belirlenir. Uzatma süresi Phusion DNA polimerazı için optimize edilmiştir.

Yazarlar çıkar çatışması beyan ederim.