Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Summary

Fare embriyonik fibroblastı, transkripsiyon faktörleri Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc'nin zorla ekspresyonu ile düşük verimlilikte indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanabilir. Yeniden programlama reaksiyonunun nadir ara ürünleri, hücre yüzeyi yapıcıları Thy-1.2, Ssea-1 ve Epcam'a karşı antikorlarla etiketleme yoluyla izole edilen FACS'dir.

Abstract

Olgun hücreler pluripotent bir duruma yeniden programlanabilir. İndüklenmiş pluripotent kök (iPS) olarak adlandırılan bu hücreler, vücudun tüm hücre tiplerine yol açabilir ve sonuç olarak rejeneratif tıp uygulamaları için büyük bir potansiyele sahiptir. Geleneksel olarak iPS hücreleri, transkripsiyon faktörleri Oct-4, Klf-4, Sox-2 ve c-Myc'nin (OKSM) fibroblastlara viral olarak eklenmesiyle üretilir. Bununla birlikte, yeniden programlama, hücrelerin yalnızca %0.1-1'inin pluripotent bir duruma geri dönmesiyle verimsiz bir süreçtir ve bu da yeniden programlama mekanizmasının incelenmesini zorlaştırır. Yeniden programlama işleminin incelenmesine izin veren kanıtlanmış bir metodoloji, reaksiyonun nadir ara ürünlerini refrakter yığın popülasyonundan ayırmaktır. Fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) söz konusu olduğunda, biz ve diğerleri daha önce hücrelerin yeniden programlanmasının, bu hücrelerin ayrılması için kullanılabilecek hücre yüzeyi belirteçlerinin ekspresyon profilinde belirgin bir dizi değişikliğe uğradığını göstermiştik. OKSM ekspresyonunun erken aşamalarında, hücrelerin başarılı bir şekilde yeniden programlanması, fibroblast kimlik belirteci Thy-1.2'yi kaybeder ve pluripotens ile ilişkili belirteç Ssea-1'i yukarı regüle eder. Ssea-1 pozitif hücrelerin bir alt kümesinin pluripotent duruma son geçişi, yeniden programlamanın geç aşamaları sırasında Epcam'ın ekspresyonu ile işaretlenir. Burada, yeniden programlama ara ürünlerini MEF'lerin yeniden programlama kültürlerinden izole etmek için kullanılan metodolojinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Deneysel tekrarlanabilirliği artırmak için, Rosa26 lokusunun kontrolü altında bir transkripsiyonel transaktivatörü (m2rtTA) ve bir doksisiklin duyarlı promotörün kontrolü altında OKSM'yi eksprese etmek üzere tasarlanmış yeniden programlanabilir bir fare suşu kullanıyoruz. Bu farelerden izole edilen hücreler izojeniktir ve doksisiklin ilavesi üzerine OKSM'yi homojen bir şekilde eksprese eder. Yeniden programlanabilir farelerin kurulmasını, MEF'lerin türetilmesini ve ardından floresan aktive hücre sıralama (FACS) yoluyla iPS hücrelerine yeniden programlama sırasında ara ürünlerin izolasyonunu ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Introduction

