Yöntem makalesi

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

DOI:

10.3791/51737

⸱

15 Eylül 2014

 ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz, gelişimsel biyolojiden elde edilen bilgilere ve yayınlanmış araştırmalara dayanarak, hem insan embriyonik kök hücrelerinden hem de insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden A9 orta beyin dopaminerjik nöronlarını verimli bir şekilde üretmek için optimize edilmiş bir protokol geliştirdik, bu da Parkinson hastalığı için hastalık modellemesi ve hücre replasman tedavisi için yararlı olacaktır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Substantia nigra pars compacta'daki (A9 DA nöronları olarak da bilinir) dopaminerjik (DA) nöronlar, Parkinson hastalığında (PD) kaybedilen spesifik hücre tipidir. PD için rejeneratif hücre replasman tedavisi için insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) A9 DA nöronlarının türetilmesine büyük ilgi vardır. Nöral gelişim sırasında, A9 DA nöronları, merkezi sinir sisteminin ventral orta hattında bulunan taban plakası (FP) öncülerinden kaynaklanır. Burada, hPSC'lerin embriyonik DA nöron gelişimini taklit eden A9 DA nöronlarına kademeli olarak farklılaşması için kültür koşullarını optimize ettik. Protokolümüzde, önce küçük moleküllü bir yöntem kullanarak hPSC'lerden FP öncü hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini tanımlıyoruz ve daha sonra FP hücrelerini birkaç ay boyunca in vitro olarak korunabilen A9 DA nöronlarına dönüştürüyoruz. Bu verimli, tekrarlanabilir ve kontrol edilebilir protokol, normal kişilerden ve PD hastalarından insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (hiPSC'ler) iyi çalışır, burada in vitro hastalık modellemesi ve ilaç taraması ve PD için in vivo hücre nakli tedavisi gerçekleştirmek için A9 DA nöronları türetilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopaminerjik (DA) nöronlar midbrain, hipotalamus, retina ve bulbuslarında dahil olmak üzere birçok beyin bölgelerinde bulunabilir. Ön beyinde striatum projelendirme ve ekstrapiramidal motor sistemini oluşturarak substantia nigra pars compacta (SNpc) kontrol davranış ve hareket A9 DA nöronlar. A9 DA nöronların dejenerasyonu ikinci en yaygın insan nörodejeneratif bir hastalıktır ve şu anda çaresiz Parkinson hastalığı (PH) yol açar. Hücre replasman tedavisi PH 1 tedavisi için en umut verici stratejilerinden biridir, bu nedenle, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve hem de dahil olmak üzere, insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) den A9 DA nöronlar kaynaklanan büyük bir ilgi olmuştur Son insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs).

Pek çok araştırma, çeşitli yöntemler kullanarak hPSCs adlı A9 DA nöronları türetmek için çalıştı. Bir sinir yoluyla erken raporlar tüm oluşturulan DA nöronlarırozet ata sahne. Ile birlikte bir ya da 2-4 hafta, L. ve arkadaşları Studer'den ve başarılı bir şekilde sinir rozet üretmek için HESC uyarılan üç grup için dış büyüme faktörleri olmaksızın MS5 2 veya PA6 3-5 stromal hücreleri ile ortak-kültür. Daha sonra mekanik diseksiyon ya da daha fazla farklılaşması için enzimatik sindirim yoluyla bu rozetler zenginleştirilmiş. Diğer raporlarda, araştırmacılar kültür farklılaşmasını 6-9 yüzen embriyoit vücuda sinir rozetler (EB) oluşturulur. Daha sonra, araştırmacılar, ekstra hücresel matriks üzerinde HESC ve hiPSCs kaplama bir tek tabakalı göre ayırt etme yöntemini 10,11, in vivo oluşturulan embriyonik gelişme DA nöron taklit DA nöronlara hPSCs farklılaşmasını indüklemede kültür içinde değişik büyüme faktörleri ilave . Bütün bu çalışmalar, DA nöronlarının bazı özelliklere sahip tirosin hidroksilaz (TH) -expressing hücreleri elde edilmiş olmakla birlikte, bütün farklılaşma süreci, zaman ve iş gücü tüketengenellikle verimsiz ve daha da önemlisi, bu nöronların A9 kimlik LMX1a ektopik ifade 12 ile biri dışında en çalışmalarda gösterilmiştir değildi. Son zamanlarda, yeni bir taban plakası (FP) tabanlı protokol daha sonra DA nöron potansiyeli ile FP öncüleri ilk farklılaşma erken dönemde sonik kirpi ve doğal Wnt sinyal yollarının aktivasyonu tarafından oluşturulan edildiği 13-16, geliştirilen ve oldu Bu FP hücreler daha fazla DA nöronlarının için belirlenmiştir. Bu protokol daha verimli olmasına rağmen, hala bazı sorunlar var; Örneğin, tüm süreç farklılaşma uzun (en az 35 gün) sürer ve bağımlı besleyici hücre 15, ya da EB veya A9 kimliği 14 görülmemiştir 16 bağlıdır.

