Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Astrositomlar en sık görülen primer beyin tümörü glioblastoma (GBM), bir sınıf IV astrositom vardır, 12-15 ay ^1,2 medyan sağkalım en yaygın ve agresif bir alt tiptir. Yaygın astrositomlar, özellikle GBM, istilası, tam cerrahi rezeksiyon engellemektedir adjuvan tedavilerin etkinliğini sınırlayan ve kaçınılmaz tedavi sonrası nüks ³ yol açar. De novo (birincil) GBM ile ya da kaçınılmaz (ikincil) GBM ⁴ ilerledikçe daha düşük grade astrositom ile ya başlangıçta başvururlar. GBM genomik heterojen ve üç damarlı sinyal yolları yönlendiren genler birbirini dışlayan ve co-ortaya çıkan mutasyonlar ile karakterizedir: G ₁ / S (Rb) hücre döngüsü kontrol noktası, reseptör tirozin kinaz (RTK) ve TP53 ^5-7 yolaklarıyla. GBM GBM alt tipi Grip Grip Ağrilari olduğunu düşündürmektedir, beyin hücre tiplerinin farklı benzer sentezleme profillerine sahip dört alt tipinin genomik oluşmaktadırköken ^6,8,9 kendi hücre tarafından etkilemiştir. Iyi astrositom modelleri astrositomdur patogenezi sırasında belirli hücre tiplerine mutasyonların belirli kombinasyonları rolünü tanımlamak için gereklidir. Daha verimli preklinik ilaç geliştirme için bu modelleri yararlanan hasta sonuçlarını geliştirmemize yardımcı olacaktır. Mevcut astrositom modeller, insan hücre hatları, hasta türetilmiş ksenograftları (PDX) genetik olarak tadil edilmiş normal insan astrositlerin nöral kök hücreleri (MGK) ve genetik olarak fareler (GEM) ^10-14 kurulmuş bulunmaktadır. Kortikal astrositleri ve NSC - - floxed onkojenik alleles çeşitli kombinasyonlarını barındıran GEM hasat Biz primer beyin hücrelerini kullanan bir alternatif olmayan germ GEM (nGEM) modeli ¹⁵ geliştirmiştir. Amaç, fenotipik i preklinik ilaç gelişimi için in vitro ve in vivo olarak karakterize edilmiş ve potansiyel olarak yararlanılabilir genetik olarak tanımlanmış hücrelerin astrositom modellerini üretmek için olanmmune-kompetan farelerde azaltılmıştır.

Kurulan insan hücre çizgileri Bunlar düz ön teknik yaygın olarak mevcuttur. Astrositoma patogenezinde ve in vitro ve in vivo ilaç yanıtı en yaygın olarak kullanılan model, ve immün yetersiz farelerde ^10,11,16-18, ortotopik Xenografting üzerine kinetik ve tümör oluşum nedenlerinin tanımlanmış . Onların dezavantajları sadece yüksek dereceli astrositom çalışma sınırlayıcı, düşük-dereceli astrositomlardan kurulan hücre hatları oluşturmak için yetersizlik içermektedir; Kalkış tanımlanmış bir hücre eksikliği; genellikle orijinal hasta numunesinden gelen belirgin bir şekilde farklıdır genomik profiller ile kompleks genomik anormalliklerin mevcudiyeti; ve duyarlılık serumdaki ^11,17,19-22, seri kültürü sırasında fenotipik ve genotipik sürüklenme için. Kurulan insan GBM hücre hatlarında bireysel onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçları genellikle eluc engeller aslında mevcut anomalilerin sayıda kamufle edilebilirDoğrudan genotip-fenotip sonuçları idation.