Embriyonik kök (ES) hücreleri üretilmiş blastosit evresinde canlı embriyo ¹ iç hücre kütlesinden türetilmiştir. Uygun kültür koşulları altında onlar kendi kendilerini yenilerler ve pluripotent kalır. 2006 yılında Yamanaka, ve arkadaşları, olgun hücreler transkripsiyon zorunlu sentezlenmesiyle sözde uyarılmış pluripotent kök (IPS) hücrelere faktörleri yeniden olabilir göstermiştir Ekim-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc ^(OKSM) 2'dir. iPS hücreleri, ES hücreleri gibi, vücudun tüm hücre tiplerinde ortaya çıkmasına neden olabilir, ancak, ES hücreleri ³ üretilmesini çevreleyen etik sınırlamalarından muaftır. Ayrıca, iPS hücreleri kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp sözünü taşımak ve ^4,5 eleme hastalık modelleme gibi uygulamalar ve in vitro ilaç muazzam bir potansiyele sahip. Bu potansiyeli gerçekleştirmek için teknolojiyi yeniden programlanması için sırayla, nükleer yeniden programlama temel mekanizması tam anlaşılması gerekir. Ancak çabaları yeniden programlama pat incelemek içinHway hücrelerin sadece çok küçük bir sayı (% 0.1-1) reprogram gerçeği ile engellenmiştir. Başarıyla yeniden programlanması fibroblastlar yeniden programlanması, nüve Pluripotency ağının ^11-14 aktivasyon son aşamalarında bir epitel geçiş ^6-10 mezenkimal ve dahil olayların farklı bir dizi geçmesi bildirilmiştir. Bu ve diğer ^12,13,15-17 son ısıya dayanıklı kütle popülasyonundan nadir ara maddelerin ayrılması için izin veren hücre yüzeyi markerlerinin bir dizi tanımlanmıştır. Reprogramming fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) 2 hafta süren yeniden programlama işlemi ¹⁵ sırasında Thy-1.2, Ssea1 ve (diğerleri arasında) EpCAM ifadesinde değişikliklere uğrarlar. Erken MEF'lerin bir alt kümesini yeniden programlanması sırasında fibroblast kimlik belirteci (Thy-1.2) ifadesini aşağı-regüle ve ardından Pluripotency ilişkili işaretleyici SSEA-1 ¹² sağmaya başlamak. Yeniden programlama Ssea1-pozitif hücrelerin son aşamalarında ReactivBöyle Ekim-4 ^10-13,15 gibi endojen Pluripotency genleri yedik. Bu en son geçiş tespit EpCAM ekspresyonu (Şekil 1 e bakınız) ya da daha sonraki bir aşamada PECAM ¹⁵ ile hücre yüzeyi üzerinde işaretlenir. Son zamanlarda, O'Malley ve diğ. Yeniden programlama ara maddelerinin tanımlanması için Thy-1.2 ve SSEA-1 alternatif veya tamamlayıcı olarak, CD44 ve ICAM-1 kullanımını bildirmiştir. Daha önce, FACS, bu hücre yüzey belirteçleri ^15,18 göre Gün 0, Gün 3, 6. günde, 9. Gün ve 12. Gün yeniden programlama kültürlerinden yeniden programlama ara maddeleri, hem de ikinci oluşturulan iPS hücre hatları ekstre var. , Aşağıda tarif edilen yeniden programlama sistemi ve koşullar için biz homojen popülasyonları sessiz olmasına karşın, tespit ara popülasyonlarında heterojenite belirli bir ölçüde olduğu tek hücre düzeyinde göstermiştir. Bu nüfus içindeki hücrelerin yalnızca bir alt kümesini ilgili bir sonraki sta ilerleme mümkün olduğu unutulmamalıdıryeniden programlama işleminin ge ve daha önceden geniş ölçüde karakterize edilmiştir ^15,19 farklı verim, en iPS hücresi koloniler meydana getirirler. Ayrıca, bu popülasyonlarının yeniden programlama verimliliği yeniden tabaklama ve kültür koşullarına da bağlıdır. Deney tekrar elde edilebilirliğini arttırmak için, biz Rosa26 lokusunun bir kontrol ve doksisiklin tepkimeli yükseltici ^20,21 kontrolü altında bir polisistronik OKSM kaset altında bir transkripsiyon transaktivatörü (m2rtTA) ifade etmek için genetik olarak düzenlenmiş bir yeniden programlanabilir fare soyunu kullanmak. Bu fare modeli kullanarak iPS hücresi üretimi, örneğin, sayı ve viral entegrasyon sitelerinden insertlerin konumu değişkenlik hücre için hücre ile heterojen bir başlangıç ​​popülasyonunun geleneksel viral yöntemleri istenmeyen yan etkileri aşılmaktadır. İki transjenik fare soyu (OKSM, m2rtTA), Jackson Laboratory yerinde homozigus Kurucu hayvanların olarak bulunabilirlik, reprogra kurmak için çaprazlanabilir zorundammable fare modeli (bakınız Şekil 2). Bu yazıda, MEFS türetmek iPS hücrelerini oluşturmak ve FACS dönüşüm sürecinin çeşitli aşamalarında yeniden programlama ara maddeleri izole etmek nasıl ayrıntılı olarak açıklar.

Protocol

1. Gösterge Ayarlar / Reaktif Hazırlama / Genotiplendirme

1. IPS hücresi ortamı hazırlayın: 5 mi, esansiyel olmayan amino asitler, 500 ul β-merkaptoetanol, 75 ml cenin sığır serumu (FBS), 5 ml L-glutamin ile, 5 x 10 ⁵ adet Lösemi önleyici faktörü 500 mi Nakavt DMEM ortamı Supplement ( LIF). Bu yazının bağlamında kullanılan reaktif için ürün ve satın alma bilgileri için Malzemeler Listesi'nde bakınız.
2. MEF ortamı hazırlayın: 50 mi FBS, 5 ml L-glutamin, 5 mi, esansiyel olmayan amino asitler, sodyum piruvat 5 mi, 500 ul β-merkaptoetanol, 500 ml DMEM ortamı Ek.
3. , 10 ml DMSO içinde 1 ml FBS 9 ml bir araya getirilir: orta dondurma hazırlayın.
4. Hazırlama Jelatin yemekler hemen kullanımdan önce en az 10 dakika ve oda sıcaklığında aspiratı, T75 şişeye 3-5 mi% 0.1 domuz jelatin solüsyonu eklenir inkübe kaplanmıştır.
5. , 10 ml FBS, 0.1 ml PBS içinde 9.9 ml bir araya getirilir: FACS etiketleme ortamı hazırlayın.
6. GerçekleştirinRosa26 m2rtTA lokusu için genotipleme PCR: üreticinin talimatlarına uygun olarak, Taq DNA polimeraz ile reaksiyonları gerçekleştirmek. Kullanın _MgCl2 3.5 mM ve aşağıdaki 3 Primerlerin -concentration güncellendi: oIMR8052: 5 'JGK AAG AGT TTG TTK TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GTT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA JGK GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Döngü koşulları: 3 dakika boyunca 94 ° ° C; (30 saniye için 94 ° C, 1 dakika için 65 ° C, 1 dakika için 72 ° C) 35 döngü; 2 dakika boyunca 72 ° ° C; 12 ° C'de tutun. Beklenen ürün boyutu: vahşi tür alel için 650 bp ve mutant alel için 340 bp'lik.
7. Kolajen StemCa / OKSM lokusu için genotipleme PCR yapın: talimatlarına uygun olarak, Taq DNA polimeraz ile reaksiyonları gerçekleştirmek. Bu işlemde bir _MgCI2 2.5 mM, ve takip eden 3 primerlerin -concentration tadil edilmiş: Col / FRT B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', sütun / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', sütun / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Döngü koşulları: 1 dakika boyunca 95 ° C (30 saniye için 94 ° C, 45 sn için 70 ° C) 2 devir, 6 çevrim (30 saniye için 94 ° C, 45 sn için 68 ° C) ve 30 devirden (20 saniye boyunca 94 ° C, 1 dakika için 60 ° C); 5 dakika boyunca 72 ° ° C; 12 ° C'de tutun. Beklenen ürün boyutu: vahşi tip alel için 331 bp ve mutant alel için 551 bp.
8. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj tüm işlemleri yapınız.

