Test Görsel Fonksiyonu için Basit Bir Davranış Testi<em&gt; Xenopus laevis</em

Özet

Xenopus tadpoles siyah / beyaz tankın beyaz tarafında yüzme tercih laevis'den. Bu davranış, onların vizyonu tarafından yönlendirilir. Bu davranışa dayanarak, iribaşların görme fonksiyonunu test etmek için basit bir test sunuyoruz.

Özet

Kurbağa kurbağa yavruları görsel fonksiyon ölçümü, Xenopus laevis, canlı hayvanlarda körlüğe için tarama sağlar. Optokinetik yanıtı, test edilen bütün omurgalı gözlenmiştir bir görüntü-bazlı, dönüşlü bir davranıştır. Böylece kuyruk kapak tepkisi ince yanıtı kaydetmek için eğitimli bir teknisyen gerektirir alternatif tedbir olarak kullanılan Tadpole gözler küçük. Biz tadpoles siyah ve beyaz her iki taraf ile bir tank içinde yerleştirilen zaman bir tank beyaz tarafında yüzmek için tercih ettiği gerçeğine dayalı alternatif bir davranış testi geliştirdi. Burada sunulan deney, kolaylıkla ölçülür bir yanıt oluşturan bir basit, ucuz bir alternatiftir. Kurulum en Ksenopus laboratuarlarında hazır bir tripod, web kamerası ve iç içe test tanklar, oluşur. Bu makalede önce ve optik sinir kesilmesinin ardından, iribaşların davranışını gösteren bir film içermektedir. Bir gözün işlevini test etmek için, biz de Repre dahilHer göz ardışık günlerde retina axotomy uygulanan hangi bir kurbağa yavrusu bir sentative sonuçları. Gelecek çalışmalar seferde birçok iribaşların vizyonunu test etmek için bu testte bir otomatik versiyonunu gelişebilir.

Giriş

Xenopus laevis göz oluşumunu çalışmak için bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Gözleri görme gelişimi ve fonksiyonu üzerinde bir etkiye sahip test genlerin ya da yollar için en az bir hafta içinde vadeye kadar büyüyen, hızla gelişir. Görme fonksiyonunu test etmek için, optokinetik ve optomotor yanıtı sırasıyla ^1,2, Zebra balığı ve Xenopus iribaşlara kullanılmaktadır. Xenopus iribaşların gözleri zebrabalıkları nispeten daha küçük olduğundan, bu deney Xenopus'ta ince kuyruk-Flip ve göz hareketleri davranışları tespit için özel ekipman kullanımı ve eğitimli personel gerektirir. Xenopus'ta daha sağlam bir davranış, burada ³ tanımlanan bir beyaz arka plan ile bir tank içinde yüzme için tercihtir. Bir buçuk siyah / yarı-beyaz tankı bir iribaş yerleştirirken, ön-metamorfik iribaş hızla tankın beyaz tarafına yüzer. Daha önce pluripotent hücre-türevli olmadığını belirlemek için bu tahlil kullanılmıştırGözleri ⁴ fonksiyonel vardı. Burada, premetamorphic Xenopus iribaşların görme fonksiyonunu test etmek için kullanılabilir, bu tahlilde ayrıntılı bir versiyonu, rapor etmektedir.

Sadece en Ksenopus laboratuvarlarda bulunan bir monte dijital video kamera, dijital kamera yazılımı ve standart ekipman gerektirir çünkü bu deney, optomotor tepki deneyi daha basittir. Buna ek olarak, kaydedilen tepki taksitli sonuçlarına özel bir eğitim gerektirir. Bizim temsilcisi sonuçları çift retina axotomy geçirmiş iribaşların aynı grup, tankın etrafına rastgele yüzmek olduğunu göstermektedir. Ayrıca bir göz görsel tepki açısından test edilebilir gösteren temsili bir tadpole arasındaki davranış deney sonuçları dahil ettik. Deneyde sırasında elde edilen sayı eklenir ve analiz edilebilir, böylece bir çalışma dahil edilmiştir. Bu çalışma, test edilen tadpoles görsel bir tepki var olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.

