Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Özet

Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.

Özet

Iki-şeritli DNA (dsDNA) eğilmesi gibi DNA-protein tanıma ve nükleozom içine DNA paket gibi birçok önemli biyolojik süreçler ile ilişkilidir. DsDNA bükme Termodinamik kovalent bir dsDNA'nın kısa yapışkan uçlarını birleştiren DNA ligaz dayanan bir yöntem denilen siklizasyonu tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu gibi bağlama verimliliği DNA katılan yapışkan uçlarını çevreleyen yapı ve ligaz gibi döngü dsDNA ile ilişkili olmayan bir çok faktör tarafından etkilenebilir, aynı zamanda, non-spesifik bağlanma gibi mekanizmalar yoluyla belirgin ilmek hızını etkileyebilir. Burada, biz FRET (Floresan Rezonans Enerji Transferi) tarafından geçici DNA döngü oluşumunu tespit ederek ligazın olmadan dsDNA ilmek kinetik ölçmek için nasıl göstereceğim. dsDNA molekülleri, FRET çifti ve bir biyotin bağlayıcı ile basit PCR tabanlı bir protokol kullanılarak inşa edilmektedir. J faktörü olarak bilinen döngü olasılık yoğunluk kapa iki döngü arasındaki oran ile tavlama oranı elde edilirted yapışkan biter. Farklı içsel eğriliğe sahip iki dsDNAs test ederek, J faktör dsDNA iç şekline duyarlı olduğunu göstermektedir.

Giriş

DsDNA'nın mekanik özelliklerini anlama, temel bilimler ve mühendislik uygulamalarında temel bir öneme sahiptir. Ardışık baz çiftleri arasına rulo, eğim ve büküm açıları dizisi ile değişebilir çünkü dsDNA'nın yapısı düz bir sarmal merdiven daha karmaşıktır. Termal dalgalanmalar dsDNA gibi, bükme büküm ve germe gibi yapısal dalgalanmalara farklı modları geçmesi neden olabilir. Bu eritme ve dolanmaya olarak geçişleri de aşırı koşullarda oluşabilir.

Bu hareketler arasında, dsDNA bükme en çok dikkat çeken biyolojik etkiye sahiptir ^1. dsDNA eğilme birbirine yakın iki uzak siteleri getirerek gen baskıyla veya aktivasyonu ile ilişkilidir. Ayrıca, DNA hücre çekirdeğinin içine ambalaj veya bir viral kapsid önemli bir rol oynar. DsDNA bükülmesi deformasyonu yüksek çözünürlüklü mikroskopisi (AFM ² ve ³ TEM) ve Thermodyn ile deneysel olarak görselleştirilebiliramics ve kinetik kimyasal dsDNA'nın yan yana sitelere link loop tahliller ile ele alınabilir.

Böyle bir deney, ligaz bağımlı siklizasyon ^4'tür. Bu testte, 'yapışkan' (yapışkan) uçları ile dsDNA moleküller sirküle veya DNA ligazı ile dimerize. Daire ve dimer oluşumunun oranlarını karşılaştırarak, bir J faktör olarak bilinen diğer ucu, yakın DNA'nın bir ucunun etkin bir molar konsantrasyon elde edebilir. Bu, J faktör diğer ucunda, kısa bir mesafede, DNA'nın bir ucu bulma olasılığı yoğunluğuna boyutlu eşdeğerdir ve bu şekilde DNA'nın bir esneklik göstermektedir. DNA uzunluğunun bir fonksiyonu olarak J faktörünün ölçülmesi kalıcı uzunluğu ^{4,5 'da} dahil olmak üzere bir DNA ile ilgili birçok mekanik özelliklerini ortaya koymaktadır.