PDX immün yetersiz farelerde veya bağışıklık yetersizliği olan farelerde ^12,23 beyinlerine ortotopik enjeksiyondan önce tanımlandığı gibidir, serumsuz ortam içinde yapışkan olmayan küremsi olarak kültür yoluyla hastaya izole astrositom hücrelerinin deri altına geçişi elde edilmektedir. PDX daha doğru bir insan astrositomas genomik manzara eder, fakat bilinen insan hücre çizgilerine benzer, tek tek onkojenik mutasyonların fenotipik etkisinin genomik karmaşıklığı nedeniyle ^19,24 maskelenebilir. Özellikle yeni tedavilere karşılık olarak, belirli onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçlarını tanımlamak için, bilinen insan hücre çizgileri veya PDX panelleri genellikle, genotip-fenotip bağlantıları ortaya genelleştirilebilirliğini gösterir ve hücre çizgisi özel etkilerin ihtimalini en aza indirmek için kullanılmaktadır. PDX doğru insan astrositomaların, inc histopatolojik izlerini recapitulate ikeninvazyon luding, bilinen insan hücre çizgilerinin ortotopik ksenogrefleri genelde ^21,23,25 yok. Buna ek olarak, normal insan astrositler ve NSC in vitro ve in vivo olarak ^13,14,26 astrositom tümörogenez modellemek için tanımlandığı onkojenik mutasyonu olan genetik olarak tasarlanmış edilmiştir. Bu hücreler, bilinen insan hücre çizgileri ve PDX genomik karmaşıklığı eksikliği ve doğru bir şekilde insan astrositoma histopatoloji özetlemek, fakat in vivo olarak bağışıklık eksikliği, kemirgenlerde yabancı-doku naklinde gerektirir. Tüm insan hücre modelleri immün-aracılı ksenogreft reddini önlemek için bağışıklık yetersizliği olan kemirgen ana gerektirdiğinden, bu modeller stroma hedefli ve immün-modülatör preklinik soruşturma sınırlayıcı, bir singenik sisteminin yerel tümör-stroma etkileşimleri özetlemek başarısız ve sağlam bir bağışıklık sistemi eksikliği ^10,11 terapiler.

Onkojenik Muta önceden belirlenmiş kombinasyonları fenotipik sonuçları GEM izni incelenmesiin situ tümörigenezinde sırasında in vivo leri. -Çıkışlı şartsız GEM gelişimi boyunca bütün dokular içinde mutasyonlara sahip ise, koşullu GEM hücre tipine özgü promoterler ^10,11,15,18 kullanımı yoluyla, özel hücre tipleri Cre-aracılı rekombinasyon sınırlayan mutasyonların hedefleme olanak onkojenik allelleri floxed var. Koşullu astrositom GEM sağlam bir beyin içinde ¹¹ farklı hücre tiplerinde onkojenik mutasyonların işlevsel roller ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Koşullu GEM kullanılarak in situ gliom klinik öncesi programı 1) bir in vitro bir korelasyon eksikliği, kompleks genotipler ile, in situ tümör gelişiminde, 3) uzun gecikme farelerin büyük gruplarının bir üreten 2) zorluk içeren bir dizi faktöre ile sınırlıdır , 4) ve stokastik tümör ilerlemesi. In situ uygun bir tümör oluşumu in vitro bir model eksik olduğundan, in vitro ilaç testi ağırlık gerçekleştirilemezi'inci geleneksel koşullu GEM modelleri. Diğer kanserlerin tersine, astrositom şartlı gem modelleri nadiren tek onkogenik mutasyon ¹¹ ile uyarılmaktadır. Böylece, karmaşık ıslah programları çoklu onkojenik mutasyonlar ile koşullu GEM oluşturmak için gereklidir. Yüksek dereceli astrositom ilerleme genellikle tekdüze olmayan, stokastik bir şekilde ortaya çıkar ve sonuçta karmaşık genomik manzaralar ve hızlı büyüme kinetiği ²⁷ ile tümörlere yol açar Dahası, astrositom başlatma, bu modellerde uzun bir kuluçka döneminden sonra penetransı değişken ^{oluşur, 28.} Koşullu GEM modellerinde değişken Penetrans ve malign ilerlemesi stokastik doğası bireysel farenin preklinik ilaç araştırmaları yaptığını kayıt önce yüksek dereceli astrositomaların varlığını ve yerini belirlemek için radyografik görüntüleme ile taranmalıdır gerektirir. Birlikte ele alındığında, bu sınırlamalar pr için gerekli üretim ve koşullu GEM büyük kohortlarda test engeleclinical uyuşturucu testi.

