Yöntem makalesi

Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

DOI:

10.3791/51763

⸱

12 Ağustos 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floklanmış, koşullu onkojenik alellerle tasarlanmış ve viral Cre aracılı rekombinasyon yoluyla transforme edilmiş farelerden toplanan fenotipik vahşi tip astrositler ve nöral kök hücreler, astrositom patogenezini modellemek için kullanılabilir in vitro ve in vivo dönüştürülmüş hücrelerin sinjeneik, bağışıklığı yetkin yavruların beyinlerine ortotopik enjeksiyonu ile.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut astrositom modelleri, hastalık patogenezi sırasında belirli beyin hücresi tiplerindeki onkojenik mutasyonların rollerini ve bunların klinik öncesi ilaç geliştirme için faydalarını tanımlama yetenekleri açısından sınırlıdır. Bu uygulamalar için daha iyi bir model sistem tasarlamak amacıyla, floklanmış onkojenik alellerin çeşitli kombinasyonlarını barındıran koşullu, genetik olarak tasarlanmış farelerden (GEM) fenotipik olarak vahşi tip kortikal astrositler ve nöral kök hücreler (NSC) hasat edildi ve kültürde büyütüldü. Genetik rekombinasyon, adenoviral Cre aracılı rekombinasyon kullanılarak in vitro olarak indüklendi, bu da mutasyona uğramış onkogenlerin ekspresyonu ve tümör baskılayıcı genlerin silinmesi ile sonuçlandı. Bu mutasyonların fenotipik sonuçları, in vitro olarak proliferasyon, transformasyon ve ilaç yanıtı ölçülerek tanımlandı. Ortotopik allogreft modelleri, transforme olmuş hücrelerin stereotaktik olarak immün yetkin, sinjeneik yavruların beyinlerine enjekte edildiği, onkojenik mutasyonların ve hücre tipinin in vivo tümör oluşumu üzerindeki rolünü tanımlamak için geliştirilmiştir. Çoğu yerleşik insan glioblastoma hücre hattı ksenogreftinden farklı olarak, dönüştürülmüş GEM'den türetilmiş kortikal astrositlerin bağışıklığı yetkin littermatların beyinlerine enjeksiyonu, normal beyin parankiminin yaygın invazyonu da dahil olmak üzere insan astrositomlarının histopatolojik özelliklerini özetleyen en agresif alt tip olan glioblastoma dahil olmak üzere astrositomlar üretti. Lusiferazı eksprese etmek için tasarlanmış dönüştürülmüş astrositlerden alınan ortotopik allogreftlerin biyolüminesans görüntülemesi, zaman içinde in vivo tümör büyümesini izlemek için kullanıldı. Bu nedenle, koşullu onkojenik alellere sahip GEM'den hasat edilen astrositler ve NSC'yi kullanan astrositom modelleri, in vitro ve in vivo astrositom patogenezinin genetiğini ve hücre biyolojisini incelemek için entegre bir sistem sağlar ve bu yıkıcı hastalıklar için klinik öncesi ilaç geliştirmede yararlı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrositomlar en sık görülen primer beyin tümörü glioblastoma (GBM), bir sınıf IV astrositom vardır, 12-15 ay 1,2 medyan sağkalım en yaygın ve agresif bir alt tiptir. Yaygın astrositomlar, özellikle GBM, istilası, tam cerrahi rezeksiyon engellemektedir adjuvan tedavilerin etkinliğini sınırlayan ve kaçınılmaz tedavi sonrası nüks 3 yol açar. De novo (birincil) GBM ile ya da kaçınılmaz (ikincil) GBM 4 ilerledikçe daha düşük grade astrositom ile ya başlangıçta başvururlar. GBM genomik heterojen ve üç damarlı sinyal yolları yönlendiren genler birbirini dışlayan ve co-ortaya çıkan mutasyonlar ile karakterizedir: G 1 / S (Rb) hücre döngüsü kontrol noktası, reseptör tirozin kinaz (RTK) ve TP53 5-7 yolaklarıyla. GBM GBM alt tipi Grip Grip Ağrilari olduğunu düşündürmektedir, beyin hücre tiplerinin farklı benzer sentezleme profillerine sahip dört alt tipinin genomik oluşmaktadırköken 6,8,9 kendi hücre tarafından etkilemiştir. Iyi astrositom modelleri astrositomdur patogenezi sırasında belirli hücre tiplerine mutasyonların belirli kombinasyonları rolünü tanımlamak için gereklidir. Daha verimli preklinik ilaç geliştirme için bu modelleri yararlanan hasta sonuçlarını geliştirmemize yardımcı olacaktır. Mevcut astrositom modeller, insan hücre hatları, hasta türetilmiş ksenograftları (PDX) genetik olarak tadil edilmiş normal insan astrositlerin nöral kök hücreleri (MGK) ve genetik olarak fareler (GEM) 10-14 kurulmuş bulunmaktadır. Kortikal astrositleri ve NSC - - floxed onkojenik alleles çeşitli kombinasyonlarını barındıran GEM hasat Biz primer beyin hücrelerini kullanan bir alternatif olmayan germ GEM (nGEM) modeli 15 geliştirmiştir. Amaç, fenotipik i preklinik ilaç gelişimi için in vitro ve in vivo olarak karakterize edilmiş ve potansiyel olarak yararlanılabilir genetik olarak tanımlanmış hücrelerin astrositom modellerini üretmek için olanmmune-kompetan farelerde azaltılmıştır.

Kurulan insan hücre çizgileri Bunlar düz ön teknik yaygın olarak mevcuttur. Astrositoma patogenezinde ve in vitro ve in vivo ilaç yanıtı en yaygın olarak kullanılan model, ve immün yetersiz farelerde 10,11,16-18, ortotopik Xenografting üzerine kinetik ve tümör oluşum nedenlerinin tanımlanmış . Onların dezavantajları sadece yüksek dereceli astrositom çalışma sınırlayıcı, düşük-dereceli astrositomlardan kurulan hücre hatları oluşturmak için yetersizlik içermektedir; Kalkış tanımlanmış bir hücre eksikliği; genellikle orijinal hasta numunesinden gelen belirgin bir şekilde farklıdır genomik profiller ile kompleks genomik anormalliklerin mevcudiyeti; ve duyarlılık serumdaki 11,17,19-22, seri kültürü sırasında fenotipik ve genotipik sürüklenme için. Kurulan insan GBM hücre hatlarında bireysel onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçları genellikle eluc engeller aslında mevcut anomalilerin sayıda kamufle edilebilirDoğrudan genotip-fenotip sonuçları idation.