Solucan benzeri zincir (WLC) modeli yaygın bir açıklamaya onun başarısına dayanan dsDNA mekaniği için kanonik polimer modeli olarak kabul edilmiştirDNA deneyleri ⁶ çekerek, doğru ve uzun 200 bp ⁷ daha dsDNAs arasında J faktörleri tahmin elde kuvvet-uzatma eğrileri adencilik. Bununla birlikte, 100 bp kadar kısa dsDNA moleküller üzerinde siklizasyon deneyi kullanılarak, Cloutier ve Widom WLC modeli tahmin ⁸ daha yüksek, birkaç kat olmak J faktörleri ölçülür. Bir yıl sonra, Du ve ark. ligazı düşük konsantrasyonları ile siklizasyon deneyi kullanılarak WLC modeli ile uyum içinde J faktörleri üretilen ve Widom gruptan ⁹ ligaz kullanılan yüksek konsantrasyonlara anormal sonucu bağlanabilir. Geleneksel tahlil ⁹ kullanırken bu tartışma siklizasyonudur kinetik DNA ligaz kaçınılmaz etkisini örneğidir. Ayrıca, DNA ligaz, aynı zamanda non-spesifik bağlanma ^10,11 aracılığıyla gerçekleştirilen DNA yapısı ve sertlik etkileyebilir.

Protein-bağımlı ilmek testlerin teknik endişelerini ortadan kaldırmak için, son zamanlarda bir prot gösterdiFlüoresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) ¹² göre ein içermeyen döngü deneyi. Bu yöntemde, döngüye konformasyonları bir DNA molekülünün yapışkan uçlarının yakınında bağlı verici ve alıcı arasında FRET ile tespit edilir. Objektif tipi toplam iç yansıma flüoresans mikroskobu (TIRFM) geri loop ve uzun bir süre için hareketsiz kılınmış yüzeye tek bir DNA moleküllerinden unlooping etkinlikleri yörüngeleri kaydetmek için kullanılır. Bu yöntem, Vafabakhsh Ha ve ¹³ ile benzer bir yöntem üzerinde çok önemli bir gelişmedir uyumsuzluk içermeyen DNA molekülleri oluşturmak için DNA moleküllerinin PCR tabanlı bir montaj sağlar. Bu protokol, tek moleküllü bir yönü, FRET yönü bir hatta ligaz aktivitesi bozabilir koşullarda, aynı molekülde tekrar tekrar DNA ilmek dinamikleri ölçmek için sağlar Buna ek olarak dağılımlarının ölçüm ortalamalar topluluğa sağlar.

TIRFM düzeneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Özel bir-Tasarlanmış numune aşama bir Olympus IX61 mikroskop vücuda yerleştirilir. 532 nm ve 640 nm lazerler tarafından tanıtıldı ve lamel-su arayüzünde geliş kritik açıyı elde etmek için yüksek NA objektif içine küçük eliptik ayna ¹⁴ tarafından yansıtılır. Daha yaygın bir dikroik ayna veya prizma bazlı TIR kurulumları kullanılarak objektif TIR da FRET, bu uygulama için kullanılabilir unutmayın. Mikroskop ile oluşan floresan görüntü bir dikroik ayna, verici ve alıcı görüntüleri ayrılmıştır. Daha sonra, bir EMCCD iki yarısı üzerine yeniden görüntülü. Ek uzun geçiş filtresi emisyon arka plan sinyali azaltmak için kullanılır.

Sıcaklık kontrolü tekrarlanabilir kinetik verileri elde etmek için gereklidir. Sıcaklık kontrolü için, objektif, sıcaklık kontrollü bir soğutucu / ısıtıcı ısı transferi, ve su en aza indirmek için mikroskop vücudun burun parçası ayrılır sıkıca oturan bir pirinç bileziği yoluyla sirküle ediliramaç kılıfın altında iç metal etrafında. Bu kurulum 15 ve 50 ° C arasında lamel yüzey (Şekil 2) sağlam sıcaklık kontrolünü sağlamak mümkün. Bu çalışmada, örnek sıcaklığı 24 ° C'de muhafaza edilmiştir

Aşağıdaki protokol DNA yapımında, DNA şekil tahmini, tek molekül deney ve J faktör belirlenmesi için adım adım işlemi sunar.