Belirli bir nöral hücre tipleri üzerinde bulunan viral reseptörü (tva) ifade etmek üzere geliştirilen GEM enfekte etmek için kuş retroviral (RCAS) vektör kullanır RCAS-tva GEM sistemi,, geniş bir astrositoma tümörogenez ¹¹ modellemek için kullanılmıştır. Koşullu GEM aksine, bu model sistem karmaşık yetiştirme programları için gerek olmaksızın, belirli hücre tiplerinde çoklu onkojenik mutasyonun ortaya çıkmasına olanak tanır. Bununla birlikte, değişken penetrans aktif viral entegrasyonu sağlamak için bölünen hücreler için ihtiyaç ve bunlar, konakçı genomu ²⁹ içine transgenlerin rastgele yerleştirilmesi ile sınırlıdır.

Diğer model sistemler ¹⁵ sınırlamaları birçok üstesinden çünkü GEM hasat hücreleri kullanması Sigara germ GEM (nGEM) modelleri, giderek daha önemli hale gelmektedir. Astrositoma patogenezinde hücre tipinin ve birlikte görülen mutasyon başlatma rolü engellemek için zordurbu habis ilerleyişi sırasında belirsiz hücre tipinde yaygın genetik mutasyonlar birikmiş son aşama tümörlerinden türetilmiştir, çünkü maden insan GBM hücresi türleri veya PDX tesis kullanılarak. Buna karşılık, astrositomaların tüm sınıflarda spesifik saflaştırılmış beyin hücre tipleri ^11,30 içindeki genetik mutasyonlar tanımlanmış indükleyerek nGEM kullanılarak modellenebilir. Bu nedenle, belirli genetik mutasyon ve hücresel ve moleküler fenotipe hücre tipinin etkisi in vitro ve in vivo olarak belirlenebilir. Kurulan insan GBM hücre çizgilerine benzer bir şekilde, başlangıç ​​nGEM kullanılarak in vitro ilaç testleri aynı hücreleri kullanılarak, in vivo testler için ilaç öncelik için kullanılabilir. In vivo olarak tümör oluşumu daha sonra ortotopikal bağışıklık-kompetan singeneik litermatlarından ³⁰ beyinlerine nGEM hücreleri allogeneik belirlenebilir. Bu ortotopik alograft modelleridir nedenle, sadece sitotoksik a in vivo testler izinnd terapileri hedefli, ancak immün-modülatör ve stroma hedefli tedaviler de. Son olarak, tümör başlaması ve ilerlemesi üzerinde mikro-rolü, aynı hücre tipinde aynı mutasyonları kullanılarak, nGEM konvansiyonel GEM modelleri arasında sonuçları karşılaştırarak belirlenebilir.

Biz ve diğerleri birincil hücreler kullanılarak astrositomdur nGEM geliştirdik - astrositleri, MGK, ya olgodendrosit öncü hücrelerini (OPC) - GEM ^30-34 hasat. Astrositom nGEM geliştirilmesi arkasındaki mantık, potansiyel olarak, bağışıklık-kompetan hayvanlarda klinik öncesi in vitro ilaç testleri için ve in vivo kullanılabilecek belirli hücre tiplerinde onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçlarını belirlemek için bir model oluşturmak için olmuştur. Rb1 ^{loxp / loxp} veya TgGZT - Biz ifade fenotipik WT kortikal astrositleri ve non-Cre gelen MGK, floxed RB yolun bir>% 94 C57 / BL6 arka plan üzerinde muhafaza koşullu GEM hasat121 - çeşitli kombinasyonlarda ^35-39 genleri - Nf1 ^{LoxP / LoxP,} Kras ^G12D, PTEN ^{LoxP / loxp} - ve RTK / RAS / PI3K- yolu floxed. Bu Cre rekombinazı kodlayan adenoviral vektörler kullanılarak in vitro genetik yeniden neden oldu. Kortikal astrosit hasat hücre tiplerinin bir karışımını içerdiği için, bu kültürlerde GFAP ⁺ kortikal astrositler zenginleştirmek için, bu tür TgGZT insan GFAP promotöründen ₁₂₁ olarak Ad5GFAPCre vektörler veya baskın onkojenik transgenleri, ikinci. Bu in vitro ve in vivo olarak kortikal astrositler ve NSC fenotipik _G1 / S sonuçlarını (Rb) için, MAPK ve PI3K yolu tanımlanmış mutasyonlar. MAPK ve PI3K yolu ile aktive olan G1 / S hatalı olarak taklit insan astrosit moleküler proneural GBM ve ortotopik enjeksiyonu üzerine, düzgün büyüme kinetikleri, kısa süreye göre önceden belirlenmiş bir konumda oluşan tümörler, ve histopatolojikinsan GBM ³⁰ al işaretlerinden. In vivo tümör büyümesinin tedavisine boyuna izlenmesi ⁴⁰ cevaben tedavi gruplarına ya da tümör büyümesinin kantitatif analiz normalizasyonu ile klinik öncesi bir ilaç test yardımcı olur. Biz, lusiferaz sentezleyen kortikal astrositler enjekte edilmiş farelerin uzunlamasına biyolüminesans görüntüleme ile tümör büyüme kinetiklerini belirlenmiştir. Bu nedenle, elde edilen koşullu GEM kortikal astrositler ve NSC astrositom ve ilişkili mutasyonların işlevsel sonuçları ve klinik öncesi bir ilaç gelişimi için olası bir model sisteminin tanımı için izlenebilir model sistem sağlar.