Burada, in vivo embriyonik DA nöron gelişimi ve diğer araştırmacıların yayınlanan sonuçlarına bilgiye dayalı, biz eff için kültür koşullarını optimizeHESC ve hiPSCs hem DA nöronların icient üretimi. Biz ilk olarak küçük molekül CHIR99021 ve küçük moleküller SAG ve purmorphamine ile sinyalizasyon sonik kirpi ile kanonik Wnt sinyal aktivasyonu ile FP öncül hücreleri üretilir. Bu FP hücreler FOXA2, LMX1a, Corin, OTX2 ve Nestin ifade eder. Biz sonra vb BDNF, GDNF'nin içeren büyüme faktörleri ile DA nöronlarının bu FP hücreleri belirtildi. Bunlar kalbindin 17 için ise negatif GIRK2 pozitif olarak üretilen DA nöronları hücre A9 tiptedir. Bu protokol, yüksek verimli ve yeniden üretilebilir bir besleyici hücre veya EB bağımsız vardır. Bu protokolü kullanarak, bir, ya da in vitro PH modelleme veya PH için potansiyel terapötik ajanların test için PD hastalarının hiPSCs gelen HESC veya hücre nakli çalışma için normal insanların hiPSCs daha az 4 hafta DA nöronları elde edebilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kültür Medya 1. Hazırlık

  1. Aşağıdaki birleştirerek fare embriyonik akciğer fibroblast (MEF) orta hazırlayın: 445 mi DMEM, 50 ml cenin sığır serumu (FBS) ve 5 ml 100x penisilin / ampisilin stok solüsyonu. En fazla 14 gün boyunca 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutun.
  2. Hazırlama serum ihtiva eden, aşağıdaki birleştirerek hPSC kültür ortamı: 385 ml DMEM / F12 100 mi nakavt serum değiştirme (KSR), 5 mi 100x esansiyel olmayan amino asit stok çözeltisi, 5 ml 100x penisilin / ampisilin stok çözeltisi, 5 ml 100x stok çözeltisi p-merkaptoetanol, ve 10 ng / ml bFGF. En fazla 10 gün boyunca 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutun.
  3. Aşağıdaki birleştirerek mTeSR1 serumsuz ortam hazırlayın: 400 mi mTeSR1 bazal ortam, 5x 100 mi ek, ve 5 ml 100x penisilin / ampisilin stok çözeltisi. En fazla 10 gün boyunca 4 ° C'de orta tutun.
  4. 10x kollajenaz IV stok çözeltisi hazırlayın: 0.5 gr kollajenaz IV gücünü tartmak ve50 mi DMEM / F12 ve filtre ile sterilize çözülür. Hacimde yapın ve ay boyunca -20 ° C'de stok onları.
  5. % 0.1 jelatin solüsyonu hazırlayın: güç (sığır derisi, tip B'den) 0.5 gr jelatin tartılır ve deiyonize su ile çözülür. Hafta boyunca oda sıcaklığında bir otoklav sterilize edilmiş bir çözeltisinin tutun.
  6. Aşağıdaki birleştirerek KSR farklılaştırma ortamının hazırlanması: 410 ml DMEM, 75 mi KSR, 5 ml stok çözeltisi merkaptoetanol 100 x esansiyel olmayan amino asit stok çözeltisi, 5 ml 100x penisilin / ampisilin stok çözeltisi, 5 ml 100x. En fazla 10 gün boyunca 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutun.
    NOT: KSR farklılaşma verimliliğini etkileyebilecek sürü sürü, değişir. Bu farklılaşma için en iyisini bulmak için ksr birkaç toplu test etmek daha iyidir.
  7. Aşağıdaki birleştirerek, N2 farklılaşma ortamı hazırlayın: 98 ml DMEM, 1 ml 100x N2 takviyesi ve 1 ml 100x penisilin / ampisilin stok solüsyonu. 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutunEn fazla 10 gün ° C.
  8. 10 mi 50x B27 takviyesi, 5 ml stok çözeltisi Glutamax 100x, 100x ve 5 ml penisilin / ampisilin stok çözeltisi, 480 mi, Neuro temelli vasat: Aşağıdaki birleştirerek B27 farklılaştırma ortamı hazırlayın. En fazla 10 gün boyunca 4 ° C'de filtreyle sterilize orta tutun.