Protokol

1. DsDNA Numune Hazırlama

1. 10-mer dizisini tekrarlayarak küresel kavisli DNA'lar tasarlayın. Örneğin, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) ₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 ', bir 186-bp X kavisli rastgele bir ilave baz DNA ve tekrar 10-mer dizisini kuşatan sekans adaptör dizileri olmasıdır.
   Not:. Bu örnekte Kaplan ve arkadaşları tarafından, büyük ölçekli nükleozom doluluk çalışmaya dayanarak nükleozom oluşumuna karşı tercihler iki 10-mer ¹⁵ seçilmiştir. DsDNA sarmal tekrar 10 bp yakın olduğu için, 10-mer sarmal eksen herhangi bir net saptırma dairesel bir yay (Şekil 3A) gibi bir şekil üretilmesi için birikecektir. Sarmal süresi 10.5 bp yakın olduğundan, ekstra bir baz olabildiğince düzlemsel olarak kavisli yapısını korumak için her iki tekrarlar sonra eklenir. 200 bp daha kısa Bu diziler Companie sipariş edilebilirs sunan gen sentezi hizmet. Bu daha sonraki aşamalar için ortak bir adaptör dizisiyle birlikte, bu sekansları yan yüzey için uygundur. Bu prosedür Şekil 3B'de şematize edilmiştir.
2. Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) ve Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG) ile PCR yapın. Not: Primer 2 5 'ucunda FRET verici Cy3 ile etiketlenir. Tipik bir PCR protokol tarifi ve bisiklet Tablolar 1 ve 2'de sunulmuştur.
3. Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) ve Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG) ile PCR gerçekleştirin. NOT: Primer 3 5 'ucunda omurga ve biyotin bağlayıcı aracılığıyla FRET alıcı Cy5 ile etiketlenir. PCR tarifi ve bisiklet protokol yukarıdaki gibidir.
4. Bir PCR temizleme kiti kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır.
5. 0.4 ve nihai konsantrasyonlarda iplik değişimi için bir tampon (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.0, 1 mM EDTA) içinde Cy3-etiketli ürün ve Cy5 etiketli ürünün karıştırın# 181; sırasıyla M ve 0.1 mcM. Not: aşırı Cy3-DNA şerit değişimi sonucu Cy3 ve Cy5 hem taşıyan çift yönlü konsantrasyonunu arttırır.
6. 2 dakika için 98.5 ° C 'de enkübe edilerek Değişim şeritler, yavaş yavaş 5 soğutulduktan ° C 0.1 ° C / sn bir artış hızı ile ve 5 de inkübe   2 saat boyunca ° C.

2.. Jel Elektroforez dsDNA Eğrilik Algılama

1. 29.2:0.8 oranında akrilamid ve bis-akrilamid solüsyon karıştırılarak bir poliakrilamid jeli ^16,17 dökün,% 5 (ağ / hac) pH 8.0 'de 1X Tris / borat / EDTA (TBE) tamponu. Not: jel solüsyonu 10 mi içerir: 1.217 ml% 40 akrilamit, 0.667 ml% 2 bis-akrilamid, 1 mi TBE 10X, 100 L amonyum persülfat (APS) 10,% 10, L TEMED, ve geri kalan dH ₂ O olduğu Jelin tam katılaşması yaklaşık 30 dakika sürer.
2. DNA örnekleri ve 1X yükleme tamponu içinde DNA merdiveni (% 5 gliserol,% 0.03 (ağırlık / hacim) bromofenol bl ile poliakrilamid jel yükue) ve 5-8 de jel de 45 dakika boyunca 4 ° C'de veya boya ön kadar V / cm jel sonuna yaklaşır.
3. 30 dakika için 0.5 g / ml etidyum bromid içeren 1X TBE tamponu kullanılarak jel leke. UV ışık altında DNA bantları belirlenmesi. DNA moleküllerinin belirgin boyutlarını hesaplamak için boyut markeri (100 bp DNA merdiven) ile bant pozisyonları karşılaştır. NOT: Kavisli DNA'lar genellikle düz DNA'ların daha yavaş hareket eder.