Fare Embriyonik Fibroblastlarına 2. Nesil

1. M2rtTA soyunun karşı cinse bir üyesi ile OKSM soyunun bir hayvan arasında bir zaman ayarlı çiftleşme gerçekleştirin. Anne itlaf ve uterin boynuz çıkararak embriyonik gün 13.5 de Hasat embriyolar. Önceki uterin boynuz çıkarılması için, mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için,% 80 etanol çözeltisi ile karın bölgesini sprey.
2. (Steril fosfat tamponlu tuzlu çözeltisi, 10 ml içeren 10 cm'lik bir doku kültürü kabı içine PB uterin boynuzu aktarınS). (B Şekil 3A) bir embriyo içeren parçalar halinde uterus boynuzu kesmek için steril cerrahi sınıf makas kullanın.
3. Dikkatli rahim zarfı ve her embriyoyu çevreleyen ekstra embriyonik membranlar kaldırmak için diseksiyon (ideal bir doku kültürü kaputu içinde yer) mikroskop ve sterilize forseps kullanın. 10 ml PBS ile ayrı bir 10 cm'lik bir tabak için her embriyo transferi.
4. Embriyonun başını, bacaklarını, kuyruk ve forseps ile iç organları (kalp, karaciğer, bağırsak vb) sökerek devam edin (Şekil 3C). 1.5 ml tüp içine embriyonun başını aktarmak ve gerekirse genotiplemeye kullanılabilecek şekilde aşağı dondurma.
5. Boş bir 10cm tabak içine embriyonun gövde aktarın ve 2 dakika boyunca embriyo kıymaya iki cerrahi bıçakları kullanın. Kıyılmış embriyonun üst tripsin / EDTA çözeltisi 200 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edilir. , Ek bir 2 dakika daha devam kıyma olarak MEF ortam 2 ml ilave Tripsin, etkinleştirme ve 15 ml'lik bir tüp içine aktarılır.
6. Ayrıca mekanik nazik pipetleme doku ayırmak 1.000 ul pipet kullanın. Jelatin kaplı 10 cm tabağına aktarın ve MEF ortam ek olarak 10 ilave edin. Her iki normoksik ve hipoksik kuluçka kültürü için kullanılabilecek daha fazla bilgi için tartışmaya bakınız: edin.
7. 24-48 saat sonra plaka yoğun MEF'ler ile kaplanmış olmalıdır.
8. Alternatif olarak, hücreler daha sonra yayılır veya aşağı dondurulabilir. Hücrelerin dondurulması, kültür ortamı çıkartın PBS 3 ml Tripsin / EDTA çözeltisi ile medya ve bindirmenin izlerini kaldırmak için mi, 10 ile çanak durulayın. , 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca inkübe 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne MEF ortam ve transfer 5 ml tripsin ilave edilerek sindirim etkisiz hale getirirler. Spin ve dondurma medya 3 ml pelletini. 3 cryovials aktarın ve bir hücre dondurma kap aşağı dondurma.

MEF'lerin 3. yeniden programlanması

"ove_content> Not: Pelet, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hücreler ve tekrar programlanması için bir doku kültürü kuluçka normoksik kullanımı Bu türetme ve hipoksik koşullar altında (% 5 oksijen altında MEFS genişletmek, daha fazla bilgi için bakınız tartışma için yararlı olabilir. ).

