Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Özet

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Özet

Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Kök hücreler, eşitsiz kader potansiyelli iki döl hücreleri üretmek için asimetrik bölün. Asimetrik kök hücre bölünmesi çalışmanın sağlam bir alan olmuştur yöneten mekanizmaların anlaşılması, geliştirilmesi ve hastalık onların alaka önüne alındığında. Bunlar genetik uysal ve bir kez, her saat hücre bölünmesinin ardışık mermi geçmesi için, Drosophila merkezi sinir sistemi veya neuroblasts kök hücreler, kök hücre bölünme çalışma için vazgeçilmez modellerdir. Yaklaşık 100 nöral kök hücre canlı görüntüleme çalışmaları için mikroskopi Bu model sistemi, özellikle faydalı bir hale getirir, her iki larva beyin lob her yüzeyine yakın olarak yerleştirilir. Bu çalışmada, yaygın kök hücre bölünmeleri görselleştirmek için kullanılan çeşitli yaklaşımlar gözden ve biz göreceli avantaj ve bozulmamış beyin dokularında karşı ayrışmış çalıştırırız bu tekniklerin dezavantajlarını ele. Biz de detay bizim simplified protokol canlı hücre görüntüleme için Üçüncü dönem larva ve sabit analiz uygulamaları bütün beyinleri eksplantasyona için kullanılır.

Giriş

Kök hücreleri erken gelişim sırasında hücresel çeşitlilik oluşturmak ve yetişkin dokularda hasar gören hücrelerin yerine bir farklılaşma denge ve kendini yenileme korumak. Bu homeostazının düzenlenmesi kaybı ve zararlı doku dejenerasyonu ya da tümör oluşumu ile sonuçlanabilir kök hücre popülasyonunun aşırı genişlemesini hem de önler.

Nöroblastomun (Onaylanmış) Drosophila merkezi sinir sistemi (Şekil 1A) embriyonik aşamalarında ^{1, 2} sırasında o ilk formu çok çalışılan nöral kök hücrelerdir. Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Onaylanmış iki eşitsiz kaderde hücreleri üretmek için asimetrik hücre bölünmesi (ACD) tekrarlanan mermi tabi. ACD sentrozom, çoğu hücre ^3'ün mikrotübül organizasyon merkezi olarak hareket olmayan zar organeller tarafından yönlendirilmektedir. Mitoz sırasında NB centrosomes düzenlemek ve apikal-bazal polar boyunca bipolar mitotik iğ yönlendirmekSığ ekseni. Bölünmesi NB ayrılması üzerine, kök hücre kaderini belirlemek apikal kader belirleyici ve farklılaşma belirtmek bazal kader belirleyici, eşitsiz kızı hücrelere ayrılmış olan.

Larva orta beyinde, Onaylanmış iki tür bunların sayısı, konumu, transkripsiyon faktörü ifadesi ve hücre soyu (Şekil 1A) ^4-6 ile ayırt edilebilir. I Onaylanmış en bol olan yazın ve yaklaşık 90 tanesi beyin ⁷ her optik lob ön ve arka tarafı doldurmak. Bu Onaylanmış transkripsiyon faktörü asense (Ase) ifade ve karakteristik bir kendini yenileyen NB bölmek ve bir küçük ganglion anne hücre (GMC; Şekil 1B). Her GMC iki nöron veya glia (Şekil 1B) oluşturmak için tek bir terminal bölümü uğrar. Buna karşılık, her bir optik lobun arka tarafını doldurmak sekiz Tip II NBs Ase ifadesini ^5. yoksundur. Onlar ACD geçmesibir kendini yenileyen NB ve bir ara nöral progenitör (INP) üretmek.

INP da, asimetrik 3-5 kez böler. InP rejenerasyonu ve tek GMC ⁴ üretiminde Bu bölümler bir sonuç her biri. Toplu olarak, özel NB kimliği ve GMC doğum zamansal sırası, yetişkin merkezi sinir sisteminin nöronal şaşırtıcı çeşitliliğine yol açar.