Protokol

Hayvan Bakımı

Xenopus Bu çalışmada kullanılan tadpoles Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Upstate Medical University IACUC ve Kılavuz tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak, yükseltilmiş yetiştirilen ve tedavi edildi laevis.

. 1. Ön davranış Kurulum: Tadpoles

1. Bir ticari olarak temin edilebilen bir kaynaktan, döllenmiş embriyolar Xenopus elde edilir ya da daha önce tarif edildiği gibi ^6, in vitro olarak, oosit döller.
2. 20 mM KCI;; 20 mM CaCl _2; 50 mM HEPES 0.1x MMR [10 X Marc'ın Modifiye Ringer (MMR) çözelti stok (10 mM _MgCl2 içeren 60 mm Petri kapları 18 ˚ C'de nöral plak sahne embriyolar blastula yerleştirin; 1 M NaCI, 50 ug / ml gentamisin antibiyotik]), pH 7.5 'e ayarlandı ve otoklavda, oda sıcaklığında saklandı. Her gün 0.1x MMR değiştirin ve herhangi bir ölü embriyolar kaldırmak.
3. Embriyolar ~ 27 Nieuwkoop ve Faber aşamaya ulaştıklarında - 30 ^7, inci geçişantibiyotik olmadan 0.1x MMR içine E embriyolar bağırsak bakteri gelişimini sağlamak için.
4. Onlar besleme sahne (evre 45) ulaşıncaya kadar tetarlar büyür ve 0.1x MMR ile dolu 100 mm Petri kapları içine taşıyabilirsiniz. Aradan gününde 0.1x MMR değiştirerek, bir hafta boyunca her gün onlara ısırgan tozu süpernatant besleyin.
5. 100 mm Petri kabındaki Bir ​​hafta sonra, kurbağa su dolu yarım galon tankları için hayvanlar arasında hareket [0.5 g / L anlık okyanus ve 2 mM sodyum fosfat dibazik (Na ₂ HPO _4: 141,96 mw) pH 6.8]. Adım 2.4 gibi onları beslemek, ancak su bulutlu olduğunda suya haftada sadece 2-3 kez değiştirin. Işıklar 06:00 de dönüm ile 12 saat aydınlık/12 karanlık ışık döngüsü içinde hayvanları korumak.
6. Bir laboratuar tezgah underpad, en az 12 saat O / N, testten önce gibi beyaz bir yüzeye test konularla yarım galon tankı yerleştirin.
7. Aşamaları 45-50 Test tadpoles aşağıdaki aşama 3'te tarif edildiği.

. 2. Ön davranış Kurulum: Equipment

1. Davranış tahlil için laboratuara bir alanı kenara. Bu standart floresan aydınlatma ile sessiz, düşük trafik alanda olmalıdır.
2. Hayvanlar için test tankları hazırlayın.
   Iç içe, yarım galon test tankları iki kısımdan oluşur: su ve kurbağa yavrularını yapacak bir iç tank; ve görsel uyaran ile bir dış tankı.
   1. İç tank için, bir sharpie, alttan 5 cm ile dış köşelerinde küçük bir işareti yapmak; Bu su hattı (Şekil 1A, yeşil noktalı çizgi).
   2. Aynı zamanda, iç depo için, Sylgard elastomer gibi eylemsiz bir bileşik ile (köşelerinde ve merkezinde) tank içinde divets doldurun. NOT: içeri dolu değilse tadpoles bu alanlarda oyalanmak
   3. Dış tank için, beyaz kağıt mendil Şekil 1B siyah elektrik bandı ve diğer yarısı ile bir tankın dışında tam yarısını kapsamaktadır.
3. Üzerine tankları yerleştirinpikap aşılamak.
4. Kur kamerası / tripod bu test tankların üstünde olduğunu böylece. Şekil 1C 'de gösterildiği gibi, test alanı görüntülenmesine olanak vermek üzere kamera ayarlayın.
5. ⁵ yüklü QuickTime Player yazılımı ile bir bilgisayara kameranızı bağlayın. Kamerayı açın. QuickTime Player, File altında, 'Yeni Film Recording' seçeneğini seçin. Davranış tahlil kurulum hemen bilgisayarda görünür olacaktır.
6. Larva davranışını etkileyen dış ipuçları azaltmak, hem de, suyun yüzeyinde yansıyan ışığı azaltmak için tüm kurulum boyunca hafif bir pamuklu bez Örtü.
7. Emin olun 35-50 cd / m ² arasında bez önlemleri altında parlaklık.