MEF besleyici hücreler HESC ve hiPSCs 2. Kültür

H9 HESC WiCell Research Institute elde edilmiş ve hiPSCs Yamanaka retrovirüs aracılı iletimi yoluyla Reijo Pera laboratuarda kurulmuş faktörleri Zeiss OCT3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc 18.

  1. En az bir günlük hücre geçmeden önce, 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 1 mi,% 0.1 jelatin ilave edilerek bir jelatin hazırlık plakası ve en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Inkübasyon plakalardan aspire jelatin ve tohum sonra ışınlama 1,6 x 10 5 hücre yoğunluğunda plakaları üzerine MEF hücreleri inaktive/ Iyi MEF ortamda hücreleri saymak için Hemasitometre kullanarak.
    NOT: İsteğe bağlı olarak erken 3 gün gibi hücre geçiş önce MEF besleyiciler hazırlamak.
  3. Geçiş hücreler MEF besleyiciler kaplama bir gün sonra: hPSCs aspire orta, iyi / 1 ml hücreleri 1 mg / ml kollajenaz IV ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de kuluçkalayın.
  4. Bu kuluçka sırasında, bir kez PBS ile yıkayın, MEF besleyiciler, iyice 1,5 ml / sıcak (37 ° C), serum ihtiva eden kültür ortamı hPSC ekleyin.
  5. Farklılaşmamış kolonilerinin en plakalarından ayırmak böylece farklı koloniler bağlı olarak kaldığı, 1 saat sonra, kültür plakasının bir kaç kez dokunun. Dikkatlice yüzen koloniler toplamak ve 15 ml tüp içine aktarabilirsiniz.
  6. Yavaşça sıcak (37 ° C) DMEM / F12 ile bir kez, plakayı yıkayın ve aynı 15 ml'lik bir tüp içine DMEM / F12 aktarın.
  7. 3 dakika boyunca 179 x g'de santrifüje tüpler.
  8. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak tüpleri, orta aspire. Savaş Eklem hPSC kültür ortamı, küçük kümeler halinde onları kırmak ve onları karıştırın ve birkaç kez aşağı hücreleri pipetle.
  9. 1 yeni MEF besleyiciler üzerine hücreleri aktarın: 3-1: 6 oranı.
  10. Her 5-6 gün her gün ve geçit hücreleri orta değiştirin.