3.. Hücre Hazırlama Akış

1. Bir matkap basın ve elmas matkap kullanarak bir cam slayt iki zıt kenarları (3'' x 1'') boyunca delik 6-7 çiftleri delin. Delindikten sonra, görünür cam tozunu su akan slayt ovmak. NOT: delik perfüzyon giriş ve çıkışları olarak hizmet vermektedir. Sondaj esnasında su ile slayt soğutma çatlamasını önlemek için önemlidir.
2. Cam bir kavanoza dik slaytlar yerleştirin ve su ile doldurun. 15 dakika boyunca sonikasyon ve başka bir cam kavanoz de içine aktarabilirsinizaseton temizlik için endikedir. 15 dakika boyunca aseton ve sonikasyon ile doldurun. Daha sonra bir sprey şişesi ve su kullanılarak, etanol ile slaytlar durulayın. Polipropilen kavanoza koyun, 5 M potasyum hidroksit ile doldurun ve sonicate 15 dakika için. Son olarak, 15 dakika boyunca su içinde slaytlar sonikasyon. Aynı protokolü kullanarak lamelleri (No. 1, 24 x 40 mm) temizleyin. NOT: Temizlenmiş slaytlar ve lamelleri uzun süreli kullanım için dH ₂ O saklanabilir.
3. 0.1 M sodyum bikarbonat çözeltisi 340 L mPEG-silan 80 mg (MW 2000) ile biotin-PEG-silan, 1 mg (MW 3400) karıştırın. İyice karıştırın ve baloncuklar kurtulmak için kısaca karışımı santrifüj. NOT: Polietilen glikol (PEG) ile yüzeyin işlevselleştirme yüzeyine spesifik olmayan DNA bağlanma azaltmaya yardımcı olur.
4. Her slaytta PEG çözeltisi 80 L koyun ve hafifçe üzerine bir lamel düşük. 45 dakika boyunca bekleyin. , Cımbız ile slayt lamel ayırın dH ₂ O bol miktarda durulayın ve izin taçık havada hem kuru.
5. Kanallar oluşturmak üzere slaytta çift-çubuk ince şerit bant yerleştirin. Bunun üzerine bir lamel hizalayın ve sıkıca sıvı geçirmez kanallar oluşturmak üzere slayt karşı lamel basın. Kanalların kenarları mühür 5 dakika epoksi kullanın.

Trolox Çözüm 4. Hazırlanması

1. Bir şişe içinde ~ 30 mg troloks ve 10 ml dH ₂ O koyun ve 18 saat süre ile açık havada solüsyonu karıştırmak için bir mıknatıs karıştırma çubuğu kullanmaktadır.
2. Bir 0.2 mikron filtre kullanılarak filtre edilir ve çözelti 1 M Tris bazı (pH 11)-6 ul ekleyerek pH 7'ye ayarlanır. Not: Trolox genel olarak ¹⁸ çalışmalar, tek bir molekül olarak kullanılan bir anti-yanıp sönen reaktiftir. Trolox ® solmaya hareket kısmen bozulmuş Trolox ® çözeltisi ¹⁹ içinde mevcut olan kendi oksitlenmiş türevi gelmektedir. Metanol ya da yüksek hızlı bir şekilde pH Tris Trolox ® çözeltisi içinde çözündürülmesi için yetersiz oksidasyon kaçınılmalıdır.