Tüm hayvan çalışmaları Kuzey Carolina Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Yenidoğan Farelerde 1. ekimi Kortikal Astrositler

1. Hazırlık
   1. 2-3 hassas bir görev doku buruşturma ve% 70 etanol ihtiva eden bir kabın dibine içine koyun. Kesme makasları, kavisli bir forseps ve bu balona düz mikro forseps 2 çift yerleştirin. Dokular, mikro forseps eğilmesini önlemek için kullanılır.
   2. Bir 60 mm doku kültürü çanağı, HBSS içinde 1 ml ilave edilir. Her bir hayvan için ayrı bir çanak hazırlayın ve buz üzerinde yemekleri korumak.
   3. Kurumsal düzenlemeler başına hayvanların anestezisi.
   4. Sıcak% 10 fetal sığır serumu ve 1% penisilin-streptomisin (tam bir DMEM), 37 ° C su banyosu içinde, her hayvan için DMEM 7 ml. NOT: 5 fareler için, 1.1.1-1.1.4 ~ 15 dakika sürer adımları.
2. Doku Hasat
   1. Instituti başına yenidoğan fare (günde 1-3) KurbanÖnal düzenlemeler.
   2. , Etanol kesme makasları kaldır onları kuru damla izin ve burun omurilikten kafatası üzerinde deri bir sagital kesim yapmak.
   3. Omurilik başlayan ve bulbuslarında geçmiş uzanan, sagital sütür boyunca kafatası bir kesim olun. Beyin doku hasarı en aza indirmek için kafatasının iç yüzeyine yakın makas ipuçları tutmaya özen gösterin.
   4. Kavisli bir forseps kullanarak, yavaşça yanal beyin uzak kraniyumun her yarımkürede soyun.
   5. Düz mikro forseps kullanarak, yavaşça her kortikal yarımkürenin dorsal kısmını uzak çimdik ve HBSS içeren doku kültürü çanak içine yerleştirin. Beyincik ve koku ampul önlemek için özen gösterin. Korpus kallosum altındaki herhangi bir doku almayın.
   6. Diseksiyon mikroskobu ve mikro forseps 2 çift kullanarak, yavaşça her kortikal yarımkürede meninksler kaldırmak. Doku homogenizatio başlayana kadar buz doku kültürü çanak dönn.
   7. Her ek hayvan için 1.2.6 ile 1.2.1 adımları. NOT: 5 fareler için, 1.2.1-1.2.7 ~ 30 dakika sürer adımları.
3. Doku Homojenizasyon
   1. Temiz bir jilet kullanarak, ince kortikal hemisferlerin zar ve doku kültürü kaputu plaka taşıyın.
   2. Bir steril 15 ml konik bir tüp içine küp şeklindeki doku aktarın. Buz gibi soğuk HBSS 1 ml, plakayı yıkayın ve doku ihtiva eden tüpe aktarın.
   3. Doku tüpünün tabanına yerleşir kadar, daha sonra dikkatli bir şekilde bir pipet kullanarak fazla HBSS kaldırmak bekleyin.
   4. Oda sıcaklığı tripsin / EDTA, 2 ml ilave edilir. 1 ml pipet pipet ~ 10x daha fazla hücreleri ayırmak.
   5. 20 dakika - 15 boyunca 37 ° C'de hücre süspansiyonu inkübe edin. Dikkatle ters çevirme ile her bir 5 dakika karıştırın.