PDX immün yetersiz farelerde veya bağışıklık yetersizliği olan farelerde 12,23 beyinlerine ortotopik enjeksiyondan önce tanımlandığı gibidir, serumsuz ortam içinde yapışkan olmayan küremsi olarak kültür yoluyla hastaya izole astrositom hücrelerinin deri altına geçişi elde edilmektedir. PDX daha doğru bir insan astrositomas genomik manzara eder, fakat bilinen insan hücre çizgilerine benzer, tek tek onkojenik mutasyonların fenotipik etkisinin genomik karmaşıklığı nedeniyle 19,24 maskelenebilir. Özellikle yeni tedavilere karşılık olarak, belirli onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçlarını tanımlamak için, bilinen insan hücre çizgileri veya PDX panelleri genellikle, genotip-fenotip bağlantıları ortaya genelleştirilebilirliğini gösterir ve hücre çizgisi özel etkilerin ihtimalini en aza indirmek için kullanılmaktadır. PDX doğru insan astrositomaların, inc histopatolojik izlerini recapitulate ikeninvazyon luding, bilinen insan hücre çizgilerinin ortotopik ksenogrefleri genelde 21,23,25 yok. Buna ek olarak, normal insan astrositler ve NSC in vitro ve in vivo olarak 13,14,26 astrositom tümörogenez modellemek için tanımlandığı onkojenik mutasyonu olan genetik olarak tasarlanmış edilmiştir. Bu hücreler, bilinen insan hücre çizgileri ve PDX genomik karmaşıklığı eksikliği ve doğru bir şekilde insan astrositoma histopatoloji özetlemek, fakat in vivo olarak bağışıklık eksikliği, kemirgenlerde yabancı-doku naklinde gerektirir. Tüm insan hücre modelleri immün-aracılı ksenogreft reddini önlemek için bağışıklık yetersizliği olan kemirgen ana gerektirdiğinden, bu modeller stroma hedefli ve immün-modülatör preklinik soruşturma sınırlayıcı, bir singenik sisteminin yerel tümör-stroma etkileşimleri özetlemek başarısız ve sağlam bir bağışıklık sistemi eksikliği 10,11 terapiler.

Onkojenik Muta önceden belirlenmiş kombinasyonları fenotipik sonuçları GEM izni incelenmesiin situ tümörigenezinde sırasında in vivo leri. -Çıkışlı şartsız GEM gelişimi boyunca bütün dokular içinde mutasyonlara sahip ise, koşullu GEM hücre tipine özgü promoterler 10,11,15,18 kullanımı yoluyla, özel hücre tipleri Cre-aracılı rekombinasyon sınırlayan mutasyonların hedefleme olanak onkojenik allelleri floxed var. Koşullu astrositom GEM sağlam bir beyin içinde 11 farklı hücre tiplerinde onkojenik mutasyonların işlevsel roller ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Koşullu GEM kullanılarak in situ gliom klinik öncesi programı 1) bir in vitro bir korelasyon eksikliği, kompleks genotipler ile, in situ tümör gelişiminde, 3) uzun gecikme farelerin büyük gruplarının bir üreten 2) zorluk içeren bir dizi faktöre ile sınırlıdır , 4) ve stokastik tümör ilerlemesi. In situ uygun bir tümör oluşumu in vitro bir model eksik olduğundan, in vitro ilaç testi ağırlık gerçekleştirilemezi'inci geleneksel koşullu GEM modelleri. Diğer kanserlerin tersine, astrositom şartlı gem modelleri nadiren tek onkogenik mutasyon 11 ile uyarılmaktadır. Böylece, karmaşık ıslah programları çoklu onkojenik mutasyonlar ile koşullu GEM oluşturmak için gereklidir. Yüksek dereceli astrositom ilerleme genellikle tekdüze olmayan, stokastik bir şekilde ortaya çıkar ve sonuçta karmaşık genomik manzaralar ve hızlı büyüme kinetiği 27 ile tümörlere yol açar Dahası, astrositom başlatma, bu modellerde uzun bir kuluçka döneminden sonra penetransı değişken oluşur, 28. Koşullu GEM modellerinde değişken Penetrans ve malign ilerlemesi stokastik doğası bireysel farenin preklinik ilaç araştırmaları yaptığını kayıt önce yüksek dereceli astrositomaların varlığını ve yerini belirlemek için radyografik görüntüleme ile taranmalıdır gerektirir. Birlikte ele alındığında, bu sınırlamalar pr için gerekli üretim ve koşullu GEM büyük kohortlarda test engeleclinical uyuşturucu testi.

Belirli bir nöral hücre tipleri üzerinde bulunan viral reseptörü (tva) ifade etmek üzere geliştirilen GEM enfekte etmek için kuş retroviral (RCAS) vektör kullanır RCAS-tva GEM sistemi,, geniş bir astrositoma tümörogenez 11 modellemek için kullanılmıştır. Koşullu GEM aksine, bu model sistem karmaşık yetiştirme programları için gerek olmaksızın, belirli hücre tiplerinde çoklu onkojenik mutasyonun ortaya çıkmasına olanak tanır. Bununla birlikte, değişken penetrans aktif viral entegrasyonu sağlamak için bölünen hücreler için ihtiyaç ve bunlar, konakçı genomu 29 içine transgenlerin rastgele yerleştirilmesi ile sınırlıdır.

