Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı

Özet

Tükürükten DNA ekstraksiyonu, çok az bozunma/parçalanma ile veya hiç bozunma/parçalanma olmadan, kolayca bulunabilen bir yüksek moleküler ağırlıklı DNA kaynağı sağlayabilir. Bu protokol, tükürük toplama/saklama ve DNA ekstraksiyonu için yüksek kalite gereksinimlerine sahip alt DNA tahlilleri için yeterli kalite ve miktarda olacak şekilde optimize edilmiş parametreler sağlar.

Özet

İnsan genetiği araştırmalarında tercih edilen DNA kaynağı kan veya kandan türetilen hücre dizileridir, çünkü bu kaynaklar büyük miktarlarda yüksek kaliteli DNA verir. Bununla birlikte, tükürükten DNA ekstraksiyonu, bir flebotomist masrafı olmadan çeşitli DNA tahlilleri için uygun olan ve hatta posta yoluyla elde edilebilen, çok az bozunma/parçalanma ile veya hiç bozulma / parçalanma olmadan yüksek kaliteli DNA verebilir. Bununla birlikte, şu anda, literatürde yeni nesil dizileme için herhangi bir tükürük DNA toplama/ekstraksiyon protokolü sunulmamıştır. Bu protokol, tükürük toplama/depolama ve DNA ekstraksiyonu parametrelerini, mikroarray genotipleme ve yeni nesil dizileme dahil olmak üzere en yüksek standartlara sahip DNA tahlilleri için yeterli kalite ve miktarda olacak şekilde optimize eder.

Giriş

İnsan genetik çalışmalar için yüksek kalitede DNA temininde hastalık geni bulma işlemi esastır. Kan, tükürük toplama daha pahalı olması da invaziv işlemler gerektiren ve rağmen, fonksiyonel çalışmalar için sonsuz bir DNA kaynağı veya iPSCs olarak ölümsüzleşti hücre hatları oluşturmak için tercih edilir ve hücre hatları mevcut olmadığında bazen kan DNA kullanılır. Bununla birlikte, kan elde eğitimli bir flebotomist gerektirir ve kan tükürük ¹ daha kısa bir yarı-ömrü vardır. O toplanan ve böylece iyi hastane ve laboratuvarlardan ² su toplama alanı dışında potansiyel denek havuzu artan flebotomist için gerek kalmadan posta yoluyla gönderilen olabilir beri tükürük DNA elde etmek daha az pahalı ve daha kolaydır. Konular yerine kan ^{3, 4} bir tükürük örneği vererek seçeneği varken Çalışması okullaşma gelişmiş olabilir. Miktar ve tükürük DNA kalitesi ile ilgili endişeler bizi yaygın sınırlı olabilirtükürük ^{2, 3, 4, 5} önemli miktarda elde etmedi eski yanak bezlerden yöntemleri üzerinde DNA testi için mililitre başına 4.3 x 10 ⁵ hücre ortalama ile, bütün tükürük uygunluğunu gösteren çok sayıda çalışma son çalışmalarda rağmen ^{e, 6.} mütevazı bir edebiyat microarray tabanlı yöntemler ^8, dahil genotiplendirme uygulamalar için bütün tükürük edilen DNA uygunluğunu gösteren var iken ^{9, 10,} herhangi bir çalışma inceleyen gelecek nesil dizileme (NGS). Bütün bu tükürük DNA ekstraksiyon protokolü optimize etmek için hedefe kolaylıkla ortak reaktifler ve sarf malzemeleri ile laboratuarlarda uygulanan maliyet etkin bir şekilde genetik uygulamalar için miktar ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak oldu.

Tükürük DNA ekstraksiyon çeşitli prosedürler gerektirir: 1) toplama ve depolama, 2) hücre parçalama, 3) RNaz tedavisi, 4) protein çökelmesi, 5) etanol yağış, 6) DNA rehidrasyon. Tarif edilen DNA sabitleştirme Tampon çözelti,Daha önce ^2, yeterince değişiklik olmadan fonksiyonları. RNaz tedavi ve DNA rehidrasyon adımları optimize için hiçbir girişimde bulunuldu. Kalan her adım için, verimi etkileyebilecek çeşitli değişkenler tespit edilmiştir. Her bir değişken ayrı ayrı manipüle edilmiş ve verim ve kalitesinde iyileşme istatistiksel olarak değerlendirildi. Veriminin ve / veya DNA kalitesini geliştirdiği gösterildi değişkenler için, en uygun değerleri final protokolüne dahil edilmiştir.