   6. Tripsin inhibe etmek için tam DMEM 3 ml ilave edilir. 1 ml'lik bir pipet pipet ~ 10x çözeltinin karıştırın.
   7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
   8. Kaldır1 ml'lik bir pipet ile yüzer. Pelet gevşek olabilir çünkü orta aspire etmeyin.
   9. DMEM ile tamamlanmış, 37 ° C, 4 ml pelletini. 75 cm hücre süspansiyonu aktarın üst doku kültürü şişesi vidalı. NOT: 5 fareler için, 1.3.1-1.3.9 ~ 50 dakika sürer adımları.
   10. Yaklaşık astrosit hasattan sonra 16 saat, daha sonra DMEM ile tamamlanmış C 4 mi 37 ° ekleyin 37 ° C'de 4 ml HBSS ile balonun yıkayın. % 5 _CO2 içinde 37 ° C 'de kortikal astrositler koruyun. NOT: yıkama adımı kültürü çanak yapışmayan hücrelerin uzaklaştırılması ve kalıntının için önemlidir.
   11. Kültür olduğunda ~% 95 birleştiğinde,% 5 37 ° C'de gece boyunca çalkalanır _CO2, müstakil hücreleri ihtiva eden ortam daha sonra 37 ° C'de 4 ml HBSS ile balonun yıkayınız. % 5 _CO2 içinde 37 ° C'de hücreler DMEM doldurun ve muhafaza 37 ° C 4 ml ilave edilir. NOT: Bu adım kortikal astrositlerde için kültürlerini zenginleştirmek için önemlidir, mikroglianın kirlenmesine olarak veolgodendrosit progenitör hücreler bu prosedür ile ayırmak ve kültürden ⁴¹ kaldırılır.
   12. Tekrar her bir hayvan için 1.3.1-1.3.11 adımları.
4. Genetik Rekombinasyon indüksiyon
   1. 24 saat 1.3.11 adımı tamamlandıktan sonra DMEM ile tamamlanmış, 37 ° C, 2 ml orta yerine. Ad5CMVCre veya Ad5GFAPCre> 10 ¹⁰ pfu / ml 1 ul içeren 37 ° C SCM 1 ml ekleyin. Kullanım BSL2 güvenlik önlemleri taşıma rekombinant adenovirüsün:% 5 _CO2 .CAUTION 32 ° C'de 6 saat süreyle inkübe edin.
   2. Virüs içeren ortamları çıkarın ve kortikal astrositlere virüs olmadan 37 ° C tam DMEM ekleyin. DİKKAT: BSL2 güvenlik önlemleri rekombinant Adenovirusların taşıma ve kurumsal düzenlemelere göre virüs içeren medya atarken. NOT: - ~ 6 saat inkübasyon hariç 15 dakika sürer 1.4.3 5 Astrosit kültürler için, 1.4.1 adımları.
   3. En çok kortikal Astrosit kültürleri genişletvitro ve in vivo karakterizasyonu. Not: yeniden birleştirilmiş gen için ya da belirli bir mutasyona uğramış proteinin ya da onun sinyal sonuçlarından biri için immünoblotlar ile spesifik primerler kullanılarak PCR ile takip rekombinasyon Cre mutasyonların varlığını belirlemek. Cre rekombinasyon sonra kortikal astrosit kültürlerinin fenotipik stabilizasyonu için gerekli süre kullanılan mutasyon bağlı olacaktır ve deneysel olarak (Şekil 2) tespit edilmelidir.

Yenidoğan Farelerde 2. ekimi Nöral Kök Hücreler

1. Hazırlık
   1. 98 mM _{Na-2 SO4,} 30 mM K _{2 SO4,} 5.8 mM _MgCl2, 0.25 mM _CaCl2 - diseksiyon başlamadan önce, 3.1 mg papain ve 4 ml ayrışma ortamı 1,3 mg sistein eklenerek beyin başına 4 mi sindirim çözelti hazırlamak , 1 mM HEPES, 20 mM glükoz,% 0.001 kırmızı Fenol ve 0.125 mM NaOH (1 M HEPES pH 7.4 stoktan). Papain ilavesive ayrışma ortamı sistein çözelti sarıya döner.
   2. 15 dakika için 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. Tersine çevirerek periyodik karıştırın.
