Method Article

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

DOI:

10.3791/51718

⸱

February 21st, 2015

 ,  ,  , 
1Cytogenetics Department, Guy's & St Thomas' NHS Foundation Trust, 2Cytogenetics Department, Viapath Analytics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomik kopya sayısı varyantları tespiti için Dizi CGH G-bantlı karyotip analizi yerini aldı. Bu kağıt teknolojisi ve teşhis hizmet laboratuvarında uygulanmasını açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomik kopya sayısı varyantlarının tespiti için dizi CGH, G-bantlı karyotip analizinin yerini almıştır. Bu makale, teknolojiyi ve bir klinik tanı hizmeti laboratuvarındaki uygulamasını açıklamaktadır. Bir hastanın örneğinden (kan, tükürük veya diğer doku tipleri) ekstrakte edilen DNA, bir florokrom (siyanin 5 veya siyanin 3) ile etiketlenir. Bir referans DNA örneği, zıt florokrom ile etiketlenir. Etiketli DNA'lar karıştırılmadan ve bir hibridizasyon tamponunda yeniden süspanse edilmeden ve klinik olarak önemli alanlarda yüksek prob yoğunluğuna sahip, genom boyunca lokuslardan ~ 60.000 oligonükleotid probu içeren bir diziye uygulanmadan önce, dahil edilmemiş nükleotidleri çıkarmak için bir temizleme adımı takip eder. Hibridizasyonun ardından, diziler yıkanır, daha sonra taranır ve elde edilen görüntüler, her prob için kırmızı ve yeşil floresansı ölçmek için analiz edilir. Yazılım, her bir prob ölçümünün kalitesini değerlendirmek, kırmızı ve yeşil floresan oranını hesaplamak ve potansiyel kopya sayısı varyantlarını tespit etmek için kullanılır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu silmeler veya kromozomal bölümlerinin ekstra kopyaları zihinsel engeli, dismorfik ve congentical malformasyonlar neden olduğu uzun yıllardır bilinmektedir ve bazı durumlarda genetik sendromlara neden olmuştur 1. Ancak, bu değişikliklerin genom tespiti için 2000'li yılların ortalarında kadar mevcut tek teknoloji olamaz dengesizlik bölge ve doğasına bağlı olarak, 5-10Mb etrafında bir çözünürlüğe sahip kromozom analizi,-bantlı, G, ve hangi Malzeme, aynı bant modeli farklı bir kromozom bir bölge ile ikame edilmiş anormal kromozom algılar. Böyle situ hibridizasyon ve multipleks ligasyon-spesifik prob amplifikasyon floresan gibi yardımcı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Etiketleme Reaksiyon

  1. Kullanıma hazır -20 ° C'de plakalar ve mağaza 96 oyuklu içine üretici tarafından tavsiye edilen derişimlerde, ön kısım siyanin 3 ve 5 etiketli dUTPs, etiketlenmemiş nükleotidleri ve rastgele primerler Kullanımdan önce. Bu protokol, kısım uygun etiketli dUTP'nin 10.5 ul ve 10.5 ul etiketsiz nükleotidler ve her kuyuya rastgele primerler amaçları için.
  2. Işıksız bir ortamda, yaklaşık 1 saat süreyle 4 ° C 'de nükleotid primerler hazır kullanımlı 96 gözlü levha, çözülme.
  3. Çözülmüş sonra, ışıksız bir ortamda, en az 30 dakika, oda sıcaklığında, bu plaka dengeye getirin.
  4. En az 15 dakika boyunca 60 ° C ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir hibritlenmiş dizi Her prob kırmızı ve yeşil fluorochromes bir karışımı olarak görüntülenmiştir (Şekil 1). her bir prob için yeşil floresan sinyalinin kırmızı oranı tarayıcı tarafından ölçülür ve ilgili yazılım genomik pozisyonuna göre log2 oranları gibi, bu çizer ve dış önceden belirlenmiş sınırları düşen bölgeleri tanımlar. Elde edilen dizi izleri genomik dengesiz olarak tanımlanan bölgeler yoruma imkan vermek. Örneğin, Williams sendromu, kromozom 7'nin yakın bölgede düşük kopya tekrarlar aracılık .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dizi CGH gibi triploidi gibi dengeli düzenlenmeleri veya ploidisi anormallikleri tespit olmayacaktır. Ayrıca, düşük seviyeli mozaik dengesizlikler tespit edilemeyebilir. Ancak dizi CGH birçok sitogenetik laboratuvarda yerini aldı G-bantlı kromozom analizi daha KNV tespiti için daha yüksek bir çözünürlüğe sahip. Bu nedenle genom KNV tespiti için geçerli altın standarttır. Gelecekte yeni nesil dizileme teknolojileri ile değiştirilebilir, ancak şu anda, kendi maliyet ve teknik karmaşıklığı bu henüz klinik kullanım için iyi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların teşekkür hakkı yok.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CGH mikrodizi 8 x 60KAgilentG4126
Dizi CGH yıkama tamponlarıAgilent5188-5226
Dizi CGH hibridizasyon tamponuAgilent5188-5380
Minelute saflaştırma kitiQiagen28006
Dizi CGH etiketleme kitiEnzoENZ-42672-0000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
  2. Ahn, J. W., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Array CGHCopy Number VariantsDNA LabelingFluorescent DyesHybridization BufferOligonucleotide ProbesFluorescence ScanningLog Two RatiosGenomic Imbalance DetectionClinical Diagnostic Service

Related Articles