Diğer model sistemler 15 sınırlamaları birçok üstesinden çünkü GEM hasat hücreleri kullanması Sigara germ GEM (nGEM) modelleri, giderek daha önemli hale gelmektedir. Astrositoma patogenezinde hücre tipinin ve birlikte görülen mutasyon başlatma rolü engellemek için zordurbu habis ilerleyişi sırasında belirsiz hücre tipinde yaygın genetik mutasyonlar birikmiş son aşama tümörlerinden türetilmiştir, çünkü maden insan GBM hücresi türleri veya PDX tesis kullanılarak. Buna karşılık, astrositomaların tüm sınıflarda spesifik saflaştırılmış beyin hücre tipleri 11,30 içindeki genetik mutasyonlar tanımlanmış indükleyerek nGEM kullanılarak modellenebilir. Bu nedenle, belirli genetik mutasyon ve hücresel ve moleküler fenotipe hücre tipinin etkisi in vitro ve in vivo olarak belirlenebilir. Kurulan insan GBM hücre çizgilerine benzer bir şekilde, başlangıç ​​nGEM kullanılarak in vitro ilaç testleri aynı hücreleri kullanılarak, in vivo testler için ilaç öncelik için kullanılabilir. In vivo olarak tümör oluşumu daha sonra ortotopikal bağışıklık-kompetan singeneik litermatlarından 30 beyinlerine nGEM hücreleri allogeneik belirlenebilir. Bu ortotopik alograft modelleridir nedenle, sadece sitotoksik a in vivo testler izinnd terapileri hedefli, ancak immün-modülatör ve stroma hedefli tedaviler de. Son olarak, tümör başlaması ve ilerlemesi üzerinde mikro-rolü, aynı hücre tipinde aynı mutasyonları kullanılarak, nGEM konvansiyonel GEM modelleri arasında sonuçları karşılaştırarak belirlenebilir.

Biz ve diğerleri birincil hücreler kullanılarak astrositomdur nGEM geliştirdik - astrositleri, MGK, ya olgodendrosit öncü hücrelerini (OPC) - GEM 30-34 hasat. Astrositom nGEM geliştirilmesi arkasındaki mantık, potansiyel olarak, bağışıklık-kompetan hayvanlarda klinik öncesi in vitro ilaç testleri için ve in vivo kullanılabilecek belirli hücre tiplerinde onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçlarını belirlemek için bir model oluşturmak için olmuştur. Rb1 loxp / loxp veya TgGZT - Biz ifade fenotipik WT kortikal astrositleri ve non-Cre gelen MGK, floxed RB yolun bir>% 94 C57 / BL6 arka plan üzerinde muhafaza koşullu GEM hasat121 - çeşitli kombinasyonlarda 35-39 genleri - Nf1 LoxP / LoxP, Kras G12D, PTEN LoxP / loxp - ve RTK / RAS / PI3K- yolu floxed. Bu Cre rekombinazı kodlayan adenoviral vektörler kullanılarak in vitro genetik yeniden neden oldu. Kortikal astrosit hasat hücre tiplerinin bir karışımını içerdiği için, bu kültürlerde GFAP + kortikal astrositler zenginleştirmek için, bu tür TgGZT insan GFAP promotöründen 121 olarak Ad5GFAPCre vektörler veya baskın onkojenik transgenleri, ikinci. Bu in vitro ve in vivo olarak kortikal astrositler ve NSC fenotipik G1 / S sonuçlarını (Rb) için, MAPK ve PI3K yolu tanımlanmış mutasyonlar. MAPK ve PI3K yolu ile aktive olan G1 / S hatalı olarak taklit insan astrosit moleküler proneural GBM ve ortotopik enjeksiyonu üzerine, düzgün büyüme kinetikleri, kısa süreye göre önceden belirlenmiş bir konumda oluşan tümörler, ve histopatolojikinsan GBM 30 al işaretlerinden. In vivo tümör büyümesinin tedavisine boyuna izlenmesi 40 cevaben tedavi gruplarına ya da tümör büyümesinin kantitatif analiz normalizasyonu ile klinik öncesi bir ilaç test yardımcı olur. Biz, lusiferaz sentezleyen kortikal astrositler enjekte edilmiş farelerin uzunlamasına biyolüminesans görüntüleme ile tümör büyüme kinetiklerini belirlenmiştir. Bu nedenle, elde edilen koşullu GEM kortikal astrositler ve NSC astrositom ve ilişkili mutasyonların işlevsel sonuçları ve klinik öncesi bir ilaç gelişimi için olası bir model sisteminin tanımı için izlenebilir model sistem sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan çalışmaları Kuzey Carolina Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Yenidoğan Farelerde 1. ekimi Kortikal Astrositler