   3. Sindirim çözüm kırmızı renk ışık dönene kadar 0,1 M NaOH damla damla ekleyin.
   4. Bir doku kültürü kaput, steril bir filtre, bir şırınga filtresi (0.22 um gözenek boyutu) kullanılarak sindirim çözeltisi. Buz üzerinde sindirim çözeltisi tutun.
   5. 44.5 mi MGK bazal ortam, 5 mi MGK ek, 0.5 ml penisilin-streptomisin, 50 ul% 0.2 heparin, 10 ul 100 ug / ml EGF ve 10 ul 100 ug / ml karıştırılarak Kök Hücre Orta (SCM) 50 ml hazırlamak bFGF'dir. 4 ° C'de saklandığında, SCM 1 hafta süreyle stabildir.
   6. Tam HBSS (cHBSS) HBSS 10x 50 mi, 1.25 mi, 1 M HEPES (pH 7.4) karıştırılarak hazırlanması 15 ml 1 M D-glikoz, 5 ml 100 mM _CaCl2, 5 ml 100 mM MgSO ₄ ve 2 mi 1 M _NaHCO3. GKD ₂ O ile 500 ml toplam hacmi getirmek
   7. CHBSS zekâ sterilize Filtre4 ° C 'de 0.2 hektar um gözenek boyutlu filtre saklayın.
   8. 2-3 hassas bir görev doku buruşturma ve% 70 etanol ihtiva eden bir kabın dibine içine koyun. Kesme makasları, kavisli bir forseps, ve bu balona düz mikro forseps 2 çift yerleştirin. Dokular, mikro forseps eğilmesini önlemek için kullanılır. NOT: 5 fareler için, 2.1.1-2.1.8 ~ 45 dakika sürer adımları.
2. Doku Hasat
   1. Kurumsal düzenlemeler başına neonatal (gün 1-3) fareler kurban.
   2. ,% 70 etanol kesme makasları kaldır onları kuru damla izin ve burun omurilikten kafatası üzerinde deri bir sagital kesim yapmak.
   3. Omurilik başlayan ve bulbuslarında geçmiş uzanan, sagital sütür boyunca kafatası bir kesim olun. Beyin doku hasarı en aza indirmek için kafatasının iç yüzeyine yakın makas ipuçları tutmaya özen gösterin.
   4. Kavisli bir forseps kullanarak, yavaşça yanal uzak gelen kraniyumun her yarımkürede soymabeyin.
   5. Yavaşça buz cHBSS yılında tüm beyin ve yer çıkarın.
   6. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, dikkatle ince diseksiyon araçları ile beyin meninks çıkarın.
   7. Alt yüzeyinde beyin yerleştirin ve bir boyutu 11 neşter ile keser dikey (koronal) ile beyincik / arka beyin ve koku alma ampul / frontal korteks kaldırmak.
   8. Böylece beynin koronal görünümünü üreten, kuyruk kısmına yerleştirmek için 90 ° kalan beyin Döndür. Lateral ventriküllerin bulun.
   9. Subventriküler bölgesini (SVZ'una) içeren bir kübik bir bölümünü kesmek.
   10. Boyutu 11 neşter ile taze buz soğuk cHBSS ve kıyma dokusu olan bir 60 mm doku kültürü çanağı için doku SVZ'una içeren aktarın.
   11. , Steril bir 15 ml tüp içine kıyılmış doku aktarın. Buz üzerinde tüp yerleştirin.
   12. 1-2 ml buz soğukluğunda cHBSS ile petri yıkayın. Doku içeren tüp yıkama çözeltisini.
   13. Tekrar ek neonata ile 2.2.1-2.2.12 adımlarıL. farenin gerekirse. Protokol kalanı için bir doku kültürü kaputu 15 ml tüpler aktarın. NOT: - ~ 45 dakika sürer 2.2.13 5 fareler için, 2.2.1 adımları.
3. Doku Homojenizasyon
   1. 5 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde sindirim çözeltisi (aşama 2.1.1 'de hazırlanmış) yerleştirin. Ayrıca, bir 37 ° C su banyosu içinde beyin başına sıcak 2 mi SCM.
   2. Dikkatle 1 ml pipet ile kıyılmış doku süpernatant kaldırmak. Aspire etmeyin.
   3. 15 ml tüp başına 2 ml 37 ° C sindirim çözüm ekleyin ve tersine çevirerek iyice karıştırın.