1. Hızlı bir su banyosuna (37 ° C) düşük bir geçiş meydana gelmekteydi (P0-P1, 2-3 Milyon hücre) çözülmesi ve önceden ısıtılmış MEF ortam, 10 ml bir tüp içine aktarılmaktadır. Pelet hücreleri, 12 ml taze MEF medyada tekrar süspansiyon, bir jelatin kaplı T75 kültür kabına aktarın ve hücreler devam etmeden önce 24-48 saat boyunca kurtarmak için izin. Not: MEF'ler de doğrudan türetme sonra kullanılabilir.
2. Kültür ortamının çıkarılmasının ardından, bir tripsin / EDTA solüsyonu (37 ° C'de 3-5 dakika boyunca 3 mi) üzerine yerleştirilmesi ile, PBS ile hücreselleştirilmesi MEFS yıkayın. MEF medya 5 ml ekleyerek tripsin söndürün ve ayrıca 10 ml pipet ile Hafifkarıştırmayı tarafından hücreleri ayırmak. Hemasitometre kullanarak hücre sayıları belirleyin.
3. Reprogra içinfeatures deneyler, 6.7 x 10 ³ hücre / cm ² yoğunluklarda jelatin kaplı T75 balonlarına üzerine tohum MEF'ler (~ kap başına 0,5 Milyon hücre) 2 ug / ml ihtiva eden doksisiklin iPSC ortam içerisinde gerçekleştirilmektedir. Her bir zaman noktası için yaklaşık 2 Mio yeniden programlama ara maddelerini elde etmek için, Tablo 1 ile ilgili olarak tohumlama öneriler bakınız. Not: yeniden programlanması doksisiklin (2 ug / ml) eklenmesi ile başlar ortamı desteklenmiş
4. Ilk 6 gün ortamı yerine taze doksisiklin ile her gün iPSC ortam (T75 şişesi başına ortam 12 ml) desteklenmiştir. Yüksek hücre sayıları varsa, bu noktadan sonra bir günlük bazda medya yenilemek. Medya değişiklikleri sadece alternatif her gün yapılabilir eğer kültür hacmini iki katına.
5. Gerekli zaman noktalarında Hasat yeniden programlama ara maddeler: Bir (3 ml PBS, uygun hacimde (T75 şişeye 10 mi) ile durulanır ve Tripsin-EDTA çözeltisi ile kaplanacağı, tüm ortam ortadan saldırılarak (öneri Gün 3, 6, 9, 12) T75 şişesi). Inkübe37 ° C'de 3-5 dakika boyunca ve yumuşak pipetleme ardından iPSC ortam 5 ml ilave etmek suretiyle söndürün.
6. , Santrifüj ile hücrenin bir hemositometre ile süspansiyon (yukarıya bakınız), topak sayısı tripsin kalıntılarını gidermek için, 10 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve süpernatan aspire. , Bir kez daha Pelet hücreleri aspire yüzenler ve yeniden programlama ara maddeleri izole etmek adıma 4.1 ile devam edin. Not: yeniden programlama geçiren hücreler dondurulmuş ve bir sonraki aşamada FACS izolasyonu için çözülmüş olabilir.
7. Tam olarak yeniden programlanabilir iPS kültürleri oluşturmak için, ilave bir 4-7 gün boyunca serbest doks-iPSC ortam içinde hücreler büyür. Not: Başarıyla yeniden programlanması kültürler gün 12 kolonilerin çok sayıda içerecektir (bakınız Şekil 4). Bu süre boyunca, hala OKSM ifadesini gerektiren anormal iPS hücreleri kaybolur.
8. , Başlangıçta 15 cm x 10 ³ hücre / cm ² yoğunluğunda radyasyona tabi tutulmuş tohum MEFS: Alternatif olarak, geri kalan tam yeniden programlanması iPS kültürleri yayılmasına kadar T75 kaplanmış bir jelatin üzerine iPSC ortam 12 ml bir gün önce deneyler için ya da 6 saat şişeye.
9. Daha sonra, Tripsin-EDTA solüsyonu, 3 ml ile uzanır ve 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca kuluçkalanması, 10 ml PBS ile T75 balon durulama tüm ortam ortadan saldırılarak hücreselleştirilmesi iPS hücresi kültürleri. , Hafifçe karıştırılarak, ardından iPSC ortam 5 ml ilave etmek suretiyle, tripsin söndürün 15 ml konik tüp transferi, durması ve daha sonra 10 ml iPS ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi.
10. Işınlanmış MEF'ler (T75 şişesi) üzerine bu hücre süspansiyonu 500 ul aktarın ve kültürler için 4-5 gün büyümeye olanak sağlar. Not: Kurulmuş iPS kültürler Kriyoprezerve veya deneyleri için kullanılan olabilir. Klonal hücre soyları bir mikroskop altında ayrı ayrı ²² koloni iPSC çekme ile elde edilebilir.
11. MEF'ler için 2.8 açıklandığı gibi Cryo konfluen iPSC kültürleri korumak.