NB ACD temelini hücre biyolojisi çok canlı hücre görüntüleme tekniklerinin kullanılması ile geliştirilmiştir Anlamak. Görüntü canlı NB'ler için araştırmacılar tarafından kullanılan yayınlanan protokolleri yaygın olarak değişebilir. Genel olarak, bununla birlikte, bu yöntemler, larva beyin değişmeden kalır ya da mekanik olarak ayrışmış olup olmadığını ayırt iki genel kategoride toplanabilir. Her iki teknik araştırmacının uygulamaya bağlı olarak, farklı avantaj ve dezavantajları var.

Canlı NB hücre Divi ortaya Erken raporlarları larva beyin manuel ayrışma bir dereceye içerir. Bu protokoller detay ⁸ bulaşıyor ya da cam lamelleri Onaylanmış kısa vadeli birincil kültürleri büyümek için ayrı ⁹ beyin alay. Görüntüleme geliştirmek için, yuvarlak Onaylanmış genellikle cam slaytlar ⁸ veya agaroz pedleri ⁹ ile ya lamelleri üzerinde düzleştirilir. Düzleştirilmiş hücreler optik geliştirilmiş olmasına rağmen, bu teknikler çoğu zaman bölünme karık gerileme ve birden çok kez bölmek için yetersizlik de dahil olmak üzere, NB mitotik kusurlarına yol açar. Bu nedenle, manuel Ayrışma ve larva beyin dokusunun fiziksel bozulmasını hem içeren protokolleri genellikle sadece çok kısa vadeli (yani., Bir hücre döngü ya da daha az) uygulamaları için uygundur. Aynı şekilde, yarı silinmesine veya tamamen cam slaytlar ve lamelleri arasındaki sağlam beyinleri düzleştirme birinin bir, yaklaşık 30 dakikalık bir süre için ^10, belirli bir örnek görüntüleme harcayabilir zamanını sınırlar. Bu sınırlama, thi rağmenyaklaşımı başarıyla ^11-14 kullanılmaktadır.

Görüntü canlı için son çabalar NBs limiti izole hücrelerin fiziksel bozulma ayrışmış. Bu teknikler, birden fazla hücre bölünmesi devir için hücre kültürlerinin sürdürmek için gerekli olan uygulamalar için özellikle yararlıdır. Örneğin, el ile ayrışmış beyinlerinden alınmış dağılmış hücrelerden, kısmen uzun süreli görüntüleme ¹⁶ fibrinojen ve trombin ¹⁵ karışımından yapılan bir pıhtı gömülü olabilir. Seçenek olarak ise, eksplante beyin kimyasal olarak, enzim bir sonraki el ile bir pipet ucu ile tekrar geçirilerek kesintiye kolajenaz, ve daha sonra poli-L-lisin-kaplamalı cam alt yemekler ^{17, 18,} ​​kaplama ile ayrıştırılmış ilk olabilir. Fibrinojen ya da poli-L-lisin ya cam yemekleri Kaplama önemli fiziksel bozulma olmadan mümkün olduğu lamel onları yakın getirerek, yuvarlak hücrelerin yayılmasını eki ve hafif teşvik etmektedir. Additi yılında, bu yöntemler, hali hazırda pertürbasyon farmakolojik deneyler ¹⁸ için değiş tokuş edilebilir bir ortam içinde kültür edilmesini Onaylanmış içerir. Genel olarak, doğrudan kaplama NBs uzun vadeli görüntüleme yetenekleri ödün vermeden görüntüleme optik geliştirir dağıldılar. Son zamanlarda, ayrışmış Onaylanmış uzun vadeli kültürlemenin açıklayan bir protokol ¹⁹ ayrıntılı olmuştur.