Farklılaşma için Hücrelerin 3. hazırlanması

  1. Hücre işlemınden önce en az bir gün, bir Matrigel plakaları (6 çukurlu bir levha, tipik olarak 3 kuyu) maddesinin hazırlanması. 1:40, soğuk (4 ° C) DMEM / F12 ile Matrigel seyreltin ve 6 oyuklu plakalar, oyuk başına 1 mi Matrigel ekleyin. 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca Matrıgel inkübe edin. NOT: Bir Parafilm ile Matrıgel plakaları mühür ve sürece bir sürede hafta boyunca 4 ° C'de onları stok olabilir.
  2. 4 gün geçit sonra hücrelerin (Adım 2) kullanın. Plakalardan tüm farklı koloniler çıkarın. Kültür plakası orta aspire, 5 dakika boyunca 37 ° C'de hücreler 1 mi Accutase başına ekleyin ve inkübe edilir.
  3. İnkübasyon sırasında, bir jel hazırlamak6-delikli plakalar 1 ml jelatin ile 1 ilave ederek plakaları atin. Bu tabak ve inkübatör bir gün önce hazırlanan Matrigel tabak yerleştirin.
  4. Hücreler hale geldiğinde yan-yüzer 5 dakikalık inkübasyondan sonra ya da pipet hücreler yukarı ve aşağı birkaç kez tek bir hücre içine bunları yapmak.
  5. 3 dakika boyunca 258 x g hızında tek bir 15 ml'lik tüplere hücreleri ve santrifüj toplayın.
  6. Yeniden süspanse hPSC kültür ortamı içeren serum, uygun miktarda hücreleri ve 2 uM nihai konsantrasyona kadar Thiazovivin ekleyin.
  7. 1 de, jelatin kaplı plakalar üzerine hücreleri aktarın: 30 dakika boyunca 37 ° C 'de 1 oranında ve MEF hücreleri inkübe besleyiciler kaldırın.
  8. 15 ml konik tüp hücreleri aktarın, hPSC ortamı içeren uygun serumu ekleyin ve hemositometre ile hücreleri saymak.
  9. 3 dakika boyunca 258 xg'de hücreleri santrifüj.
  10. Santrifüj sırasında, 2 uM'lik bir konsantrasyona yapmak için uygun bir ortam için mTeSR1 Thiazovivin ekleyin.
  11. Santrifüj, a sonraorta spirate ve / ml orta 1,8 x 10 5 hücre vardır, böylece Thiazovivin ile uygun mTeSR1 orta ekleyin.
  12. , Inkübatör Matrigel plakalarını çıkartın Matrigel aspire ve 6 oyuklu plakaların 1 oyuk üzerine karışık hücre 2 ml ilave ediniz.
    Not: Hücre yoğunluğu 3.6 x 10 4 hücre / yüzey alanının cm2 olmalıdır.
  13. Geri inkübatör plakaları dönmek ve hücreler 24 saat takmak edelim.
  14. 24 saat hücreleri kaplama sonra, eski orta aspire ve kuyu başına 2 ml Yeni mTeSR1 orta ekleyin ve farklılaşmasını başlamadan önce hücreleri bir 24 saat boyunca büyümesine izin.