   4. 15 dakika için 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. Ters çevirme ile her bir 5 dakika karıştırın.
   5. Her tüp ve tekrar adım 2.3.4 37 ° C sindirim solüsyonunun başka bir 2 ml ekleyin.
   6. Hücreler, yerçekimi ile tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin, daha sonra 1 mL pipet kullanılarak sindirilmiş dokusundan süpernatantı kaldırmak.
   7. CHBSS seyreltilmiş 10 mcM E-64 2 ml ekleyin ve tersine çevirerek iyice karıştırın.
   8. Hücreler, yerçekimi ile tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin sonra sindirilmiş dokudan süpernatantı kaldırmak.
   9. 37 ° C cHBSS 1 ml ilave edilir ve 1 ml pipet ucu (~ 20 vuruş) ile homojenize edilmiştir. Doku homojenizasyon sırasında hava kabarcığı enjekte kaçının.
   10. Daha sonra 37 ° C'de, 5 ml cHBSS ile süzgeç yıkayın, 40 mikron gözenek büyüklüğü hücre süzgecinden dokusu Homojenat geçirin.
   11. 5 dakika boyunca 125 x g'de doku Homojenat santrifüj.
   12. Hücre topaklarını bozmadan 1 ml'lik bir pipet ile% 95 arasında yüzer çıkarın. 200 ul pipet ile 200 ul 37 ° C SCM dikkatlice tekrar süspansiyon hücre pelet.
   13. 1.8 ml 37 ° C SCM ekleyin ve steril 6 delikli bir plakanın bir oyuğuna hücre süspansiyonu aktarın. NOT: 5 fareler için, 2.3.1-2.3.14 ~ 75 dakika sürer adımları.
4. Nöral Kök Hücre Kültürü
   1. Başka bir 2 mi 37 ° eklenerek 3 gün sonra, ortam doldurmakC SCM.
   2. 7 gün sonra, 15 ml'lik bir tüpe aktarın ve neurospheres Neurospheres> 5 dakika boyunca yerçekimi ile razı.
   3. Süpernatantı ve 2 ml 37 ° C SCM ekleyin.
   4. 6 delikli bir plakanın yeni bir oyuğuna transfer neurospheres.
   5. Her 3-4 gün 37 ° C SCM 2 ml ekleyin ve her 7 gün orta tamamen değiştirebilir.
   6. Neurospheres çapı> 100 mm ise, dikkatli bir şekilde kök hücre ayrışma çözeltisi ile ayırmak ve istenen hücre yoğunluğu MGK Replate.
5. Genetik Rekombinasyon indüksiyon
   1. Şu anda hücreleri üzerinde SCM 2 ml Ad5CMVCre veya Ad5GFAPCre> 10 ¹⁰ pfu / ml 'lik 1 ul ihtiva eden 37 ° C SCM 1 ml ilave edilir. DİKKAT: BSL2 güvenlik önlemleri rekombinant adenovirüs taşıma.
   2. % 5 _CO2 içinde 32 ° C'de 6 saat süreyle inkübe edin.
   3. 15 ml'lik bir tüp içine neurospheres ile SCM aktarın ve küreler 5 dakika boyunca yerçekimi ile razı.
   4. Daha sonra 200 ul pipet ile, 1 ml'lik bir pipet ile ilk süpernatantı. DİKKAT: BSL2 güvenlik önlemleri rekombinant Adenovirusların taşıma ve kurumsal düzenlemelere göre virüs içeren medya atarken.
   5. 6 plaka transfer sonra MGK virüs olmadan 37 ° C SCM 2 ml ilave edilir. NOT: 5 MGK kültürler için, 2.5.1-2.5.5 ~ 6 saat inkübasyon hariç 15 dakika sürer adımları.
   6. Ertesi gün, tekrar gerekli olduğu durumlarda neurosphere geçirme ile, ardından adım 2.5.1-2.5.5. Küreler şimdi in vitro karakterizasyonu ve in vivo Fare beyinleri ortotopik enjekte edilmeden önce, 2-3 geçişleri için genişletilebilir. Not: yeniden birleştirilmiş gen için ya da belirli bir mutasyona uğramış proteinin ya da onun sinyal sonuçlarından biri için immünoblotlar ile spesifik primerler kullanılarak PCR ile takip rekombinasyon Cre mutasyonların varlığını belirlemek. Cre yeniden birleşme sonrası kültürleri MGK fenotipik stabilizasyonu için gerekli olan zamana bağlı olacaktır(Şekil 2 ve 3) kullanılan mutasyon ve deneysel olarak tespit edilmelidir.