4. Antikor etiketleme

1. Içinde, Bölüm 3 hazırlandığı gibi yeniden programlama kültürlerin süspanse hücre pelletleri,Antikorları ile takviye edilmiş FACS etiketleme medya (1, anti-Thy-1.2 pasifik mavi: 400, anti-SSEA-1 biotin 1: 400 ve anti-EpCAM Fitc 1: 400). 5.000.000 hücre başına takviye işaretleme karışımı 200 ul kullanın ve buz üzerinde inkübe edilir.
2. 10 dakika sonra yavaşça buz üzerinde bir 10 dakika daha tekrar süspansiyon hücreleri inkübe etmek ve tüp dokunun. Tüp başına soğuk PBS 10 ml ekleyin ve aşağı doğru döndürün.
3. 5.000.000 hücre başına: her bir tüp için (200 1) 1 ul streptavidin-PeCy7 ile takviye edilmiş ortam etiketleme 200 ul hazırlama lekelenmesine. Hücreler pelet sonra, dikkatli bir şekilde Streptavidin PeCy7 ile takviye edilmiş ortam etiketleme uygun bir hacminde tekrar süspansiyon ve süpernatan aspire.
4. , Tekrar süspansiyon buz üzerinde bir 10 dakika bekletilir, tüp başına soğuk PBS 10 ml ekleyin, aşağı spin ve aspire süpernatant için dokunun, 10 dakika boyunca buz üzerinde hücreleri tutun.
5. Etiketleme ortam içinde yeniden süspanse hücre topakları, yaklaşık 1 x 10 ⁷ hücre / ml 'de propidyum iyodür (PI) (2 ug / ml) ile desteklenmiş. 70 mikron süzgeç vasıtasıyla süspansiyonu geçerek hücre kümeleri çıkarın. Uygun bir FACS tüpü hücreleri aktarın ve buz üzerinde saklayın.
6. Bireysel antikorlar ile ayrı örnek hazırlayın (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 ve anti-EpCAM). NOT: Bu analizde kullanılan üç kanal renk telafisini gerçekleştirmek için gereklidir. Ayrıca, etiketsiz hücreleri sıralamak için gerilimleri ve kapıları ayarlamak için gereklidir. İdeal iPS hücreleri kompanzasyonu için kullanılır: ışınlanmış MEF'ler tutulan 0.5-1 x 10 ⁶ iPS hücrelerinin stoklar sıvı nitrojende cryovials depolanır. MEF'ler varlığı Thy-1.2 kanal sinyali elde etmek için gereklidir.
7. MEF'ler (bölüm 3) için tarif edildiği gibi iPS hücrelerinin kriyotüpe çözülme. Santrifüj sonrasında, etiketleme tampon 800 ul ve bu örnek 200 ul süspansiyon hücreleri etiketsiz kontrol olarak kenara ayarlanır.
8. Tazminat kontrol olarak kalan hücreleri kullanın. Üç adet 15 ml tüpler ve ek antikorlar arasında bölünür hücrelerininPacific Blue kompanzasyon kontrolü: Anti-Thy-1.2 Pacific Blue antikor 0.5 ul ekleyin, aşağıdaki gibi. Fitc dengeleme borusu: anti-EpCAM-FITC antikoru 0.5 ul ekle. Pe-Cy7 kompanzasyon kontrolü: Anti SSEA-1-Biyotin antikor 0.5 ul.
9. , 10 dakika boyunca buz üzerinde hücreye antikor örnekleri tutmak dokunarak karıştırılması ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir.
10. 10 ml soğuk PBS ile yıkayın örnekleri, bağlanmamış antikor çıkarmak aşağı hücreleri spin ve süpernatant aspire. FACS etiketleme ortam 200 ul hücre topakları yeniden süspanse.
11. Anti-SSEA-1-Biyotin etiketli örnekler, bir streptavidin-PeCy7 konjugatı (200 ul hücre başına 1 ul). Etiket hücreleri birincil antikor (SSEA-1-biotin) için tarif edildiği.
12. 70 mikron süzgecinden etiketsiz kontrol de dahil olmak üzere, tüm örnekler geçmek ve PI (2 ug / ml) ilave edilmektedir. FACS tüpler hücreleri aktarın ve gereken kadar buz üzerinde tutmak.

Ara maddelerin 5. FACS izolasyonu

Not:Hücreler 405 nm, 488 nm ve 560 nm eksitasyon ve lazerler 100 um ağızlık ile bir floresan faaliyete geçen gen sıralayıcı kullanılarak sıralanır.

1. Hücre popülasyonu düzgün görüntülenmiştir böylece ileri ve yan dağılım için ayarlama gerilimleri. Enkaz dışlamak Şekil 5A belirtildiği gibi hücrelerin etrafında bir kapı çizin. Not: hücre sıralayıcı gerilimlerin doğru kurmak karmaşık olabilir ve deneyimli bir FACS operatörü gerektirir.
2. FSC alanına karşılık Kullanımı İleri saçılım (FSC) yüksekliği agrega (Şekil 5B) dışlamak için.
3. PI negatif canlı hücreleri (Şekil 5C) üzerinde kapısı FSC karşı PI kanalı gözünüzde canlandırın.
4. PB, FITC / GFP, Pe-Cy7, flüoresan kanalları için gerilimleri ayarlamak için, etiketlenmemiş hücreleri kullanır. İdeal olarak ilgili kanala alt ucunda hücre popülasyonu yerleştirin.
5. Alt fraksiyon yeniden programlama kült Şekil 6A, B'de gösterildiği gibi etiketsiz kontrol hücreleri ile kapı ayarlama3. gün, 6 içine ures ve 9 popülasyonlar: SSEA-1 / Thy-1.2 + hücreler; SSEA-1 / Thy-1.2 ila hücreleri; ve yeniden programlama SSEA-1 + /-Thy 1.2 ila hücreler aracılık etmektedir.
6. Ayrıca Gün 9 SSEA-1 subdivide + / Thy-1.2- fraksiyon Fitc beneği karşı Pe-Cy7 kullanarak; Sse-a1 + / EpCAM + hücreleri ve SSEA-1 + / Epcam- hücrelerinin etrafında kapıları çizin. Şekil 6C'de, D'de gösterildiği gibi, etiketlenmemiş kontrol hücreleri ile kapıları ayarlayın.
7. İstenilen subpopülasyonunun (MEF'ler temsilcisi FACS profilleri, 3. Gün / Gün 6 / Gün 9 / Gün 12 kültürler ve iPS hücreleri için bakınız Şekil 7) sıralamadan önce iPS hücre medya (1-2 ml) ile uygun toplama tüpleri önceden doldur.
8. FACS sıralama protokolü üretmektedir göre gerçekleştirin.
9. FACS izole edildikten sonra moleküler profilleme (RNA / protein çıkarılması, kromatin immunoprecipitation, DNA methylome analizi vb) hücreleri gönderin. Alternatif olarak, çeşitli hücre fraksiyonları kültürlenebilir.