Protokol

NOT: Önceki tükürük örnekleri sağlayarak tüm konular Nationwide Çocuk Hastanesi, insan deneklerin tedavisi için yönergelere uygun bilgilendirilmiş onam formu.

1. Tükürük Toplama ve Saklama

1. Tükürük toplama önce, öznenin ağız konu su ile ağzınızı çalkalayın sahip ve yeme kaçınarak veya numune toplama önce 30 dakika boyunca içerek gıda veya diğer yabancı maddelerden arındırılmış olduğundan emin olun.
2. Başlığın veya borunun iç dokunmamak için emin bir DNA sabitleme tamponu ^2, 2.5 ml bir 15 ml santrifüj tüpü açın ve söz konusu tampon çözeltisi içine, tükürük 2,5 mi tükürük vardır. Not: tükürük fazla 2,5 ml Toplama DNA sabitleştirme tamponu, numune oranı yetersiz bir ikinci örnek bozulmasına yol açabilir. Çok az tükürük Toplama protokol beklenen verimi azaltacaktır. Toplama hacimleri değerlendirmek için, t tarafında sayılı geçişlerini kullanmakdiye tüp.
3. Kapağı yerine yerleştirin ve bu karışım homojen hale getirene kadar inversiyon yolu ile karıştırılır. Çalkalama gerekli değildir. Kısa süreli depolama veya uzun süreli depolama boyunca 4 ° C (> 3 ay), oda sıcaklığında örnekleri saklayın.

2. İlk Hazırlıklar ve Hücre Lizis

1. Önceki ekstraksiyon başlangıç, 37 ° C bir su banyosu ısı ve bir buz kovası hazırlar. Üç 15 ml konik santrifüj tüpleri her numune için ekstre edilmiştir gerekli olacaktır. Üç tüp, hücre ve protein topağı, son ekstre gDNA ve izopropanol ve etanol süpernatantlar tutmak için kullanılacaktır.
2. 15 saniye sonra orta hızda vorteks depolama örnekleri ve ters örnekleri birkaç kez almak.
3. Temiz bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne numune 2.5 ml koyun ve Celi Lysis Çözüm 5 ml ilave ediniz. Ters, numune 50 kez karıştırılır ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.

3. RNA Kaldırma

1. Rnaz A Sol 40 ul ekleyin100 mg / ml Katkı ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. 3 dakika boyunca buz üzerinde 37 ° C su banyosu numuneyi çıkarın ve soğuk.
   1. RNaz bir inkübasyondan sonra, protokol DNA rehidrasyon aşama boyunca 65 ° C'ye kadar su banyosu sıcaklığını arttırabilir.

4. Protein ve Lipid Kaldırma

1. Ml / 20 mg Proteinaz K çözeltisi 50 ul ters çevirme ile birkaç kez karıştırın ve 30 dakika en az oda sıcaklığında inkübe edilir. Not: Bu protokolü için olası bir duraklama noktasıdır. Ekstraksiyon tamamlanabilir kadar Proteinaz K solüsyonu ilave edildikten sonra, numune, 4 ° C'de saklanabilir. En fazla 24 saat boyunca 4 ° C 'de depolama, ekstraksiyon verimi veya DNA kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu gösterilmemiştir. Bu aşamada uzun süreli depolama henüz değerlendirilmemiştir.
2. 10 dakika boyunca buz üzerinde yüksek hızda 20 saniye, ve yeri boyunca kuvvetli bir şekilde, girdap protein çökeltme çözeltisinin 1.7 ml ilave edilir.
3. Örnekler 3000 x g'de 10 dakika ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj boyunca buz üzerinde soğutuldu sonra. Çöken proteinler, sıkı bir topak oluşturmak devam etmek gerekir. Topak sıkı değildir ya da çözelti hala puslu olması halinde, numuneler daha 5 dakika boyunca buz üzerinde soğutulabilir ve santrifüj işlemi tekrarlanır. Numuneler, bir sıkı bir pelet sağlamak için buz üzerinde tutulmalıdır.