Ancak, bu yaklaşım sınırlamaları olmadan değildir. Canlı ayrışmış Onaylanmış görüntüleme için çeşitli uyarılar vardır. Dağılmış bir hücre alanında, örneğin, uzamsal olarak sağlam bir beyin ¹ düzenlenmesiyle belirli NB soy tespit etmek zordur. Aynı şekilde, Tip II ayrışmış doku içinde Onaylanmış karşı Tip I ayırt örneğin worniu-GAL4, asense ^Gal80-20 gibi soy ajanları ya da alt tip spesifik transgenlerin, ekspresyonuna olmadan da zordur. Bu transgenler, bazı uygulamalar için oldukça yararlı olsa da, bu eski transgenler için araştırmacılar sınırı yokturUAS güçlendirici elemanın ²¹ kontrolünde preslenmiş ve daha karmaşık genetik düzenleri gerektirir. Onaylanmış mekansal ya da zamansal geliştirilmesiyle ilgili çalışmalar, bu nedenle, bir sağlam doku bağlamında in vivo görüntüleme gerektirir.

Ayrıca, ayrışmış embriyonik Onaylanmış çalışmaları önemli polarite interfaz lokalizasyonu ^{22, 23,} belirleyicilerinin için bitişik hücrelerin fiziksel temas kritik olduğunu gösterir. Bu çalışmalar tamamen izole NBs artık değişmez mitotik iğ ekseni korumak göstermektedir. Bunun yerine, bu hücreler nedeniyle belki de apikal centrosome konumlandırma ²² kaybı daha randomize mili ekseni ve ardışık GMC tomurcukları arasındaki ayrılık, geniş açıları gösterilecek. Larva NB'ler ve komşu hücreler arasındaki ilişki yaygın olarak incelenmiştir olmasına rağmen, bu larva kök hücre mikroçevresinin hücre polarite veya diğer değindiği olabileceğini dikkate değerdavranışları. Larva Onaylanmış fizyolojik içeriği muhafaza edilmesi için, tüm beyinlerinden biz görüntü ACD.

Görüntüleme ayrışmış NB'ler ile ilişkili doğal sınırlamalar dikkate alındığında, bizim laboratuvar ve diğerleri bütün larva beyinlerinden NB KHA görüntü ardışık tur protokolleri kurduk. Görüntü bozulmadan beyin teknikler genellikle doku bozulmasını veya zarar görmesini önlemek ve gaz değişimi için izin vermek için esnek bir membran ile kültür odasının bir tarafında cam sert yüzey değiştirin. Bazı yöntemler böcek kültür ortamı, serum ve on larva ²⁴ izole edilmiş organlarla yağ, askorbik asit içeren bir karışım içerisinde eksplante beyinleri montaj içerir. Bu NB hücre bölünmesini teşvik ²⁵ bilinen bir mitojen salgılayan için izole edilmiş yağ gövdeleri eklenir. Bu protokol üzerinde 3 saat için doku bütünlüğünü koruyan ve uzun süreli görüntüleme ^{24, 26-28} için uygun, bu nedenle,. Son zamanlarda, boylam açıklayan bir protokolaskorbik asit, serum ve yağ organlar mevcudiyetinde sağlam larva beyinlerin g İÇİ görüntüleme ^29, ayrıntılı edilmiştir. Doku maruz ne de hareketsizleştirilir için önemlisi, bu yaklaşım kültürleme ortam değiştirilir uygulamalar için daha az faydalı olan (örneğin, vb, ilaç araştırmaları, imüno-,.).

Bizim laboratuvar uzun vadeli görüntüleme ^{30, 31} canlı larva beyinlerinin bütün montaj hazırlanmasını kolaylaştırmıştır. Başkaları üzerinde bizim protokolüne ana avantajı basitliği: bizim gözlemler NB KHA görüntü ardışık tur için gerekli katkı maddeleri ne serum, askorbik asit, insülin, ne de yağ organları gösterir. İnsülin gibi katkı maddeleri, kök hücre bölünmesi ³² ve Drosophila yumurtalık ³³ toplu hücre göçü uzun görüntüleme için yararlı olmuştur, ancak eden görüntüleme ortamı sta basit bir karışımından oluşur, onlar, NB ACD için önemsiz görünmektedirndard böcek hücre kültürü ortamı bulaşmasını önlemek için antibiyotik-antimikotik ile takviye edilmiştir. Yeniden gaz-geçirgen veya cam alt kültür yemekleri kullanımı sayesinde, biz ardışık NB acds birkaç tur sürdürmek mümkün olmuştur. Aynı eksplante örnekler hali hazırda, bağışıklık ve sabit dokusu ile diğer işlemler için de kullanılabilir. Bu protokol, biz detay sağlam larva beyinlerinin diseksiyonu, yanı sıra canlı ve sabit hem de analiz için beyin hazırlanması.