Results

E13.5 fare embriyo diseksiyonu, ayrıştırma ve sonra kaplama, 10 cm çanak yaklaşık olarak 1 ila 2 gün içinde confluency ulaşması bekleniyor. Kültür uygun cellularized edilmemiş dokusunun bir kısmı yapışkan parçalarını almak için bu aşamada, normaldir. Bu pasaj sonra kaybolur.

Doksisiklin indüksiyon üzerine, yeniden programlanması MEF'ler farklı morfolojik değişikliklere uğrarlar. Yaklaşık 6 gün, erken koloni gibi yamalar (Şekil 4C) ortaya başlamalıdır. Bu kültürde daha sonra boyutu büyümeye devam edecektir (Şekil 4D, E). İyi bir yeniden programlama deneyi ilk olarak 5 x 10 ⁵ hücre (Şekil 4E) ile tohumlanmış ve T75 500> 'de koloniler sonuçlanmalıdır. Oluşturulan iPS kültürler karakteristik kubbe şeklindeki sömürgelere sahip ve çoğunlukla farklılaşmış hücreleri (Şekil 4F) yoksun olmalıdır. IPS kültürlerdeki Buldukça, ek PasajlanmasıRes farklılaşmamış / kısmi olarak yeniden programlanması hücreleri çıkarmak için gerekli olabilir; hücrelerinin konfluent şişe ışınlanmış MEF'ler bir besleyici tabaka üzerine 1:10 oranında ayrılabilir.

Yukarıda zikredildiği gibi, yeniden programlama esnasında morfolojik ve moleküler değişikliklere Thy-1.2, SSEA-1 ve sonuçta EpCAM (Şekil 7A-F) için FACS profillerinde değişiklikler yansıtılmaktadır. MEF'ler Thy-1.2 için ağırlıklı olarak pozitif ve diğer belirteçleri negatif ise, daha önce ^12,15 bildirdiği gibi, 3. Gün kültürler zaten oldukça farklı görünüyor. Hücrelerin büyük bir bölümü Thy-1.2 sentezlenmesini ve bu Thy-1.2 negatif hücrelerinin çok küçük bir alt kümesini SSEA-1, bir zaman noktası için ara gerçek tekrar programlanması için pozitif olmuştur aşağı regüle başlamıştır. Gün 3 kültürleri elde edilebilir yeniden programlama ara-sayısı yüzdesi olarak çok değişken olan SSEA-1 + /-Thy 1.2 ila süresi viabl 1-10% arasında bir aralık içinde yer alırE hücreleri. 6 ve 9 gün SSEA-1 + hücrelerinin artan oranı üzerinde, genellikle de% 10'un üzerinde, tespit edilebilir. 12. günde de EpCAM pozitif tespit edilebilir etiket SSEA-1 pozitif hücrelerinin bir alt civarında. Değişkendir ve genellikle tüm canlı hücrelerin sadece% 2-4 aralığında bulunan SSEA-1.2 + / + hücrelerinin EpCAM yüzdesi olarak 12 gün kültür, 3 gün kültürler gibi, ara bağların arıtılmasına bir darboğaz temsil eder. Tablo 1'de sunulmuştur yeniden programlama ara beklenen sayısı sadece kaba bir yaklaşım olarak hizmet vermektedir. Kurulmuş niyetli iPS hücre kültürleri SSEA-1 ve EpCAM için güçlü pozitif olacaktır.

Yeniden programlama yolunun sırasında Şekil 1. Yüzey işaret değişikliği: fibroblast kimlik belirteç Thy-1.2 Aşağı düzenleme up-regülasyonu ile takipSSEA-1. Pluripotent devlete karşı SSEA-1 pozitif hücrelerinin bir alt kümesi geçiş günün 12 civarında EpCAM iktisap ile gösterilir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. yeniden programlanabilir fare modelinin şematik gösterimi:. M2rtTA ifade her yerde bulunan bir aktif Rosa26 mahalinin kontrolü altında olduğu doksisiklin varlığında (doks) m2rtTA proteini Kolajen 1a1 bir tetrasiklin bağımlı promoteri (TetOp) bağlanmaktadır (COL1A1) Dört faktörlü kasetinin ekspresyonu ile sonuçlanan eğrisi. İki bisistronik kasetleri, bir iç ribozom giriş alanı (IRES) ile bağlantılıdır. Ekim-4 / Klf-4 ve SOx-2 / c-Myc için açık okuma çerçevesi vardır Fu kendi kapanan F2A ve E2A dizileri ile sed, sırasıyla. bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. Embriyo diseksiyon: 10 ml PBS ve (B) ile dolu bir 10 cm'lik bir tabak içerisine (A) 'Aktarım uterin boynuzu bir embriyoyu içeren parçalar halinde kesilir. (C) forseps ekstra embriyonik dokudan embriyo özgür ve baş, bacak, kuyruk ve iç organları kaldırmak kullanma. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

les / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 4 içinde tekrar programlanması morfolojik değişiklikler. Koloni gibi yamalar günden sonra 6'dan kültürlerde anlaşılacaktır. Niyetli iPSCs kubbe şeklindeki morfoloji ile karakterize edilir. (A), 0 / MEF'ler (B) Gün 3, (C), 6. gün, (D), 9 gün, (E) Gün 12, (F), hücre kültürü iPS. Ölçek çubuğu:. 200 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. Temel FACS kurulum. (A) Forward Scatter Alan lekesi karşı Side Scatter ile enkaz hariç. (B)İleri Yayılım Yüksek lekesi karşı Forward Scatter Alanlı tek hücre nüfus kapılayarak olmayan enkaz agrega hariç. (C). Blot İleri Yayılım Alanı karşı PI kanalı ile PI düşük olayları kapılayarak tek hücre nüfus ölü hücreleri dışla bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6. Yolluk. Thy-1.2 + / SSEA-1 hücreleri, Thy-1.2 ila / SSEA-1 hücreleri ve kapıları ayarlamak etiketsiz kontrol hücreleri kullanılarak (A, B)-Thy 1.2 ila / SSEA-1 + hücreler. (C) EpCAM pozitif ve negatif EpCAM hücreleri için kapıları ayarlamak için etiketsiz kontrol hücreleri kullanın. + /-Thy 1.2 ila hücreleri ayrılabilir SSEA-1 (D) 'Pozitif ve negatif EpCAM nüfusun içine EpCAM içine. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7. Thy-1.2 yeniden programlama işleminin çeşitli aşamalarında SSEA-1, FACS blotlar karşı (A). Gün 0 / MEF'ler (B) Gün 3, (C), 6. gün, (D), 9 gün, (E) Gün 12, (O) iPS hücresi kültürü.

Tablo 1. OKSM ve m2rtTA için bir embriyo heterozigus P1 MEF'ler için ekim yoğunluğu, şişeyi numarasını ve beklenen sonuçlarını Önerilen. h tıklayınızere Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Gün	T75 balonlarına sayısı 0. günde ekildi	FACS sonra Ssea1 + hücrelerinin sayısı	FACS sonra Ssea1 + / EpCAM + hücrelerinin sayısı
3	8	2.000.000
6	4	2.000.000
9	4	2.000.000
12	10	10 milyon	2.000.000

Discussion

Başarıyla iPS hücrelerinin içine MEFS yeniden programlamak ve yüksek miktarda at yeniden programlama ara maddeleri saflaştırmak için bu genel verimliliği üzerinde bir etkiye sahip faktörlerin farkında olmak önemlidir. Özellikle FBS toplu zararlı bir etkiye sahip olabilir iPS ortam olarak desteklenmesi için kullanılır. Genel olumlu deneyimleri Embriyonik kök (ES) hücre nitelikli FBS ama ucuz bir alternatif tanımlamak olabilir satıcılarının çeşitli serumların toplu test ile yapıldı.

Yeniden programlama verimliliği etkiler MEF'ler ^15,20 genotip bir başka faktör. OKSM ve yeniden programlayın yok m2rtTA odağı homozygousity birinde veya daha yüksek yeniden programlama verimliliği hem loci sonuçları için farenin heterozigot (het) türetilen MEF'ler rağmen. Het / het (Tablo 1'de verilen rakamlar het / het hayvanlar için olduğunu unutmayın). Bir erkek homo / homo hayvan tanımlanan nadir vesilesiyle, birden m2rtTA kadın ile çiftleşme harem kurulabilir. Bu haçlar tüm yavrular sırasıyla OKSM / m2rtTA lokuslarına / homo het edilecektir. Yetiştiriciliği için küçük fareler (6-15 haftalık) kullanıldığında büyük yavrular elde edilir Buna ek olarak, litre hızla genotipleme tavsiye edilir.

Ayrıca, yeniden programlama için düşük geçit MEF'lerin kullanımı ²³ vurgulandı. MEF'ler bir Normoksik doku kültürü inkübatör türetilmiştir ve genişletilmiş olsaydı şiddetle sadece Ancak geçişi 2. bu hücrelerin kullanmanızı öneririz, deneyci MEF'lerin türetme ve genişleme için bir düşük oksijen inkübatör erişimi (% 5 oksijen) varsa, hala iyi sonuçlar ²³ verecek 3 gibi yüksek bir pasaj numaraları.

Durumda, deneyci yeniden programlamayla ilişkili sorunlarla karşılaştığında, belirtildiği gibi, en olası açıklama doks Ayrıca, yanlış farelerin genotip veya iPS hücresi üretimi için elverişli değildir FBS, kullanım sırasında yüksek geçit sayılardır. Ancak, nadir durumlarda biz MEF'ler ideal şartlarda bile yeniden programlamak mümkün olmadığını gözlemledik. Bu durumlarda m2rtTA açık okuma çerçevesi içinde spontan olarak de novo silme en önemli nedeni olarak tanımlanmıştır.