5. izolasyonu ve saflaştırılması gDNA

1. Temiz bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine, bir pipet 5 ml izopropanol ve 20 mg / ml saf Glikojen Çözüm 8 ul.
2. Çöken protein, pelet geride bırakarak, izopropanol ve glikojen çözeltisi içeren bir tüp içine adım 4,3 gDNA ihtiva eden üst sıvıyı dökün. Üst fazı ilave edildikten sonra yavaşça 3.000 x g ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca ters Numune ve santrifüj ile 50 kez karıştırılır.
3. Temiz bir 15 ml tüp içine yavaşça süpernatant dökün. Üstte yüzen maddenin çıkarılmasından sonra,% 70 etanol, 1 ml eklebirkaç kez yavaşça sallanarak hafifçe çökelen pelet üzerine etanol taşıyarak pelet yıkayın. Tüp içinde etanol saklayın.
4. İlk yıkama, 2,000 xg'de 1 dakika ve 20 ° C için örnek santrifüj. Bu santrifüj işlemi, 4 ° C ya da 20 ° C 'de yapılabilir. Sıcaklıkta hiçbir belirgin etkisi, bu aşama için gösterilmiştir.
5. Pelet İlk yıkama ve santrifüj ardından yavaş yavaş tüpten etanol yıkama dökün ve atın, sonra adımları 5.3 ve 5.4 tekrarlayarak bir ikinci yıkama yapar.
6. İkinci yıkamadan gelen süpernatan ayrılmasından sonra, 15 dakika boyunca hava ile kuruması için pelet sağlar.
   1. Numune tamamen kurumuş olduğunda, başka bir 15 dakika boyunca hava ile kurumaya.

GDNA'sından 6. Rehidrasyon

1. Örnek kuruduktan sonra, kurutulan gDNA pelet yeniden sulanması Tris-EDTA içinde 300 ul ilave edin.
2. Bir orta hızda ve yerde 5 saniye vorteks örnek1 saat boyunca 65 ° C sıcak su banyosu.
3. Su banyosundan çıkarın ve numune, oda sıcaklığında O / N inkübe edin.
   Not: Tüm ürünler ve reaktifler Malzeme, Tablo l'de listelenen ikinci, hem de Tablo 4.

Sonuçlar

DNA, bir DNA ekstraksiyon eşleştirilmiş bir dizi gerçekleştirilmiştir ekstraksiyon için optimal parametreleri belirlemek. Tek bir tükürük örnek bölünmüş ve her bölümü belirli bir değişken için iki muhtemel değere biri ile test edilmiştir. Eşleştirilmiş her testin en az sekiz çoğaltır (örneğin, tek bir tükürük örneği ve ilk 50 ° C inkübasyon olmadan hem ekstraksiyon test etmek için bölündü) yapıldı. Toplam DNA verimi, 260/280 değeri, 260/230 değeri ve parçalanma değerlendirmek için Elektroforezlenmiş DNA görsel ...

Tartışma

Bu prosedür, büyük ölçüde DNA, kaliteden ödün vermeden, standart yöntemlere göre daha yüksek molekül ağırlıklı DNA verimini geliştirilmiş bir optimize edilmiş DNA ekstraksiyon protokolüdür. Verim çoğunda büyük etkisi ile kritik adım, yaygın olarak ¹¹ dağıtılan değildi biri hariç, burada gözden yayınlanmış herhangi bir protokol daha etanol yağış sırasında uzun bir santrifüj aşamasını kapsamaktadır adım 5.2 oldu. Bu daha santrifüj ile bağlantılı DNA kalitesinde bir değişiklik bütün tükürük koleksiyon mevcut DNA...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 ml Santrifüj Tüpleri	Fisher	12-565-268
Hücre Lizis Çözeltisi	Qiagen	158908
Proteinaz K Sigma		P6556
Protein Çökeltme Çözeltisi	Qiagen	158912
İzopropanol	Fisher	A416-4
Glikojen	EZ-BioResearch	S1003
% 70 Etanol	Fisher	04-355-305
Tris-EDTA (TE)	Fisher	BP2473-1
NaCl	Fisher	AC194090010
Tris HCl	Fisher	BP1757-100
EDTA (0.5 M) Çözelti	Fisher	03-500-506
Sodyum Dodesil Sülfat	Fisher	BP166-100
Analog Vorteks Karıştırıcı	Fisher	02-215-365
Santrifüj 5810R	Eppendorf	5811 000.010