Protokol

1.. Malzemeler Gerekli hazırlanması Üçüncü Instar Larva Brain eksplantasyona

1. Mikrodiseksiyon için gerekli araçları hazırlamak.
   1. Öncelikle her pim yuvasına bir tek diseksiyon pimi koyarak iki diseksiyon araçları (bir neşter ve bir kanca) kurma. Elle veya pense (Şekil 1C) ile sıkıca işaretçilerine sabitleyin.
   2. Yaklaşık 120 ° açı bir diseksiyon pin bükmek için eski bir çift forseps kullanın. Pim tutucu elinde olduğunda pimin üst yarısı düz yatıyor sağlamak için bir mikroskop altında bunu yapın. Bu araç, basılı veya doku yoluyla dilim bir neşter olarak kullanılacaktır.
   3. Tutun ve doku kazımak için kullanılan bir kanca içine ikinci pimi bükmek için eski bir çift forseps kullanın.
   4. Hasardan araçları korumak için bir pipet ile her kesme aletini örtün. Bakım, iyi-oluşturulmuş araçları süresiz diseksiyon için kullanılabilir. Gerektiğinde hasarlı veya deforme işaretçilerine değiştirin.
2. Orta diseksiyon hazırlayın.
   1. Bir doku kültürü kaputu, Schneider'in kültür ortamı içine antibiyotik-antimikotik ek sulandırmak. Ek dahil medyayı girdap.
   2. Takviye edilmiş ortam bir çok 5 ml'lik numuneler hazırlayın. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de tüm medya saklayın.
   3. Oda sıcaklığına kadar takviye edilen ortam içinde, 5 ml'lik bir şişe ısıtın. Steril bir 5 ml şırınganın içine orta çizin ve bir steril 0.2 mikron şırınga filtresi üzerindeki vida.
3. Diseksiyon için larva seçin. Beyin incelemek için kolay olacak gibi sürünerek üçüncü larva evresindeki seçmek için bir diseksiyon prob kullanın. İsteğe bağlı: Bir üzüm agar plaka üzerinde mevduat larvalar.
   Not: Bu erken dışarı tarama için ikinci veya birinci larva evresindeki zorlamak eğilimi olarak "ıslak gıda," ile aşırı kalabalık şişeleri veya şişeleri kullanmayın.
   Not: Bazı genetik arka genç larvaları kullanılarak gerektirecek. Bu protokol etkilemez, ama d yapmak yokissection daha zor.

