MHC kompleksi sınıf II dextramers ile direkt boyama ile beyin ve kalp kendinden reaktif CD4 T hücreleri algılamak için protokol bu raporda tarif edilmiştir. Kapsamlı bir analiz için in situ antijene özgü CD4 + T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için güvenilir bir yöntem de planlanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti
Bu makalede
Özet
Özet
Bu rapor, miyelin proteolipid proteini (PLP) 139-151 ile indüklenen deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) in situ miyelin proteolipid proteini (PLP) SJL farelerinde otoreaktif CD4 T hücrelerinin tespiti için majör doku uyumluluk kompleksi (MHC) sınıf II dekstratörlerin kullanımını ve A/J farelerde kardiyak miyozin ağır zincirli α (Myhc) 334-352 ile indüklenen deneysel otoimmün miyokardit (EAM) kullanımını göstermektedir. Dekstramerler + hücrelerin lazer taramalı konfokal mikroskop (LSCM) ile analiz edildiği iki set dekstramer reaktif kokteyli kullanıldı: EAE, IA/ PLP 139-151 dekstamerler (spesifik) / anti-CD4 ve IAs / Theiler'in murin ensefalomiyelit virüsü (TMEV) 70-86 dekstamerler (kontrol) / anti-CD4; ve EAM, IAk / Myhc 334-352 dekstramerler / anti-CD4 ve IAk / sığır ribonükleaz (RNase) 43-56 dekstamerler (kontrol) / anti-CD4. EAE farelerinden elde edilen beyin kesitlerinin LSCM analizi, CD4 ve PLP 139-151 dekstramerleri için pozitif hücrelerin varlığını gösterdi, ancak TMEV 70-86 dekstamerleri için değil, PLP 139-151 dekstamerleri ile elde edilen boyamanın spesifik olduğunu düşündürdü. Benzer şekilde, EAM farelerinden hazırlanan kalp kesitleri de Myhc 334-352'nin varlığını ortaya çıkardı, ancak beklendiği gibi RNase 43-56-dekstramer + hücrelerinin varlığını ortaya çıkarmadı. Ayrıca, 'Z' seri görüntülerinde antijene özgü CD4 T hücrelerinin frekanslarını kantitatif olarak analiz etmek için kapsamlı bir yöntem de geliştirilmiştir.
Giriş
Majör histokompatibilite kompleksinin kullanımı antijene özgü CD4 T hücrelerinin saptanması için (MHC) sınıf II tetramerler bir sorun 1-7 olmuştur. MHC sınıf II tetramerler algılama hassasiyetini artırmak için, araştırma ekibi belirlenen nesil tetramers, "dextramers" 8 yarattı. Dextramers örneğin birkaç peptide gergin, biyotinile edilmiş monomerler, bir MHC molekülüne dekstran 9 bağlı olabilir birden fazla streptavidin-fluorofor kısımları konjüge edildiği dekstran omurgalar içerir. Böylece, birkaç MHC-peptid komplekslerini içeren MHC dextramers büyük agrega çok T hücre reseptörleri (TCRler) ile etkileşime girebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik Açıklama:
Bütün hayvan prosedürleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı kurallarına uygun olarak yapılmıştır ve Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
EAE 1. İndüksiyon
- Aşama 1.1: EAE neden olmak için, aşağıdaki modifikasyonlar ile 11 'de tarif edildiği gibi peptid / tam Freund adjuvanı (CFA) emülsiyonu hazırlamak. 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 1 mg / ml' lik bir konsantrasyonda PLP 139-151 hazırlanması Aşama 1.4:. hayvan başına PLP 139-151, 100 ug içeren CFA emülsiyonun 200 ul kullanımı 1.4.1 Adım: O....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu raporda, MHC sınıf II ile doğrudan dextramers lekelemesi ile antijen spesifik, oto-reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti tarif edilmektedir. Taze kesilmiş beyin kesitleri EAE farelerden türetilen ve (kontrol) dextramers ve anti-CD4 (özel) veya TMEV 70-86 PLP 139-151 içeren kokteyller ile boyandı. Şekil 1 'de üst paneller Çift pozitif hücreler, sarı çıktı PLP 139-151 dextramers (kırmızı) ve CD4 antikoru (yeşil) ile costained beyin bölümlerinin LSCM analizini göstermektedir. Bu tip bi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
MHC sınıf I tetramerleri farklı olarak, rutin uygulamalar için MHC sınıf II tetramerleri kullanımı özellikle aktivasyon bağımlılık 6,15-17 kısmen nedeniyle düşük-yakınlık oto-reaktif CD4 T hücrelerinin, bir ön-madde frekansları numaralandırmak için, zor olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda, bu sorun, PLP'ye 139-151, MOG 35-55 ve Myhc 334 gibi Otoantijenler, bir dizi için antijen-spesifik CD4 T hücreleri algılamak için bize izin ", dextramers" denilen tetramerler nesil oluşturarak atlatılabili.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması ilan edildi.
Teşekkürler
Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği ve Çocuk Kardiyomiyopati Vakfı (SDG2462390204001) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL114669) tarafından desteklenmiştir. CM Miyokardit Vakfı, NJ tarafından verilen doktora sonrası araştırma bursu hibe bir alıcı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Mağaza 4 & # 176; C |
| MTB H37Rv özü | Difco Laboratuvarları, Detroit, MI | 231141 | Mağazası 4 & # 176; C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Mağaza 4 & # 176; C |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Mağazası 4 & # 176; C |
| Dişi A/J fareler | Jackson Laboratuvarları, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Dişi SJL/J fareler | Jackson Laboratuvarları, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok steril 1 ml şiringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok steril 3 ml şiringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Steril iğne, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Steril iğne, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3 musluk | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gazlı bez bandaj ruloları | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agaroz, Düşük Erime Noktası, Analitik Sınıf | Promega şirketi, Madison, WI | V2111 | |
| İmmünosaf normal keçi serumu | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | -20 & # 176'da saklayın; C |
| eBioscience, San Diego, CA ile | konjuge anti-fare CD4 | 12004185 | 4 & # 176 numaralı mağaza; C |
| Paraformaldehit | Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA | 19202 | 4 & # 176'da saklayın; C |
| Faramount Sulu Montaj Ortamı | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Konik tüp (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 Konik | |
| tüp (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24 oyuklu düz tabanlı doku kültürü | plakaları BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Sulu boya #2 fırçalar | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Düz Mikroskop slaytları, boyut: 3 "x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Kapak camı, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Tek kullanımlık derin tabanlı kalıp histoloji kasetleri | Laboratuvar ürünü, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Süper yapıştırıcı | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Tıraş bıçakları | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopteptit, Cambridge, MA | Mağazası 4 & # 176; C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neoptitler, Cambridge, MA | Mağazası 4 & # 176'da; C | |
| MHC sınıf II/IAs PLP 139-151 veya TMEV 70-86 dekstamerler, APC boya | °'da saklayın; C | ||
| MHC sınıf II/IAk Myhc 334-352 veya veya APC boya | 4 & # 176'da saklayın; C | ||
| Dekstran konjuge SA-APC | Immundex, Kopenhag, Demark | Mağazası 4 & # 176'da; C | |
| Steril cerrahi makas ve forseps | INOX tool Corporation | ||
| Mikro fırın | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratom | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Lazer taramalı konfokal mikroskop | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i konfokal mikroskop | Nikon Inc. Melville, NY |
Kaynaklar
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