5. Tek molecule Görüntüleme

1. Kanala NeutrAvidin çözeltisi (0.5 mg / ml) 15 ul enjekte edilir ve T50 tampon 100 ul (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.0) ile yıkamadan önce 2 dakika boyunca bekleyin.
2. Kanalın içine DNA örneği (50-100 pM), 50 ul enjekte edilir. 5 dakika bekleyin ve T50 tampon 100 L uzakta ilişkisiz DNA durulayın. Not: DNA molekülleri, özellikle NeutrAvidin-biyotin etkileşimi yoluyla yüzeye bağlanacaktır.
3. Bir oksijen tutucu sistem ²⁰ (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox ve 500 mM NaCl) içeren bir görüntüleme tamponu ile kanal doldurun.
4. Saniyede 25 kare bilgisayara 2 x 2 binned görüntüleri (256 x 256) akışı çerçeve transfer modunda EMCCD ayarlayın.
5. Mikroskop objektif üzerinde daldırma yağ koymak, ve numune klipsler kullanılarak mikroskop sahnede akış hücresi düzeltmek. Duvara lazer yansıma şekline bakarak odağı kaba ayarlayın. Floresan im canlı görünümünü kullanarak odağı İnce ayarımonitörde yaş.
6. Üzerinde 532 nm lazer ile veri toplama başlar. Canlı görünümünü kontrol edin ve gerekirse odağı ayarlayın. En molekülleri photobleached olduğunda veri toplama durdurun.
   NOT: Bu tesiste, mikroskop kontrol ve sabit diske kaydedilmiş olarak monitörde canlı görüntüleri görüntülemek için bir laboratuvar-C yazılı programı kullanılmıştır.

6.. Görüntü İşleme ve Veri Analizi

NOT: 256 x 256 görüntülerin bir zaman serisi Cy3 ve Cy5 şiddetlerinde tek-molekül zaman izlerini oluşturmak için bir MATLAB kodu tarafından işlenir. Donör kanal ve bölünmüş görünüm görüntü alıcı kanal arasındaki pikselleri eşleştirmek için, Cy3 ve Cy5 noktalar 6-7 çifti, eşit görüş alanına yayılmış aynı molekülün her çifti, elle bir afin dönüşüm aldı, ve vardır çapa noktaları olarak bu noktalar koordinatları kullanılarak hesaplanır.

1. MATLAB komut dosyası kullanarak, tüm tek-molekül süre bakmak t izleridüşük ve yüksek FRET sinyalleri arasında şapka gösterisi çoklu geçişler. Döngüye ve unlooped durumlarını belirlemek.
   Not: FRET sinyali Cy5 yoğunluğu olarak tanımlanan (I _a) Cy3 ve Cy5 yoğunluklarının toplamı (I I _a + _d) bölünür. Unlooped hali düşük FRET değere sahip iken döngüye devlet yüksek FRET değeri vardır. Tek bir molekülden FRET sinyallerinin histogram bimodally için geri loop ve unlooping arasında dağıtılır.
2. İki monte Gauss eğrileri arasındaki kesişim belirleyerek iki dağılımları ayıran eşik bulun.
3. FRET verimliliği gibi hesaplayın ve yüksek FRET değerleri ve düşük FRET değerleri ile unlooped devletlerle döngüye durumları atayın.
4. MATLAB komut dosyası kullanarak, moleküllerin (N (t)) kümülatif sayısını analiz o döngüye (veyaveri toplama başından bu yana farklı zaman geçerse de yüksek FRET devlet) ulaştı. NOT: dsDNA molekül veri toplama başında unlooped devletin herhangi bir yapısındaki başlayabilirsiniz yana, ilmekli nüfus artış oranı ortalama döngü oranı ilk konformasyonlar üzerinden ortalama yansıtır. Üstel fonksiyonu ile N (t) takarak döngü oranı k _döngü Özü: Biphasically artarsa, o bir çift üstel fonksiyonu ile donatılmış olabilir: Bu durumda, k _döngü elde edilir: Not: Teorik olarak, bir polimer t zamanında döngüye olmadığını hayatta kalma olasılığı, tek veya çift üstel fonksiyon ¹² değildir. Üstel fitting ortalama döngü süresini elde etmek için pratik bir araç olarak kullanılır.