  1. Hazırlık
    1. 2-3 hassas bir görev doku buruşturma ve% 70 etanol ihtiva eden bir kabın dibine içine koyun. Kesme makasları, kavisli bir forseps ve bu balona düz mikro forseps 2 çift yerleştirin. Dokular, mikro forseps eğilmesini önlemek için kullanılır.
    2. Bir 60 mm doku kültürü çanağı, HBSS içinde 1 ml ilave edilir. Her bir hayvan için ayrı bir çanak hazırlayın ve buz üzerinde yemekleri korumak.
    3. Kurumsal düzenlemeler başına hayvanların anestezisi.
    4. Sıcak% 10 fetal sığır serumu ve 1% penisilin-streptomisin (tam bir DMEM), 37 ° C su banyosu içinde, her hayvan için DMEM 7 ml. NOT: 5 fareler için, 1.1.1-1.1.4 ~ 15 dakika sürer adımları.
  2. Doku Hasat
    1. Instituti başına yenidoğan fare (günde 1-3) KurbanÖnal düzenlemeler.
    2. , Etanol kesme makasları kaldır onları kuru damla izin ve burun omurilikten kafatası üzerinde deri bir sagital kesim yapmak.
    3. Omurilik başlayan ve bulbuslarında geçmiş uzanan, sagital sütür boyunca kafatası bir kesim olun. Beyin doku hasarı en aza indirmek için kafatasının iç yüzeyine yakın makas ipuçları tutmaya özen gösterin.
    4. Kavisli bir forseps kullanarak, yavaşça yanal beyin uzak kraniyumun her yarımkürede soyun.
    5. Düz mikro forseps kullanarak, yavaşça her kortikal yarımkürenin dorsal kısmını uzak çimdik ve HBSS içeren doku kültürü çanak içine yerleştirin. Beyincik ve koku ampul önlemek için özen gösterin. Korpus kallosum altındaki herhangi bir doku almayın.
    6. Diseksiyon mikroskobu ve mikro forseps 2 çift kullanarak, yavaşça her kortikal yarımkürede meninksler kaldırmak. Doku homogenizatio başlayana kadar buz doku kültürü çanak dönn.
    7. Her ek hayvan için 1.2.6 ile 1.2.1 adımları. NOT: 5 fareler için, 1.2.1-1.2.7 ~ 30 dakika sürer adımları.
  3. Doku Homojenizasyon
    1. Temiz bir jilet kullanarak, ince kortikal hemisferlerin zar ve doku kültürü kaputu plaka taşıyın.
    2. Bir steril 15 ml konik bir tüp içine küp şeklindeki doku aktarın. Buz gibi soğuk HBSS 1 ml, plakayı yıkayın ve doku ihtiva eden tüpe aktarın.
    3. Doku tüpünün tabanına yerleşir kadar, daha sonra dikkatli bir şekilde bir pipet kullanarak fazla HBSS kaldırmak bekleyin.
    4. Oda sıcaklığı tripsin / EDTA, 2 ml ilave edilir. 1 ml pipet pipet ~ 10x daha fazla hücreleri ayırmak.
    5. 20 dakika - 15 boyunca 37 ° C'de hücre süspansiyonu inkübe edin. Dikkatle ters çevirme ile her bir 5 dakika karıştırın.
    6. Tripsin inhibe etmek için tam DMEM 3 ml ilave edilir. 1 ml'lik bir pipet pipet ~ 10x çözeltinin karıştırın.
    7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
    8. Kaldır1 ml'lik bir pipet ile yüzer. Pelet gevşek olabilir çünkü orta aspire etmeyin.
    9. DMEM ile tamamlanmış, 37 ° C, 4 ml pelletini. 75 cm hücre süspansiyonu aktarın üst doku kültürü şişesi vidalı. NOT: 5 fareler için, 1.3.1-1.3.9 ~ 50 dakika sürer adımları.
    10. Yaklaşık astrosit hasattan sonra 16 saat, daha sonra DMEM ile tamamlanmış C 4 mi 37 ° ekleyin 37 ° C'de 4 ml HBSS ile balonun yıkayın. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de kortikal astrositler koruyun. NOT: yıkama adımı kültürü çanak yapışmayan hücrelerin uzaklaştırılması ve kalıntının için önemlidir.
    11. Kültür olduğunda ~% 95 birleştiğinde,% 5 37 ° C'de gece boyunca çalkalanır CO2, müstakil hücreleri ihtiva eden ortam daha sonra 37 ° C'de 4 ml HBSS ile balonun yıkayınız. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de hücreler DMEM doldurun ve muhafaza 37 ° C 4 ml ilave edilir. NOT: Bu adım kortikal astrositlerde için kültürlerini zenginleştirmek için önemlidir, mikroglianın kirlenmesine olarak veolgodendrosit progenitör hücreler bu prosedür ile ayırmak ve kültürden 41 kaldırılır.
    12. Tekrar her bir hayvan için 1.3.1-1.3.11 adımları.
  4. Genetik Rekombinasyon indüksiyon
    1. 24 saat 1.3.11 adımı tamamlandıktan sonra DMEM ile tamamlanmış, 37 ° C, 2 ml orta yerine. Ad5CMVCre veya Ad5GFAPCre> 10 10 pfu / ml 1 ul içeren 37 ° C SCM 1 ml ekleyin. Kullanım BSL2 güvenlik önlemleri taşıma rekombinant adenovirüsün:% 5 CO2 .CAUTION 32 ° C'de 6 saat süreyle inkübe edin.
    2. Virüs içeren ortamları çıkarın ve kortikal astrositlere virüs olmadan 37 ° C tam DMEM ekleyin. DİKKAT: BSL2 güvenlik önlemleri rekombinant Adenovirusların taşıma ve kurumsal düzenlemelere göre virüs içeren medya atarken. NOT: - ~ 6 saat inkübasyon hariç 15 dakika sürer 1.4.3 5 Astrosit kültürler için, 1.4.1 adımları.
    3. En çok kortikal Astrosit kültürleri genişletvitro ve in vivo karakterizasyonu. Not: yeniden birleştirilmiş gen için ya da belirli bir mutasyona uğramış proteinin ya da onun sinyal sonuçlarından biri için immünoblotlar ile spesifik primerler kullanılarak PCR ile takip rekombinasyon Cre mutasyonların varlığını belirlemek. Cre rekombinasyon sonra kortikal astrosit kültürlerinin fenotipik stabilizasyonu için gerekli süre kullanılan mutasyon bağlı olacaktır ve deneysel olarak (Şekil 2) tespit edilmelidir.