Merkezi Sinir Sistemi 2. Diseksiyon

1. Tek bir cam slayt üzerine, yaklaşık 3 cm ayırarak sıcak diseksiyon medyanın iki 50 ml havuzu oluşturun. Bir havuz ince diseksiyon (Şekil 1C) için kullanılan brüt diseksiyon ve diğer için kullanılacaktır.
2. Ortam damla birine çeşitli larva aktarın.
3. Diseksiyon mikroskop larvaları ile lamel taşıyın. Larvaların ön ve arka uçlarının fark edilebilir olduğu bu tür larvaları ihtiva eden havuza büyüt.
4. Tek bir larva orta bölgeyi kavramak için forseps bir çift kullanın. Öte yandan forseps ikinci bir çift almak ve aynı bölgeye yakın larva kavramak. Yavaşça yarısında larva gözyaşı ayrı forseps iki çift çekin. Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın.
5. Bir dokuya aktararak larva vücudun posterior yarısı atmayın.
6. Bir larva yakınlaştırmak inci böyleceE anterior mouthhooks açıkça görülebilir. Üçüncü torasik ve birinci ön denticle bantlar arasındaki larva mouthhooks ters tarafta küçük bir kesik veya çentik oluşturmak için forseps iki çift kullanın.
7. Baskın olmayan el forseps ile mouthhooks kavrayın. Nazikçe bir ön-to-posterior yönde manikür soyulmaya, diğer yandan forseps kullanın. Merkezi sinir sistemi ortaya çıkıncaya kadar yavaş yavaş manikür soyulmaya devam ediyor.
8. Dokular forseps ile yırtılarak larva geri kalanından merkezi sinir sistemine izole edin. Merkezi sinir sistemini bozmayacağı dikkatli kullanın.
   Kritik adım: merkezi sinir sistemi üzerinde çekmeyin! Yırtık bir ventral sinir kablosu (Şekil 2A) veya bozuk optik loblar (Şekil 2B ve 2B ') ile hasarlı örnekleri atın.
9. Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. Için sağlıklı eksplante doku aktarınince diseksiyon aşaması için lamel orta ikinci (temiz) havuz.
10. Beyinden periferik dokuyu (örneğin, göz, kanat ve bacak diskler) temizlemek için diseksiyon pin araçlarını kullanın. Coverglass için bağ dokusu çivileme, istediği (beyin) ve istenmeyen doku arasındaki neşter kaydırın. Aynı anda testere gibi hareketlerle lamel neşter basarken hafifçe istenmeyen doku uzak kızdırmak için kanca kullanın.
11. Kritik adım: Her beyinden gelen tüm diskleri kaldırmak için yavaş yavaş ve bilinçli çalışın. Beyin morfolojisini rahatsız dikkatli kullanın. Sağlıklı bir beyin bozulmamış bir ventral sinir kablosu ve simetrik, yuvarlak optik lobu (Şekil 2C) sahip olacaktır.

3.. Canlı Görüntüleme Brain Eksplante Montaj

1. (Şekil 2B) yukarı bakacak net film ile 50 mm gaz-geçirgen kültür çanak ters çevirin. T ortamı üzerine küçük bir damla (yaklaşık 30 ul) biriktirilmesi için şırıngayı basınızyemeğin o merkezi.
2. Çanak orta damlasına kadar izole edilmiş beyinleri, bir defada, aktarın. Optik lobu altında bir beyin kaldırsanız kanca aracını kullanın. Alternatif olarak, ventral sinir kablosu uzanan aksonları kavramak için forseps kullanabilir.
3. Orta damla 5-10 beyinleri toplayın. Birçoğu gibi orta damla dibine tek beyinleri itmek için kesme pim araçlarını kullanarak beyinleri daldırın menisküs (Şekil 2E) tuzak olacaktır.
4. Yansıması için NB'ler (Şekil 3A) bağlı olarak beyin hizalamak için diseksiyon pin araçlarını kullanarak beyinlerini yönlendirin. Görüntü dorsal Onaylanmış, (membran boyunca) aşağı bakacak ventral sinir kablosu yerleştirin. Görüntü anterio-ventral NBs, (uzakta membran) yukarı bakacak ventral sinir kablosu ile beyinleri yerleştirin. Tüm ventral sinir kordonları xy düzlemi içinde aynı yöne işaret etmektedir, öyle ki beyin hizalayın.
5. Bir şırınga ya da plastik transferi p kullanipette gaz geçirgen zar üzerine 4 halokarbon (HC) yağ damlaları (yaklaşık 30 ul her) yerleştirmek için. Petrol her damla hacmi birbirine ve orta damla eşdeğer olmalıdır. Uzay yağı damla kültür ortamının damla etrafında bir lamel dört köşesine tekabül edecek şekilde. Tamamlandığında, beş damla (yağ dört damla ve merkezi orta biri damla) Batı-tarzı zar (Şekil 3B) beş yönleriyle benzer olacaktır.
6. Bu aynı zamanda tüm 5 damla vurur şekilde montajı üzerinde bir # 1.5 22 mm lamel indirin. Örneklerin arasında eşit bir basıncın korunması da bozulacak olasılığını azaltır. Yağ ve orta lamel ağırlığı altında dağıtmak üzere yaklaşık 3 dakika bekleyin. Bir ortam çapraz-benzeri şekil (Şekil 3C ve 3D) oluşturacaktır.
7. Kritik adım: ince kağıt fitil (Figu kullanarak fazla ortamı kaldırarak beyinlerinin yüzeyi üzerine lamel Alt) 3C yeniden. Diseksiyon kapsamında örnek izlerken bunu. Ortam çıkarılır olarak, lamel daha düşük olacaktır. Lamel beyinleri dokunduğunda durdurun. Aşırı-fitil bu doku bozulması ya da beyin patlamalara neden olacak gibi.
8. Görüntüleme dorsal Onaylanmış (Şekil 3E), 3.9 adıma taşıyın. Görüntüleme anterio-ventral Onaylanmış ise, lamel biraz ventral sinir kablosu ipuçları yönünde (forseps ile yavaşça onu dürtmek) taşınmalıdır. Bu görüntüleme (Şekil 3F) kolaylaştırmak için lamel ile doğrudan temas halinde beyin lobları getiren döndürmek için beyin neden olur.
9. Halokarbonlu bir yağ (Şekil 3D), az miktarda lamel çevreleyen ile odası kapatın. Lamel sızma aşırı yağ küçültülmüş ve bir doku ile uzak lekelenen edilmelidir.