7. J Factor Belirlenmesi

Not: J faktörü dsDNA bir ucu diğer ucunda yaklaşık kadar konsantre edildi temsil eder. Bu döngü oranı olarak ölçülen diğer ucu bölümü ile aynı reaksiyon oranını üretecektir DNA'nın bir ucu diliminin konsantrasyonunu interpolasyonuyla belirlenebilir. Deneysel olarak, bir uç kademeli bir yüzeyi üzerinde immobilize edilir ve diğer uç kademeli bir belirli konsantrasyon ° C'de ilave edilir. Iki ucu arasındaki ölçülen bağlanma oranı k _tavlama ise, J faktörü ²¹ ile verilir . Tavlama oranı sabiti (k _tavlama = k _tavlama / C), prob konsantrasyonu bağımsızdır.

1. 30-50 pM biotin-Cy5 oligo 20 ul (Primer 3) akış iBir NeutrAvidin kaplı kanal nto. Ilişkisiz oligolarını yıkayacak 100 ul T50 ile kanal durulayın.
2. 50 nM'lik bir nihai konsantrasyonda Cy3 oligo (Primer 2) ilavesi ile kısmen 5'te tarif edildiği gibi görüntüleme tamponu hazırlayın. Kanala bu görüntüleme tampon akış.
3. Üzerinde 532 nm lazer tutarken, kısaca yüzey bağlı Cy5 Oligoların konumlarını belirlemek için 640 nm lazer açın. 640 nm lazer kapatın ve FRET sinyal izleme başlar.
   NOT: Bir yüzeye bağlı Cy5 oligo için bir Cy3 oligo hibridizasyon üzerine, Cy5 floresans FRET dan ortaya çıkacaktır.
4. MATLAB komut dosyası kullanılarak, ilişkisiz devlet (düşük yoğunluklu Cy5) başlar ama daha sonra Cy5 yoğunluk izlerinden zamanın bir fonksiyonu olarak tavlı devlet (yüksek Cy5 yoğunluğu) dönüşmesi moleküllerinin sayısını analiz.
5. Tavlı moleküllerin karşı zaman bu sayı çiziniz. Tek bir üstel fonksiyonu ile (bu eğrinin (k _anneal) elde edilmiştir.
6. Tavlama oranı ve reaktan konsantrasyonu arasında lineer teyit etmek için farklı oligo Cy3 konsantrasyonda (60, 100 ve 180 nM) bu deney tekrarlayın. Ikinci dereceden tavlama oranı sabiti (k _tavlama Özü ) Yamaç.
7. J faktör hesaplayın , K _döngü aynı tampon durumda ölçülen döngü hızıdır.

Sonuçlar

Ilmekleme çalışma için kullanılan DNA molekülleri değişken sırasının uzunluğu ve her bir diğerine tamamlayıcı olan tek şeritli çıkıntılarının bir çift yönlü bölge oluşur. 7-baz uzunluğunda olan çıkıntılar, ilmekli durumunu yakalamak için birbirine bağlandığı olabilir. Her bir çıkıntı sitidin kimya yoluyla DNA omurgada bağlantılıdır Cy3 veya Cy5 ya da içerir. Cy5-çıkıntı da hareketsizleştirme yüzeyi (Şekil 4A) için biotin-TEG (15-atom Tetra-Etilen Glikol aralayıcı) ile bağlantılıdır. Tüm bu modifikasyonl...