Yenidoğan Farelerde 2. ekimi Nöral Kök Hücreler

  1. Hazırlık
    1. 98 mM Na-2 SO4, 30 mM K 2 SO4, 5.8 mM MgCl2, 0.25 mM CaCl2 - diseksiyon başlamadan önce, 3.1 mg papain ve 4 ml ayrışma ortamı 1,3 mg sistein eklenerek beyin başına 4 mi sindirim çözelti hazırlamak , 1 mM HEPES, 20 mM glükoz,% 0.001 kırmızı Fenol ve 0.125 mM NaOH (1 M HEPES pH 7.4 stoktan). Papain ilavesive ayrışma ortamı sistein çözelti sarıya döner.
    2. 15 dakika için 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. Tersine çevirerek periyodik karıştırın.
    3. Sindirim çözüm kırmızı renk ışık dönene kadar 0,1 M NaOH damla damla ekleyin.
    4. Bir doku kültürü kaput, steril bir filtre, bir şırınga filtresi (0.22 um gözenek boyutu) kullanılarak sindirim çözeltisi. Buz üzerinde sindirim çözeltisi tutun.
    5. 44.5 mi MGK bazal ortam, 5 mi MGK ek, 0.5 ml penisilin-streptomisin, 50 ul% 0.2 heparin, 10 ul 100 ug / ml EGF ve 10 ul 100 ug / ml karıştırılarak Kök Hücre Orta (SCM) 50 ml hazırlamak bFGF'dir. 4 ° C'de saklandığında, SCM 1 hafta süreyle stabildir.
    6. Tam HBSS (cHBSS) HBSS 10x 50 mi, 1.25 mi, 1 M HEPES (pH 7.4) karıştırılarak hazırlanması 15 ml 1 M D-glikoz, 5 ml 100 mM CaCl2, 5 ml 100 mM MgSO 4 ve 2 mi 1 M NaHCO3. GKD 2 O ile 500 ml toplam hacmi getirmek
    7. CHBSS zekâ sterilize Filtre4 ° C 'de 0.2 hektar um gözenek boyutlu filtre saklayın.
    8. 2-3 hassas bir görev doku buruşturma ve% 70 etanol ihtiva eden bir kabın dibine içine koyun. Kesme makasları, kavisli bir forseps, ve bu balona düz mikro forseps 2 çift yerleştirin. Dokular, mikro forseps eğilmesini önlemek için kullanılır. NOT: 5 fareler için, 2.1.1-2.1.8 ~ 45 dakika sürer adımları.
  2. Doku Hasat
    1. Kurumsal düzenlemeler başına neonatal (gün 1-3) fareler kurban.
    2. ,% 70 etanol kesme makasları kaldır onları kuru damla izin ve burun omurilikten kafatası üzerinde deri bir sagital kesim yapmak.
    3. Omurilik başlayan ve bulbuslarında geçmiş uzanan, sagital sütür boyunca kafatası bir kesim olun. Beyin doku hasarı en aza indirmek için kafatasının iç yüzeyine yakın makas ipuçları tutmaya özen gösterin.
    4. Kavisli bir forseps kullanarak, yavaşça yanal uzak gelen kraniyumun her yarımkürede soymabeyin.
    5. Yavaşça buz cHBSS yılında tüm beyin ve yer çıkarın.
    6. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, dikkatle ince diseksiyon araçları ile beyin meninks çıkarın.
    7. Alt yüzeyinde beyin yerleştirin ve bir boyutu 11 neşter ile keser dikey (koronal) ile beyincik / arka beyin ve koku alma ampul / frontal korteks kaldırmak.
    8. Böylece beynin koronal görünümünü üreten, kuyruk kısmına yerleştirmek için 90 ° kalan beyin Döndür. Lateral ventriküllerin bulun.
    9. Subventriküler bölgesini (SVZ'una) içeren bir kübik bir bölümünü kesmek.
    10. Boyutu 11 neşter ile taze buz soğuk cHBSS ve kıyma dokusu olan bir 60 mm doku kültürü çanağı için doku SVZ'una içeren aktarın.
    11. , Steril bir 15 ml tüp içine kıyılmış doku aktarın. Buz üzerinde tüp yerleştirin.
    12. 1-2 ml buz soğukluğunda cHBSS ile petri yıkayın. Doku içeren tüp yıkama çözeltisini.
    13. Tekrar ek neonata ile 2.2.1-2.2.12 adımlarıL. farenin gerekirse. Protokol kalanı için bir doku kültürü kaputu 15 ml tüpler aktarın. NOT: - ~ 45 dakika sürer 2.2.13 5 fareler için, 2.2.1 adımları.
  3. Doku Homojenizasyon
    1. 5 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde sindirim çözeltisi (aşama 2.1.1 'de hazırlanmış) yerleştirin. Ayrıca, bir 37 ° C su banyosu içinde beyin başına sıcak 2 mi SCM.
    2. Dikkatle 1 ml pipet ile kıyılmış doku süpernatant kaldırmak. Aspire etmeyin.
    3. 15 ml tüp başına 2 ml 37 ° C sindirim çözüm ekleyin ve tersine çevirerek iyice karıştırın.
    4. 15 dakika için 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. Ters çevirme ile her bir 5 dakika karıştırın.
    5. Her tüp ve tekrar adım 2.3.4 37 ° C sindirim solüsyonunun başka bir 2 ml ekleyin.
    6. Hücreler, yerçekimi ile tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin, daha sonra 1 mL pipet kullanılarak sindirilmiş dokusundan süpernatantı kaldırmak.
    7. CHBSS seyreltilmiş 10 mcM E-64 2 ml ekleyin ve tersine çevirerek iyice karıştırın.
    8. , Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin.
    9. Hücreler, yerçekimi ile tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin sonra sindirilmiş dokudan süpernatantı kaldırmak.
    10. 37 ° C cHBSS 1 ml ilave edilir ve 1 ml pipet ucu (~ 20 vuruş) ile homojenize edilmiştir. Doku homojenizasyon sırasında hava kabarcığı enjekte kaçının.
    11. Daha sonra 37 ° C'de, 5 ml cHBSS ile süzgeç yıkayın, 40 mikron gözenek büyüklüğü hücre süzgecinden dokusu Homojenat geçirin.
    12. 5 dakika boyunca 125 x g'de doku Homojenat santrifüj.
    13. Hücre topaklarını bozmadan 1 ml'lik bir pipet ile% 95 arasında yüzer çıkarın. 200 ul pipet ile 200 ul 37 ° C SCM dikkatlice tekrar süspansiyon hücre pelet.
    14. 1.8 ml 37 ° C SCM ekleyin ve steril 6 delikli bir plakanın bir oyuğuna hücre süspansiyonu aktarın. NOT: 5 fareler için, 2.3.1-2.3.14 ~ 75 dakika sürer adımları.
  4. Nöral Kök Hücre Kültürü
    1. Başka bir 2 mi 37 ° eklenerek 3 gün sonra, ortam doldurmakC SCM.
    2. 7 gün sonra, 15 ml'lik bir tüpe aktarın ve neurospheres Neurospheres> 5 dakika boyunca yerçekimi ile razı.
    3. Süpernatantı ve 2 ml 37 ° C SCM ekleyin.
    4. 6 delikli bir plakanın yeni bir oyuğuna transfer neurospheres.
    5. Her 3-4 gün 37 ° C SCM 2 ml ekleyin ve her 7 gün orta tamamen değiştirebilir.
    6. Neurospheres çapı> 100 mm ise, dikkatli bir şekilde kök hücre ayrışma çözeltisi ile ayırmak ve istenen hücre yoğunluğu MGK Replate.
  5. Genetik Rekombinasyon indüksiyon
    1. Şu anda hücreleri üzerinde SCM 2 ml Ad5CMVCre veya Ad5GFAPCre> 10 10 pfu / ml 'lik 1 ul ihtiva eden 37 ° C SCM 1 ml ilave edilir. DİKKAT: BSL2 güvenlik önlemleri rekombinant adenovirüs taşıma.
    2. % 5 CO2 içinde 32 ° C'de 6 saat süreyle inkübe edin.
    3. 15 ml'lik bir tüp içine neurospheres ile SCM aktarın ve küreler 5 dakika boyunca yerçekimi ile razı.
    4. Daha sonra 200 ul pipet ile, 1 ml'lik bir pipet ile ilk süpernatantı. DİKKAT: BSL2 güvenlik önlemleri rekombinant Adenovirusların taşıma ve kurumsal düzenlemelere göre virüs içeren medya atarken.
    5. 6 plaka transfer sonra MGK virüs olmadan 37 ° C SCM 2 ml ilave edilir. NOT: 5 MGK kültürler için, 2.5.1-2.5.5 ~ 6 saat inkübasyon hariç 15 dakika sürer adımları.
    6. Ertesi gün, tekrar gerekli olduğu durumlarda neurosphere geçirme ile, ardından adım 2.5.1-2.5.5. Küreler şimdi in vitro karakterizasyonu ve in vivo Fare beyinleri ortotopik enjekte edilmeden önce, 2-3 geçişleri için genişletilebilir. Not: yeniden birleştirilmiş gen için ya da belirli bir mutasyona uğramış proteinin ya da onun sinyal sonuçlarından biri için immünoblotlar ile spesifik primerler kullanılarak PCR ile takip rekombinasyon Cre mutasyonların varlığını belirlemek. Cre yeniden birleşme sonrası kültürleri MGK fenotipik stabilizasyonu için gerekli olan zamana bağlı olacaktır(Şekil 2 ve 3) kullanılan mutasyon ve deneysel olarak tespit edilmelidir.