3.. Davranış Assay

1. Kurbağa su ile adım 1.2.1 yapılan 5 cm su işareti için iç test deposunu doldurun.
2. Bir küçük net kullanarak, yavaşça iç test tankına hayvan taşımak.
3. Açık Sbilgisayar ve bir rehber olarak dış tankı kullanarak uickTime yazılım, kamera test alanı görselleştirmek ve kaydetmek mümkün olduğundan emin olun.
4. Kamera ile kağıt ve kaydın parçası üzerinde hayvan adı, tarih ve saati yazın.
5. Doğru Şekil 2'ye tankın siyah tarafı ile dış tanka test tankı yerleştirin.
6. Depoyu düzenlenmesi hemen sonra film kaydı başlatın ve 2 dakika için zamanlayıcı ayarlayın.
7. Zamanlayıcı çalar, iç deney tankı kaldırdığınızda, dış tankı 180 ° döndürmek ve dış tankın içindeki iç deney tankı yerleştirin. Sayacı başlatmak. Not: siyah tarafı şimdi diğer tarafta olmalıdır.
8. On denemenin toplamı için adım 3.7, sekiz kez daha tekrarlayın. Her deneme işaretleyerek, bir rehber olarak Şekil 2 kullanın.
9. Iki ayrı günlerde davranış testi tekrarlayın.

4. Retina Axotomy

1. Onlar tepkisiz kadar% 0.02 tricaine hayvan yerleştirinBir # 3 forseps ile bir kuyruk tutam.
2. 0.1x MMR içinde% 1 agaroz eritilir ve daha sonra bir 60 mm Petri kabı ekleyin. Hayvan kısmen sıvı içine daldırılmış, böylece sonra soğutuldu, agaroz küçük dikdörtgen çimen yapmak ve biraz% 0.02 tricaine ile çimen için iribaş ekleyin.
3. Pierce 25 G iğne ile, gözün dorsal bölgesi arkasında bir 45 derecelik bir açı ile, deri, karşı tarafta forseps karşı hayvan takviye ise.
4. Optik sinir yanındadır ven, makasla kesme özen, dikkatli, # 5 forseps ile deliğe ulaşmak optik sinir kesiyorlar ve yolumdan çevirmek. Şiddetli kanama nedeniyle kaza arteri kırpma var ise, o hızla euthanize% 2 tricaine hayvan. DİKKAT:% 2 tricaine çözüm insanlarda uyuşma neden olabilir. Bu çözüm eldiven ele alınmalıdır.
5. Hayvan kurtarmak için ameliyat sonrası, 0.7X MMR ile 100 mm Petri tabağına ve 20 dakika boyunca 50 ug / ml gentamisin içinde hayvan. Next, kurbağa su ile kurtarma tankına transfer iribaş. Hayvan dinlenme O / incelemeleri edelim
6. Ertesi sabah, (3,1-3,9 adım) yukarıda tarif edildiği gibi görsel fonksiyonunu test edin.