Hücre Farklılaşma

  1. Matrıgel plakalar üzerine hücreleri replating sonra farklılaşma 48 saat başlatın.
  2. Levhasından kültür ortamı aspire, hücreler bir kez PBS ile yıkayın ve oyuk başına aşağıdaki farklılaştırma ortamının 2 ml ekleyin: 10 uM SB431542 ve 100 nM LDN-193 ile takviye KSR farklılaştırma ortamının189. Mark farklılaşma D0 olarak bu gün.
  3. D20 D0 her gün orta değiştirin.
    NOT: Bir seferde 2 günden fazla kullanım için orta hazırlayabilirsiniz.
  4. 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0.25 uM, SAG, 2 uM purmorphamine ve 50 ng / ml ile takviye edilmiş FGF8b KSR farklılaştırma ortamı: D1 ve D2 aşağıdaki ortamı kullanın.
  5. 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0.25 uM, SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml arasında FGF8b ve 3 uM CHIR99021 ile takviye edilmiş bir ortam KSR farklılaşması: D3 ve D4 aşağıdaki ortamı kullanın.
  6. 100 nM LDN-193.189, 0.25 uM, SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml arasında FGF8b ve 3 uM CHIR99021 ile takviye edilmiş% 75 KSR farklılaştırma ortamı artı% 25 N2 farklılaştırma ortamının: D5 ve D6 aşağıdaki ortamı kullanın.
  7. 100 nM LDN-193189 ve 3 uM CHIR99021 ile takviye edilmiş% 50 KSR farklılaştırma ortamı artı% 50 N2 farklılaştırma ortamının: D7 ve D8 aşağıdaki ortamı kullanın.
  8. 100 nM LDN-193189 ve 3 mcM CHIR99021 ile desteklenmiş% 25 KSR farklılaşma ortamı artı 75% N2 farklılaşması orta: Aşağıdaki D9 için orta ve D10 kullanın.
  9. 3 uM CHIR99021, 10 ng / ml, BDNF, 10 ng / ml, GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0.2 mM askorbik asit ve 0.1 mM cAMP ile desteklenmiş B27 farklılaştırma ortamının D11 ve D12 için aşağıdaki ortamı kullanın.
  10. 10 ng / ml, BDNF, 10 ng / ml, GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0.2 mM askorbik asit ve 0.1 mM cAMP ile desteklenmiş B27 farklılaştırma ortamının farklılaştırma geri kalanı için aşağıdaki ortamı kullanın.
  11. Farklılaşma yaklaşık D16, bazı Poli-L-ornitin / laminin / fibronektin hazırlık plakası. Poli-L-ornitin, soğuk (4 ° C) stok çözeltisi, 15 ug / ml PBS, gece boyunca 37 ° C'de plakaları 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 1 ml ilave edilir, ve inkübe seyreltin.
  12. , Poli-L-ornitin çözüm aspire Plakalar steril su ile 3 kez yıkanır ve bundan sonra da hava plakaları kurutunuz.
  13. Laminin stok sol sulandırmak1 ug / ml soğuk (4 ° C) ilave edilmiştir Katkı, 6 oyuklu plakaların bir oyuğuna 1 ml ilave edilir ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  14. , Laminin çözüm aspire Plakalar steril su ile 3 kez yıkanır ve bundan sonra da hava plakaları kurutunuz.
  15. , 2 ug / ml soğuk (4 ° C) ilave edilmiştir fibronektin stok çözelti seyreltik 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 1 ml ilave edilir ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  16. Parafilm ile sızdırmaz plakalar ve sürece iki hafta gibi kısa boyunca 4 ° C 'de koyun.
  17. Farklılaşma 20 gün sonra, Poli-L-ornitin / laminin / fibronektin plakalara hücreleri Replate. Aspire farklılaştırma ortamı, 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 1 ml sıcak (37 ° C) Accutase ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkalayın.
  18. İnkübasyon sırasında, kuluçka makinesi içindeki Poli-L-ornitin / laminin / fibronektin plaka yerleştirin.
  19. 5 dakikalık inkübasyondan sonra hücreler, ya da hale yukan ve aşağı doğru, birkaç kez pipet yavaşça hücreler yan-yüzertek hücre içine bunları yapmak.
  20. 15 ml konik tüp içine tek hücreleri toplamak ve genişlemeye bağlı olarak değişecektir hücre sayımı için Neurobasal orta uygun miktarda ekleme, (farklılaşma 11 gün sonra, hücreler 15-20 kat genişletebilir). Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  21. 3 dakika boyunca 258 xg'de hücreleri santrifüj. B27 farklılaşma ortamı ile aspire süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri hücre / ml konsantrasyonlarda ortamı 1 x 10 6 hücre olacak şekilde.
  22. Plakalardan aspire fibronektin, PBS ile iki kez yıkanır ve 6 oyuklu plakaların 1 oyuğuna 2 mi hücreleri ekleyin.
    Not: şarjı için hücre yoğunluğu 2 x 10 5 hücre / yüzey alanı cm2 olmalıdır.
  23. Birleşmeyen ölü hücreleri çıkarmak için 24 saat sonra orta değiştirin.