Central Brain neuroblasts 4. Canlı Görüntüleme

Not: Bu çalışma için, bir Nikon Eclipse Ti dönen diskkonfokal mikroskop (ters mikroskop) canlı görüntüleme için kullanılan; Bizim kurulum detayları önceden ³¹ yayınlanmıştır. Alternatif olarak, numune, bir dik sistemi kullanılarak görüntülenebilir.

1. Sadece monte beyinleri üzerinde lamel daldırma bir damla yağ ekleyin. Bu, numunenin doğrudan üstünde amaç merkezi yardımcı olacaktır.
2. Kritik adım: bir sahne kuluçka 25 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta beyinleri koruyun. Yavaşça aşama inkübatör içine monte edilmiş örnek pozisyon ve kapak ile odasını kapsamaktadır.
3. Optik lobların merkez ve medial alanlarda ikamet büyük, yuvarlak hücreler odaklanarak iletilen ışık kullanarak merkezi beyin Onaylanmış bulun; epi-floresan kullanmayın. Bu uygulama ile daha kolay olur. Bu, mümkün olduğu kadar hafif olan en az miktarda için örnek göstermek için çok önemlidir. Zarar zamanlı görüntüleme beyinleri israf etmeyin.
4. Bir kez yerinde, konfokal kullanarak hızlı çekimlerininUygun yeri ve derinliği belirler. Ilk 10-15 mikron derinlik sınırlayın. Gerektiği gibi ayarlayın ve başka bir test görüntü almak.
   1. İsteğe bağlı adım: hayır xy kayma olmadığından emin olmak için ventral sinir kablosu bir test film toplayın. Sürüklenme tespit edilirse, yerleşmek için numune için 15-30 dakika bekleyin. Sürüklenme 30 dakika razı değilse, yeni bir örnek hazırlamak. Binbaşı sürüklenme genellikle aşırı yağ ilave geri takip edilebilir, ya da yağ eşitsiz boyutu montaj sırasında düşer.
5. Eksenel kayması (z-drift) ortadan kaldırmak için bir kızılötesi LED kullanan bir sürekli otomatik odaklama aygıtı kullanın. Alternatif olarak, elle odak düzlemi düzeltin.
6. Ilgi konusu bir NB tanımlanır, görüntüleme rejimi ile devam edin. Tüm canlı hücre görüntüleme, lazer ışık miktarı, maruziyet süresi, kamera binning, objektif büyütme, zaman ve / veya z-adım aralığı ile tüm ampirik eldeki soruyu cevaplamak için belirli bir deney için optimize edilmelidir. Amacı ışık baraj en aza indirmek içinyaş iken yine de yararlı veri toplama. Ek rehberlik için açıklamalara bakın.
   1. Resim z-ekseninde 1 mikron aralıklı 12-14 görüntüleri toplayarak NB tüm hacmi. Aynı NB bir veya birden fazla hücre döngüsü yakalamak için zaman çözünürlüğü ayarlayın. Genel bir kural olarak, tek bir hücre döngüsü görüntüleme ve birden fazla hücre döngüsü için 1-3 dakika için 10-30 saniye aralıklarla aralıkları kullanın.
7. Kritik adım: örnek mitoz süresini izleyerek sağlıklı olduğunu onaylayın. Mitoz fazla 15 dakika sürer, başka bir beyin geçmek. Sağlıklı bir beyin mitoz birkaç tur geçiren görüş aynı alanda bulunan birçok Onaylanmış gösterecektir. Her bir hücre döngüsü nedeniyle ışık hasarına biraz daha uzun bir öncekinden daha olduğuna dikkat edin.
8. Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, inkübasyon odası sökmeye ve gaz geçirgen kültürleme yemekler ama her atın. % 95 etanol ile kültür çanak yüzeyi durulayın ve bir doku ile de silin. Iki kez daha tekrarlayın.