Alıcı Iimmunocompetent Fareler Beyin içine Rekombine Hücreleri 3. Ortotopik Enjeksiyon

  1. % 5 Metil selüloz hazırlanması
    1. 100 ml 50 ml'lik bir son hacme kadar iyonu giderilmiş su içinde 15 cps metil selüloz, 5 g çözülür vida kapaklı şişeye. Kümeleşmesini önlemek için 4 ° C sıcaklıkta yavaş yavaş karıştırılarak toz ekleyin. Bu çözüm girmek için tüm metil selüloz, 4 ° C de karıştırılarak 24 saat kadar sürebilir.
    2. Şişeyi tartın ve ağırlığı kaydedin.
    3. % 5 metil selüloz çözeltisi otoklava. Otoklavlanmış sonra, metil selüloz, bir yarı katı jel haline gelecektir.
    4. Şişe tartılır ve otoklav sırasında kaybedilen ağırlığın hesaplanması.
    5. Aseptik kayıp ağırlığının her gramı için steril su içinde 1 ml.
    6. Buz üzerine yerleştirin ve 50 ml buz soğukluğunda 2x DMEM ekleyin.
    7. Gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 20 ml'lik miktarlar halinde,% 5 metil selüloz çözeltisi bölmek için steril tekniği kullanın. Altı aya kadar veya 2x DMEM sona erinceye kadar 4 ° C'de saklayın tümbölenleri. NOT: adımlarla% 5 metil selüloz çözeltisi hazırlanması 3.1.1-3.1.7 2,5 gün ~ alacaktır.
  2. Enjeksiyon için Kortikal Astrositler hazırlanması
    1. Hasat kortikal astrositler zaman ~% 90 konfluent.
    2. Toplama, aspirat bitmiş DMEM ve 37 ° C HBSS eşit hacimde plakaları yıkayın.
    3. Plaka karşılamak için yeterli tripsin ekleyin. Yavaşça tilt ve hücreleri ayırmak başlayana kadar plaka dokunun.
    4. DMEM ile tamamlanmış C 37 ° 'lik bir eşit hacmi ile tripsin etkisiz hale getirirler.
    5. 50 ml'lik konik bir tüp hücreleri aktarın ve 3.2.4 kullanılan 37 ° C'de tam DMEM aynı hacme sahip olan, plakayı yıkayın.
    6. Hücreleri içeren tüp yıkama medya aktarın. 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
    7. Aspire s1 ml 37 ° içinde upernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri DMEM tamamlamak C.
    8. Hücre / ul sayısını belirlemek için bir hemasitometre ya da başka bir uygun hücre sayacı kullanılarak hücre süspansiyonu sayın.
    9. Yeni bir 15 ml konik tüp hücreleri istenilen sayıda aktarın. 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
    10. 37 ° 800 ul süspanse hücreler DMEM tamamlamak C. Hücre topağı hacmini (- 800 ul hücre süspansiyonu, toplam hacim) belirler. NOT: Bu enjeksiyon için doğru bir hücre konsantrasyonu elde etmek esastır. Bu durumda, hücre topağın hacminin aşamasında 3.2.12 eklemek% 5 metil selüloz hacmi hesaplamak için bu aşamada tespit edilmelidir.
    11. Steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücreleri aktarın ve daha sonra 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
    12. Aspire hücre topağından süpernatan ve buz-soğuğu% 5 metil selüloz uygun hacimde kortikal astrositler tekrar süspansiyon (toplam hacmi istenen - hacimhücre topağı) hücre / ul istenen sayıda elde etmek için.
    13. Enjeksiyona kadar buz üzerinde hücreleri yerleştirin.
    14. Daha sonra şırınga üzerine künt bir 18 G iğne yerleştirmek bir tekrarlanması Antijen sebili içine 250 ul cam şırınga yerleştirin.
    15. Kortikal astrocyte süspansiyon iğne ile pistonu yavaşça geri çekin; hava kabarcıkları sıkıştırmak ve aslında beyin içine enjekte edilen hacim azalacak, çünkü çıkarılmalıdır hücreleri üzerinde bir hava kabarcığı olacaktır.
    16. Sadece kortikal astrosit süspansiyonun üstünden iğne ucu tutun ve hızlı bir şekilde pistonu itin. Hava kabarcığı hızlı hücre süspansiyonu daha hareket edecek ve çoğunlukla ihraç edilecektir.
    17. Tüm hava kabarcıkları olana kadar, tekrarlayın Adım 3.2.16 iğne kaldırılır.
    18. Yaklaşık ~ 200 ul şırınga doldurun, sonra iğne yukarı tutun ve duruncaya kadar geri pistonu çekin. Küçük hava kabarcıkları iğne ucu tuttuğunu ve hızlı bir şekilde yaklaşık 5 pistonu iterek çıkarılabilir0 ul sonra yavaş yavaş tam kapasite çekilmesi.
    19. Dik ucu tutun ve adımı 3.2.18 4-5x tekrarlayın.
    20. 18 iğne atın ve şırınga üzerine 27 G iğne sığacak.
    21. Sıvı iğne çıkana kadar antijen dağıtıcı üzerindeki düğmesine basın. NOT: 1 Astrosit hücre hattı için, 3.2.1-3.2.21 ~ 60 dakika sürer adımları.
  3. Enjeksiyon için MGK hazırlanması
    1. Neurospheres çapı> 100 mikron olduğunda, 15 ml tüplere aktarmak ve Neurospheres> 5 dakika boyunca yerçekimi tarafından razı olsun.
    2. Süpernatantı, örneğin kök hücre ayrışma çözeltisi ya da 42 tarif edildiği gibi, üreticinin talimatlarına göre veya% 0.05 tripsin-EDTA ile uygun Accutase gibi hafif bir ayrışma reaktif ile neurospheres, ayrışır.
    3. Serum MGK maruz kalmadan, üreticinin talimatlarına uygun olarak ayırma reaktifleri inhibe eder. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