  24. Belirli bir deney için istenilen zaman noktalarında kadar her gün orta değiştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklılaşma protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. Burada yer alan farklılaşma protokolünün verimi başlangıç ​​hücrelerin durumuna dayanır. Bu nedenle, ilk ayrıştırma için tek bir hücre içine hPSCs ayrıştırma önce tüm farklı koloniler kaldırır, ve ikinci olarak, bir bütün halinde, MEF besleyici hücreler, jelatin kaplı plakalar üzerinde hücrelerin inkübe edilmesi ile, çoğu tüketir olduğundan emin olmak için önemlidir 30 dakika ve üçüncü, Matrigel plakası üzerine uygun bir yoğunlukta t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(HESC ve hiPSCs her ikisi de dahil olmak üzere), insan kök hücreleri en oluşturmak için in vitro olarak ayırt edilebilir, hepsi değilse de, daha önceki çalışmalarda 19'da gösterilmiştir DA nöronlarının da dahil olmak üzere vücut, hücre türleri. Burada, diğer laboratuarlar 14,15 embriyonik dopaminerjik nöron gelişiminde 20 den bilgi ve yayınlanmış protokollere dayalı, biz hESC ve hiPSCs DA nöronların nesil için kültür koşullarını optimize. Bu protokol tekrarlanabilir, verimli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi ve bu makalenin hazırlanması sırasındaki yardımları için Renee Reijo Pera laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. Bu çalışma California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) ortak laboratuvarı (CL-00518) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMYaşam Teknolojileri10569-010
FBSYaşam Teknolojileri26140
penisilin / ampisilinYaşam Teknolojileri15140-122
DMEM / F12Yaşam Teknolojileri10565-018
KSRYaşam Teknolojileri10828-028
Esansiyel olmayan amino asitÖmrü Teknolojiler11140-050
b-merkaptoetanolMilliporeES-007-E
bFGFR& D Sistemleri233-FB-025
mTesR1KÖK HÜCRE Teknolojileri5850
Kollajenaz IVYaşam Teknolojileri17104-019
JelatinSigma-AldrichG9391
N2 ekiYaşam Teknolojileri17502-048
B27 ekiYaşam Teknolojileri17504-044
NörobazalYaşam Teknolojileri21103-049
GlutamaxYaşam Teknolojileri35050-061
PBSYaşam Teknolojileri10010-023
Büyüme faktörü azaltılmış matrigelBD Biosciences354230
AccutaseMP Biyomedikal1000449
ThiazovivinSanta Cruz Biyoteknolojisc-361380
SB431542Tocris Biyobilim1614
LDN-193189Stemgent04-0074
SAGEMD Millipore566660-1MG
PurmorfaminSanta Cruz Biyoteknolojisc-202785
FGF8bAr-Ge D Systems423-F8-025
CHIR99021Cellagen TeknolojisiC2447-2s
BDNFAr-Ge D Sistemleri248-BD-025
GDNFAr-Ge D Sistemleri212-GD-010
TGF-beta3Ar-Ge D Sistemleri243-B3-002
Askorbik asitSigma-AldrichA4034
cAMPSigma-AldrichD0627
Fare anti insan NESTIN antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-239271/1.000 seyreltme
Tavşan anti insan OTX2 antikoruMilliporeAB95661/2.000 seyreltme
Keçi anti insan FOXA2 antikoruAr-Ge D SistemleriAF24001/200 seyreltme
tavşan anti insan LMX1a antikoruMilliporeAB105331/1.000 seyreltme
Tavşan anti insan TH antikoruPel FreezP401011/500 seyreltme
Tavuk anti insan TH antikoruMilliporeAB97021/500 seyreltme
Fare anti insan TUJ1 antikoruCovanceMMS-435P1/, 2000 seyreltme
Tavşan anti insan GIRK2 antikoruAbcamab307381/300 seyreltme
Tavşan anti insan Calbindin antikoruAbcamab250851/400 seyreltme
SantrifüjEppendorf5804

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
  4. Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
  5. Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
  6. Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  7. Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
  8. Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
  9. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
  10. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
  11. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
  12. Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
  13. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
  14. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  15. Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
  16. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
  17. Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
  18. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  19. Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
  20. Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
  21. Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
  22. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Taban Plakas Prek rs rleriA9 DA N ronlarN ral Geli immm nofloresan MikroskobiH cre K lt r MedyalarTek H cre S spansiyonuPoli L OrnitinMatrigel Kapl Plakalar

İlgili makaleler