Immünofloresans için Brain 5. Hazırlanması

1. Takviye edilen ortam içinde yaklaşık 0.2 ml ihtiva eden 1.5 ml tüp içine 20 ya da daha fazla eksplante beynini toplayın.
2. Tüpten Ortamı çıkarın ve (% 0.3 Triton X-100 ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi, PBS) 0.5 ml PBSTx ile bir kez beyinleri yıkayın. Beyin sıvının tüm değişimleri arasında tüpün dibe olsun. Triton X-100, deterjan doku nüfuz edilebilir kılınması için kullanılmaktadır. Genellikle durulama en az 30 saniye sürer; beyin tüpün dibine yerleşmiş bir kere sadece PBSTx çıkarın.
3. PBSTx içinde seyreltilmiş% 9 elektron mikroskobu sınıf paraformaldehidin 0.5 ml çözelti değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın.
4. Tehlikeli atık yönetmeliklerine göre sabitleştirici bertaraf edin.
5. 15 dakika boyunca 0.5 ml PBSTx ile örnekleri yıkayın. Taze PBSTx iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın.
6. 0.5 ml PBT (PBS, 1 ile çözüm yerine% Bovine Serum Albumin (BSA) ve% 0.1 Tween-20). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın. Bu adım, blok dokuya antikorun spesifik olmayan bağlanma.
7. % 4 normal keçi serumu (NGS) ile desteklenmiş PBT içinde seyreltilmiş 0.5 ml birincil antikor ile çözüm değiştirin. 4 ° C de bir gece nutation ile inkübe
8. Seyreltilmiş primer antikor atın veya kaydedin.
9. 15 dakika boyunca 0.5 ml PBT ile örnekleri yıkayın. Taze PBT iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın.
10. 0.5 modifiye PBT ml (PBS,% 2 BSA,% 0.1 Tween-20 ve% 4 NGS) ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın.
11. Tadil edilmiş PBT ile seyreltilmiş 0.5 ml ikincil antikor ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca nutation kuluçkalayın.
12. (% 0.1 Tween-20 ile PBS) 0.5 ml PBST ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın. Taze PBST'de iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın.