    4. Aspire süpernatan, daha sonra tek bir hücre süspansiyonu üretmek için 37 ° C cHBSS 1 ml süspansiyon hücreleri.
    5. Hücre / ul sayısını belirlemek için bir hemasitometre ya da başka bir uygun hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın.
    6. Yeni bir 15 ml konik tüp MGK istenilen sayıda aktarın. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
    7. 37 ° C'de 800 ul HBSS içinde süspansiyon hücreleri. Hücre topağı hacmini (- 800 ul hücre süspansiyonu, toplam hacim) belirler. NOT: Bu enjeksiyon için doğru bir hücre konsantrasyonu elde etmek esastır. Bu durumda, hücre topağın hacminin aşamasında 3.3.9 eklemek% 5 metil selüloz hacmi hesaplamak için bu aşamada tespit edilmelidir.
    8. Steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne hücreleri transferi ve daha sonra 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj.
    9. Süpernatantı aspire ve 3.2.12-3.2.21 gibi ortotopik enjeksiyon için hücrelerin hazırlanması bitirmek. NOT: 1 MGK hücre hattı için, 3.3.1-3.3 adımları.9 ~ 60 dakika sürer.
  4. Enjeksiyon için Fare hazırlanması
    1. Kurumsal IACUC kurallarına göre 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribromoetanol) ya da 100 mg / kg ketamin artı 10 mg / kg ksilazin bir İP enjeksiyonu vasıtasıyla, alıcı hayvan anestezisi. NOT: Kullanılan burada allogreft olarak ana yaşı 3-6 ay farenin vardır. Farklı yaşlarda farenin ur gelişimi üzerindeki gelişimsel beyin yaşın microenvironmental etkisini araştırmak için kullanılabilir.
    2. Clippers ya da makasla kesi sitesi üzerinden kafa derisi tıraş.
    3. % 70 etanol ve betadin 3 alternatif çubukla cerrahi siteyi sterilize.
    4. Göz kırpma refleksi kaybı nedeniyle herhangi bir zarar görmesini önlemek için gözleri oftalmik merhem sürün.
    5. Pedalı geri çekme (ayak tutam) refleks ile anestezi derinliği değerlendirin. NOT: 5 fareler için, 3.4.1-3.4.5 ~ 15 dakika sürer adımları.
  5. Orthotopik İmplantasyon
    1. Stereotaksik çerçeveye hayvan edin.
    2. Makgözleri ve kulakları arasındaki yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda sagital sütür üzerinde bir kesi e.
    3. Koronal ve sagital sütür (Bregma) kesişimi yanı sıra lambdoid ve sagital sütür (Lambda) kesişimini bulun. Bregma ve Lambda aynı yatay düzlemde olduğundan emin olun.
    4. Şırınga hücre süspansiyonu içeren ve başının üzerinde stereotaksik çerçeve antijen dağıtıcı yinelenen takın. Bregma ile temas, 27 G iğne ucu getirin. Bu, üç boyutlu koordinatlar manipülasyonu için kullanılacak kökenlidir.
    5. Kafatası yüzeyinden hafifçe iğne kaldırın ve 2 mm lateral ve bregmadan 1 mm rostral taşıyın.
    6. Bregmadan, hedef 4 mm ventral kafatası dikkatle iğne indirin. NOT: bazal ganglionlar hedeflemek için bu stereotaktik koordinatları kullanılmıştır. Farklı Stereotaktik koordinatları farklı microenvironmental etkisini araştırmak için kullanılabilirur gelişimi üzerindeki etkileri beyin bölgelerinde.
    7. Yinelenen antijen Dispenseri bir kez aktive ederek hücre süspansiyonu 5 ul enjekte edilir. 2 dakika kafa içi basıncı dengelenmeye gelmeye bırakın için iğneyi yerinde bırakın.
    8. Yavaş yavaş 30 saniyelik bir süre boyunca iğnenin geri çekilmesi. Oluşabilecek herhangi bir kanama basınç uygulamak için bir pamuklu çubuk kullanın.
    9. Yara kenarları yaklaştığı ve doku yapıştırıcı kullanılarak kesi kapatın. Kesi yerinde Lidokain subkutan 20 ul uygulayın. NOT: 5 fareler için, 3.5.1-3.5.9 ~ 50 dakika sürer adımları. UNC IACUC sadece lokal anestezi postoperatif kullanımını onayladı. Yerel kurumsal IACUC ile istişare Bu işlemden sonra postoperatif analjezik kullanım şartlarına ilişkin tavsiye edilir.
  6. Post-Cerrahi Bakım
    1. Kurtarmak için temiz, sıcak bir kafeste hayvanları yerleştirin. Kazara oluşabilir aspirasyon gibi hayvanlar, doğrudan yatak içine yerleştirilmiştir olmamalıdır.
    2. GözlemleyinBu tımar, yeme ve dışkılama gibi normal davranışı sürdürme hayvanlar. NOT: Normal davranış Sürmesine ~ 60 dakika sürebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu, fenotipik olarak in vitro ve in vivo olarak karakterize edilebilir koşullu onkojenik alelleri (Şekil 1) floxed yenidoğan GEM barınağı hasat kortikal astrositler ve MGK bir nGEM model sistemi geliştirmiştir. Özellikle in vitro kortikal astrositler onkojenik mutasyonların sonuçlarını incelemek için, ilk olarak astrositleri zenginleştirmek için kritik öneme sahiptir. Kortikal astrosit hasat mikroglia, astrositler, oligodendrositler, OPC ve nöronların bir karışımını içeren, me...