Tartışma

FRET göre basit bir tek-molekül deney farklı şekillerde iç DNA'ların ilmek kinetiğini incelemek için kullanılmıştır. Eğimli DNA'lar 10.5 bp'lik sarmal süresi ile aynı fazda bir 10-mer dizisini tekrar ile hazırlanabilir, ve eğrilikleri PAGE kullanılarak tahmin edilebilir. Bu dsDNAs geçici döngü stabilizasyonu sağlamak için yapışkan uçları ile tasarlanmıştır. Zamanla döngüye moleküllerin sayısındaki artıştan üstel döngü hızı ekstre edilmiştir. Kesilmiş yapışkan uç kesimleri arasındaki bağlanma oranı sabiti, J ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Küçük DNA FRAG Özü Kiti-100PR	VWR	97060-558
Akrilamid% 40 çözelti 500 ml	VWR	97064-522
Bis-akrilamid %2 (a/h) çözelti 500 ml	VWR	97063-948
GeneRuler 100 bp DNA Merdiveni, 100-1.000 bp	Fermentas	SM0241
Mini Dikey SAYFA Sistemi	VWR	89032-300
Şırınga filtresi 0.2 & mu; m CS50	VWR	A2666
Trolox	Sigma-Aldrich	238813-1G	üçlü durum söndürücü
Protocatechuic asit (PCA)	Sigma-Aldrich	08992-50MG	oksijen süpürme sistemi
Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	oksijen süpürme sistemi
mPEG-silan, MW 2.000 1 g	Laysan Bio	MPEG-SIL-2000-1g
Biotin-PEG-Silan, MW 3,400	Laysan Bio	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin Biotin Bağlayıcı Protein	İnvitrojen	A2666
Phusion Sıcak Başlangıç Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz	New England Biolabs	F-540L
Jel/PCR DNA Parçaları Ekstraksiyon Kiti	IBI Bilimsel	IB47020
Birinci sınıf düz cam mikroskop slaytları	Fisher Scientific	12-544-1
VWR mikro kapaklı cam, dikdörtgen, no. 1	VWR	48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Devridaim Soğutucu/Isıtıcı	Fisher Scientific		sıcaklık kontrolü
Objektif Soğutma Yakası	Bioptechs	150303	sıcaklık kontrolü
KMI53 Biyolojik Mikrometre Ölçüm Aşaması	Semprex	KMI53
Yüksek Performanslı DPSS Lazer 532 nm 50 mW	Edmund optik	NT66-968	Cy3 uyarma
KÜP Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Konnektör	Tutarlı	1139604	Cy5 uyarma
650 nm BrightLine Dikroik Işın Ayırıcı	Semrock	FF650-Di01-25x36	bölme dikroik
LaserMUX Işın Birleştirici, 514.5, 532 ve 543,5 nm lazerler, 25 mm	Semrock	LM01-552-25	dikroik
Brightline Floresan Filtresini birleştiren 593/40	Semrock	FF01-593/40-25	Cy3 emisyon filtresi
635 nm EdgeBasic LWP uzun geçiren Filtre, 25 mm	Semrock	BLP01-635R-25	Cy5 emisyon filtresi
EMCCD iXon+	Andor Teknolojisi	DU-897E-CS0-#BV
IX51 ters mikroskop çerçevesi	Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Yağ TIRF	Floresan
Daldırma yağı tip-F	Olympus	IMMOIL-F30CC
2 mm Çap 45° Çubuk Lens Alüminyum Kaplı	Edmund optics	54-092	minyatür ayna
1/4" Seyahat Tek Eksenli Çeviri Aşaması	Thorlabs	MS-1	minyatür ayna
ve Oslash çevirisi; 1" Akromatik İkili, ARC: 400-700 nm, f=200 mm	Thorlabs	AC254-200-A	odaklama lensi
Ayarlanabilir Mekanik Yarık	Thorlabs	VA100
Dielektrik Ayna	Thorlabs	BB1-E02
Ø 1" Akromatik Çift, f = 100 mm	Thorlabs	AC254-100-A	röle lensi
& oslash için lens yuvası; 1" Optik	Thorlabs	LMR1
Dikroik Filtre Montajı	Thorlabs	FFM1
Sabit Kafes Küp Platform	Thorlabs	B3C
ø için kinematik montaj; 1" optik	Thorlabs	KM100
N-BK7 Plano-Dışbükey Lens, & Oslash; 1", f = 40 mm	Thorlabs	LA1422-A	kolimasyon lensi
N-BK7 Plano-Dışbükey Lens, & Oslash; 6.0 mm, f = 15 mm	Thorlabs	LA1222-A	teleskop lensi
N-BK7 Plano-Dışbükey Lens, & Oslash; 6.0 mm, f = 150 mm	Thorlabs	LA1433-A	teleskop merceği