6 "jove_title". Immünofloresans için Montaj Örnekleri

1. Dikkatlice slayt merkezinin soluna doğru sınırlayan damla bir cam slayt üzerinde bir damla olarak örnekleri aktarın.
2. Slaydın merkezine monte orta büyük bir düşüş (çapı yaklaşık 2 cm) (örneğin, Aqua-Poly/Mount) ilave edin. Sola doğru olan PBST havuz kaçının.
3. Montaj orta havuzuna PBST havuzundan beyinleri aktarmak için forseps kullanın. Beyinleri üstüne doğrudan montaj orta ekleyerek kendi yönünü bozabilir ve kaçınılmalıdır.
4. , Bir ışık mikroskobu altında, yukarı bakacak görüntüsü olacak yüzü montaj ortamı içinde örnekleri düzenlemek.
5. Işık mikroskobu altında sürgü ile, yavaş yavaş örneklerin üstünde bir # 1,5 daha düşük bir cam lamel. İsteğe bağlı adım: hafifçe lamel iterek küçük hava kabarcıklarını yerinden oynatın.
6. Montaj orta slaytlar yalan, bir gecede birkaç saat veya polimerize düz, ışık ver, oda sıcaklığında, koruma.
7. Slaytlar bir sonraki gün görüntü verilen ya da önceden görüntüleme için saklanabilir.

Sonuçlar

Canlı görüntüleme, NB ACD düzenleyen mekanizmalar bir dizi açıklamıştır. Önceki görüntü elde etme için, bu uygun görüntüleme koşulları belirlemek için gereklidir. Bu canlı hücre görüntüleme süresi ile kare yakalama hızını dengelemek için gereklidir. Ince hücre analizi için, örneğin, geçici artış ve optik çözünürlük gerekli olabilir. Tek bir NB hücre döngüsü (Şekil 4A) imgelerken, görüntüler yakalanır hangi hızı fotohasar tanıtan olmadan artabilir. Tipik olarak, tek bir hücre bölünmesi olayları, yaklaşık...

Tartışma

Canlı hücre görüntüleme kök hücre ACD, hücre soylarının farklılaşmasını düzenleyen mekanizmaları incelemek için kullanılan çok değerli bir yaklaşım ve kompleks dokuların morfolojisi olan. Araştırma grupları tarihsel NB ACD görselleştirmek için çeşitli teknikler istihdam olmasına rağmen, bu yaklaşımlar genellikle öncelikle beyin dokusu bozulmadan sola veya ayrışmış olup olmadığını açısından farklılık iki kategoride toplanabilir.

Görüntüleme Onaylanmış avantajları vardır ayrışmış. İlk olarak, ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Lumox doku kültürü kabı 50 x 12 mm	Sarstedt	94.6077.410	Gaz geçirgen ve optik olarak şeffaf film tabanına sahip yeniden kullanılabilir bir kültür kabı.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiyotik-Antimikotik (100x)	Invitrogen	15240-062	Penisilin (10.000 U/ml), streptomisin (10.000 &# 956; g / ml) ve amfoterisin B (25 & # 956; g/ml) bakteri ve mantar kontaminasyonunu önlemek için Schneider'in S2 ortamına eklenir.
Cam lameller, #1.5 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halokarbon yağı 700	Sigma-Aldrich	H8898	Berrak ve renksiz yüksek viskoziteli inert bir yağ.
Bir çift nikel kaplı pim tutucu, 17 cm uzunluğunda	Güzel Bilim Araçları	26018-17
Çift Dumont #5 Forseps	Güzel Bilim Araçları	11252-20
Plastik saplı diseksiyon iğnesi/probu	Fisher Scientific	08-965-A
Şırınga filtresi, 0.22 μ m gözenek boyutu	Fisher Scientific	09-719A
Şırınga, 5 ml	BD Biosciences	309646
Plastik transfer pipeti	Fisher Scientific	S30467-1
Paraformaldehit, %32 EM dereceli	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15714	DİKKAT: Formaldehit toksiktir; çeker ocakta tutulmalıdır. Güvenli kullanım için MSDS yönergelerini izleyin.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür)	İnvitrojen	D1306	DNA'yı etiketleyen ve UV ışığı tarafından uyarılan bir boya.