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En kritik adımlar, 2), 3) iyice hücreleri ayırmak, meninks kaldırmak için korpus kallosum altında doku almadan korteksi çıkarılması için uygun hasat ve kortikal astrositlerde kültürünü 1) sağlamak ve 4) GFAP zenginleştirmek için + astrositlerden salınmaktadır. Biz GAFP + astrositlere zenginleştirmek için yöntemler (GFAP promotör kontrolü altında (bir baskın dönüşen transgen bir Ad5GFAPCre vektörü veya kullanımı ile TgGZT 121) genetik rekombinasyon kısıtlama) mekanik (ti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRM, Damon Runyon-Genentech Klinik Araştırmacısıdır. Bu çalışma, kısmen, Damon Runyon Kanser Araştırma Vakfı (CI-45-09), Savunma Bakanlığı (W81XWH-09-2-0042) ve Kuzey Carolina Üniversitesi Kanser Araştırma Fonu'ndan (UCRF) CRM'ye verilen hibelerle desteklenmiştir. Yazarlar, fare yetiştiriciliğindeki yardımı için Daniel Roth'a teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca doku kültürü ve immünofloresan yardımı için Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette ve Susannah Krom'a teşekkür etmek isterler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM, GIBCOSigma ve Cellgro
Fetal Sığır Serumu, RegularCellgro35-010-CV
Penisilin-StreptomisinInvitrogen15140122
Keskin Uçlu Diseksiyon MakasıFisher Scientific08-395dahil olmak üzere diğer tedarikçilerden de satın alınabilir.
Kıkırdak Başparmak Forseps, KavisliFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Stil 1 Kuyumcu Tarzı Forseps, İnce, 4Miltex17-301
Etanol (200 kanıt)Decon Labs2710
Tıraş BıçaklarıVWR55411-050
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (1x), sıvıInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), Fenol KırmızıInvitrogen12605-010Diğer tripsin çözeltileri de kortikal astrosit havest ve kültür
için uygundur Kültür Çanağı, 60 x 15 mmThomas Scientific9380H77
15 ml TüplerBD Biosciences352096
50 ml TüplerBD Biosciences352070
Adenovirüs stokGen Transferi Vector Core, U. IowaAd5CMVCre5 & mikro'da saklayın; l alikotlar -80 ° C'de tehlikeli. Bsl2 güvenlik önlemlerini kullanın
Sodyum sülfat (Na2SO4) Sigma-Aldrich238597
Potasyum sülfat (K2< / sub>SO4< / sub>)Sigma-Aldrich221325
Magnezyum klorür (MgCl2< / sub>)Sigma-AldrichM8266
Kalsiyum klorür (CaCl2< / sub>)Sigma-Aldrich746495
HEPES potasyum tuzuSigma-AldrichH0527
D-(+)- GlikozSigma-AldrichG8270 
Fenol KırmızıSigma-AldrichP3532
Sodyum hidroksit (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapainWorthingtonLS003127
L-Sistein-HClSigma-AldrichC1276
Şırınga filtresi (0.22 ve mikro; m gözenek boyutu)MilliporeSLGP033NS
Nörokült proliferasyon kiti, fareKök Hücre Teknolojileri5702Bu kit, NSC kültürü için gerekli olan NeuroCult NSC Bazal Ortamı ve NeuroCult NSC takviyesini içerir
%0.2 Heparin çözeltisiKök Hücre Teknolojileri7980
EGF CanlandırıcıPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Magnezyum sülfat (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Sodyum bikarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE313210 mM stok yapın DMSO, -20 ° C'de saklayın; C
6 kuyulu PlakalarFisher Scientific07-200-83
Hücre süzgeci (40 & mikro; m gözenek boyutu)Corning352340
Kök hücre ayrışma çözeltisiKök hücre Teknolojileri5707Alternatif olarak, Accutase
Metil selüloz 15 cPSigma-AldrichM7027
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Media gibi yumuşak enzim çözeltileri kullanın %5 metil selüloz çözeltisi yapmak içinMilliporeSLM-202-B
1.7 ml Snap Cap Mikrosantrifüj TüpüCorning3620
Hamilton şırınga, 250 ve mikro; l LT iğnesizFisher Scientific14-815-92
PB600-1 Antijen DağıtıcıHamilton  83700
Tek kullanımlık 18 G iğnelerFisher ScientificNC9015638
27 ga 1/2 "luer uçlu iğneFisher Scientific14-826-48
2,2,2-Tribromoetanol (Avertin)Sigma-AldrichT48402
BetadineFisher ScientificNC9386574
Puralube Oftalmik MerhemFisher Scientific
Model 900 Stereotaksik çerçeveKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 Doku yapıştırıcısı 
Lidokain ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous Tek Çözeltili Hücre Proliferasyon Testi (MTS)PromegaG3580
Anti-Sox2MilliporeAB5603
Poliklonal Tavşan Anti-Glial Fibriler Asidik Protein (GFAP)DakoZ0334 ve nbsp;
in vivo görüntüleme içinIVIS KinetikPerkinElmer
K+ Tuzu Biyolüminesan SubstratPerkinElmer122796 <em>in vivo biyolüminesans görüntüleme için
EdU Görüntüleme KitiInvitrogenC10340
MSCV Lusiferaz PGK-higroAddgene18782
2x NC9689910 -

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522(2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638(2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Astrositoma ModellemeKo ullu FarelerAdenoviral CreOrtotopik AllogreftBiyol minesans G r nt lemeGenetik RekombinasyonT m rijenez Analizila Yan t Testi

İlgili makaleler