Bu metodoloji başarıyla manyetik hücre izolasyonu (MACS) üzerinden SSEA-1 + arabileşikleri ayıklamak için uyarlanmıştır. MACS kullanarak, belli bir zaman bir avantaj vardır, ancak, SSEA-1 + hücre toplumların saflık hücreleri oluşturabilecek yönlendirilmiş Deneyin tipine bağlı olarak yaklaşık% 80-90, daha çok% 95 den fazla, indirgenir bir sorun. Bu durumda, bir seçenek SSEA-1 + / + ve EpCAM SSEA-1 + / Epcam- hücrelerine saflığı ve / veya parçası bunları artırmak için FACS ile ve ardından SSEA-1 + hücreleri zenginleştirmek için MACS kullanmaktır.

Belirtilen protokol ve fare modelinden elde edilen iPS hücreleri olduğu ve etkili bir şekilde, pluripotent kimerik hayvanların tüm dokularına ^15,20 katkıda gösterilmiş olmasına rağmen "> tamamen tetraploit olarak tamamlanması yoluyla bu iPS hücrelerinin oluşan embriyolar üretme yönünde azaltılmış kapasite olmuştur ²⁴ gösterdi. Dlk-Dio3 gen kümesinin bir metilasyon modelleri, altta yatan neden ²⁴ olarak tespit edilmiştir. Bununla birlikte, yeniden programlama sırasında ortama 50 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda, bir askorbik asit ilaveli tetraploit tamamlama yetkili iPS hücrelerini ²⁴ üretecektir. Alternatif bir yeniden programlanabilir fare modeli, daha da askorbik asit tedavisinin ²⁵ yokluğunda, tetraploid yetkili iPS hücrelerini üreten bir farklı bir stoikiometride yeniden programlama faktörleri ifade etmek için kullanılabilir olduğunu hatırlatırız. Ancak, eller hücrelerindeki en önemli ölçüde daha düşük bir frekans göre bu soy reprogram ikinci Burada kullanılan fare modul.

Bu yazıda anlatılan metodoloji, nüfusun refrakter dökme gelen yeniden programlama ara ayrılmasını sağlar ve örneğin incelemek ve profil için bir fraksiyone nüfusu kullanmak zorunda eski sınırlamaları kaldırarak, yeniden programlama sürecini anlamak için değerli bir araç (olarak görülmelidir refrakter hücrelerden yüksek sinyal gürültü). Burada tarif edilen antikor kombinasyonu, ancak bu ek-hücresi yüzey işaretleyicileri daha yüksek bir saflıkta elde edilmesine olanak sağlamaktadır ara maddeleri gelecekte ortaya çıkarılan edilmesi mümkündür, yüksek saflıkta fare hücrelerinden elde ara ürünlerin izolasyonunu sağlar. SSEA-1 ifade insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin bir özelliğidir değildir ve bu bu protokolü olarak insan kaynaklı hücreler yeniden programlanması hakkında kullanılamaz unutmayın. Sonuç olarak, bir kere bu anlatılan yöntemle izole yeniden programlama ara-sentezleme profilin'e dahil olmak üzere moleküler analiz için kullanılabilirg, kromatin immünopresipitasyon, methylome analizi ve protein denemeleri.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-fare CD90.2 (Thy1.2) Pasifik Mavisi	eBioscience	48-0902-82
Anti-İnsan/Fare SSEA-1 Biotin	eBioscience	13-8813
Streptavidin PE-Cy 7	eBioscience	25-4317-82
Anti-Fare CD326 (Epcam) Fitc	eBioscience	48-5791-82
Sodyum piruvat	Yaşam Teknolojileri	11360-070
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)	Yaşam Teknolojileri	11140-050
Embriyonik Kök Hücre nitelikli Fetal Sığır Serumu (FBS)	Yaşam Teknolojileri
Tripsin-EDTA (% 0.25)	Yaşam Teknolojileri	25200-056
GlutaMAX	Yaşam Teknolojileri	35050-070
β-Merkaptoetanol	Yaşam Teknolojileri	21985-023
DMSO (Dimetil Sülfoksit)	Sigma-Aldrich	D8418
Penisilin/streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140
Propidium İyodür çözeltisi (PI)	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Domuz derisinden elde edilen jelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Doksisiklin hiclate	Sigma-Aldrich	33429-100MG-R ve nbsp;
Lösemi İnhibitör Faktör (LIF)	Millipore	ESG1107
DMEM Yüksek Glikoz	Yaşam Teknolojileri	11960-044
DPBS (Dulbecco'nun fosfat tampon tuzlusu)	Yaşam Teknolojileri	14190-144
Nakavt DMEM	Yaşam Teknolojileri	10829-018
Işınlanmış MEF'ler	Yaşam Teknolojileri	S1520-100
75 cm2 Doku kültürü şişeleri	Corning/BD Biyobilim
15 ml santrifüj tüpleri	Corning/BD Biyobilim
50 ml'lik santrifüj tüpleri	Corning/BD Biyobilim
Tek kullanımlık cerrahi bıçaklar	Clifford Hallam	SM0501
Kriyojenik şişeler	Corning/BD Biyobilim
70 ve mikro; m Hücre süzgeci	BD Biyobilim	352340
Taq DNA Polimeraz	Yaşam Teknolojileri	10342-020