5.. Sonuçları Analiz

1. Çalışmalar bittikten sonra, iribaş tankın siyah tarafında kalır süreyi ölçmek.
   1. Elle zaman görüntüler ve sık sık duraklamasına izin verir yazılımını kullanarak videoları görüntülemek. Video görüntü zaman bakmak. Tank iç başarıyla dış tankın içinde yuva yapar ve kameranın görünümünde karesi alındığında bir iki dakikalık deneme, başlangıç ​​yazın.
   2. Hayvanların yüzme tankın hangi tarafı tanımlamak için iribaş gözlerinin konumunu kullanın. Iki gözü siyah / beyaz çizgiyi geçti yalnızca diğer tankın bir tarafında üzerinde geçiş tanımlayın.
2. Hayvan siyah tarafta harcıyor (sn) her bir aralığın başlangıcını ve sonunu yazmak. Pause ve yenidendoğruluğunu sağlamak için videoyu rüzgar. Her deneme içinde sn toplam.
3. Ekli Davranış çalışma kitabına girdi bu numaraları. Sayfası, hayvan saniyede toplam zaman, toplam 120 sn deneme ve uçurumdan tankın siyah tarafında harcanan zamanı çıkarılarak beyaz tarafta harcanan zamanın oranını hesaplamak [(120 - toplam saniye harcanan Siyah tarafı) / 120 sn]. 10 çalışmalarda üzerinde çalışma ortalamaları bu oran.
4. Gün arasında denemeler (P ≤ 0.05) önemli olup olmadığını belirlemek için bir öğrencinin T-testi, eşleştirilmiş iki kuyruklu dağılımı kullanın.

Sonuçlar

Önceki raporlar bu testte, Biz iribaşların gözünde ya görme işlevini test etmek için bu tahlil değişti Arkaplan Renk Tercihi Tahlili ³ premetamorphic Ksenopus tadpoles siyah / beyaz tankın beyaz tarafına yüzmeyi tercih ettiğini göstermiştir ve çağrıda Bir haftadan daha az. Bu şekilde, gözleri histolojik inceleme için toplanabilir.

Bu tepki görsel işaretlerin kaynaklanmaktadır kadar burada gösterir. Film 1, sol ve sağ panellerinde tadpoles aynı hayvandır. ...

Tartışma

Biz burada kolayca az eğitimli laboratuvar personeli tarafından bir hafta altında yapılabilir basit bir vizyon eşliğinde davranış deneyi rapor. Diğer deneyler hayvan davranışları, özel ekipman ve uzmanlık gerektiren, bu tahlil hızlı bir test görme fonksiyonunu belirlemenize olanak sağlar. Başka bir davranışsal deney, Görsel Kaçınma tahlil, TECTUM Xenopus'ta ¹⁰ görsel algı nasıl katkıda belirlemek için geliştirilmiştir. Istikrarlı bir arka plan karşı hareketli, ve böylece, basit deneyinden daha öz...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kapaklı 1/2 Galon Flex-Tank	eNasco	SB19271M	Boyut: 5-3 / 8 "x 7" x 3-3 / 4 "
Siyah elektrik bandı
Beyaz kağıt mendil
Büyük aşılama döner tablası	VWR	50809-022	Boyut: Dia 114.3 x & nbsp; Y 76,2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb alt bezi	VWR	82004-836	Boyut: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
Standart tripod		Çeşitli
iSight kamera veya web kamerası	Apple	M8817LL/A	Daha büyük kurbağa yavruları için iyidir ancak küçük olanları görmek zordur
Taşınabilir bilgisayar	Apple/PC	Çeşitli	MacOSX Lion 10.7.5 MiniDV handycam video kamera SONY DCR-HC42 çalıştıran 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo kullandık
			6 iletkenli ve 4 iletkenli alfa FireWire 400 ile bilgisayara firewire ile bağlanır;
Handycam istasyonu	SONY	DCRA-C121	Bu, firewire'ı kameraya bağlamak için kullanılabilir
QuickTime Player yazılımı	Quicktime	Sürüm 10.1
26 G İğne (5/8" uzunluk)	VWR	BD305115
Dumont #5 Forseps	Güzel Bilim Araçları	11295-10
Tek Kullanımlık
Gentamisin sülfat [50 mg / ml]	Fisher Scientific	17-528Z	RT
Sylgard 184'te saklanır silikon elastomer	Fisher Scientific	NC9644388
Anında okyanus	Doktorlar Foster ve Smith	CD-116528	Stok çözeltisi = RT'de depolanan 100 g / L
Sodyum fosfat dibazik	Sigma Aldrich	S0876	Stok çözeltisi = RT'de depolanan 0,4 M
İn vitro< / em> döllenmiş embriyolar	eNasco	LM00490MX	100 embriyo / birim