Alıcı Iimmunocompetent Fareler Beyin içine Rekombine Hücreleri 3. Ortotopik Enjeksiyon

1. % 5 Metil selüloz hazırlanması
   1. 100 ml 50 ml'lik bir son hacme kadar iyonu giderilmiş su içinde 15 cps metil selüloz, 5 g çözülür vida kapaklı şişeye. Kümeleşmesini önlemek için 4 ° C sıcaklıkta yavaş yavaş karıştırılarak toz ekleyin. Bu çözüm girmek için tüm metil selüloz, 4 ° C de karıştırılarak 24 saat kadar sürebilir.
   2. Şişeyi tartın ve ağırlığı kaydedin.
   3. % 5 metil selüloz çözeltisi otoklava. Otoklavlanmış sonra, metil selüloz, bir yarı katı jel haline gelecektir.
   4. Şişe tartılır ve otoklav sırasında kaybedilen ağırlığın hesaplanması.
   5. Aseptik kayıp ağırlığının her gramı için steril su içinde 1 ml.
   6. Buz üzerine yerleştirin ve 50 ml buz soğukluğunda 2x DMEM ekleyin. </ Li>
   7. Gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 20 ml'lik miktarlar halinde,% 5 metil selüloz çözeltisi bölmek için steril tekniği kullanın. Altı aya kadar veya 2x DMEM sona erinceye kadar 4 ° C'de saklayın tümbölenleri. NOT: adımlarla% 5 metil selüloz çözeltisi hazırlanması 3.1.1-3.1.7 2,5 gün ~ alacaktır.
2. Enjeksiyon için Kortikal Astrositler hazırlanması
   1. Hasat kortikal astrositler zaman ~% 90 konfluent.
   2. Toplama, aspirat bitmiş DMEM ve 37 ° C HBSS eşit hacimde plakaları yıkayın.
   3. Plaka karşılamak için yeterli tripsin ekleyin. Yavaşça tilt ve hücreleri ayırmak başlayana kadar plaka dokunun.
   4. DMEM ile tamamlanmış C 37 ° 'lik bir eşit hacmi ile tripsin etkisiz hale getirirler.
   5. 50 ml'lik konik bir tüp hücreleri aktarın ve 3.2.4 kullanılan 37 ° C'de tam DMEM aynı hacme sahip olan, plakayı yıkayın.
   6. Hücreleri içeren tüp yıkama medya aktarın. 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
   7. Aspire s1 ml 37 ° içinde upernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri DMEM tamamlamak C.
   8. Hücre / ul sayısını belirlemek için bir hemasitometre ya da başka bir uygun hücre sayacı kullanılarak hücre süspansiyonu sayın.
   9. Yeni bir 15 ml konik tüp hücreleri istenilen sayıda aktarın. 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
   10. 37 ° 800 ul süspanse hücreler DMEM tamamlamak C. Hücre topağı hacmini (- 800 ul hücre süspansiyonu, toplam hacim) belirler. NOT: Bu enjeksiyon için doğru bir hücre konsantrasyonu elde etmek esastır. Bu durumda, hücre topağın hacminin aşamasında 3.2.12 eklemek% 5 metil selüloz hacmi hesaplamak için bu aşamada tespit edilmelidir.
   11. Steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücreleri aktarın ve daha sonra 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
   12. Aspire hücre topağından süpernatan ve buz-soğuğu% 5 metil selüloz uygun hacimde kortikal astrositler tekrar süspansiyon (toplam hacmi istenen - hacimhücre topağı) hücre / ul istenen sayıda elde etmek için.
   13. Enjeksiyona kadar buz üzerinde hücreleri yerleştirin.
   14. Daha sonra şırınga üzerine künt bir 18 G iğne yerleştirmek bir tekrarlanması Antijen sebili içine 250 ul cam şırınga yerleştirin.
   15. Kortikal astrocyte süspansiyon iğne ile pistonu yavaşça geri çekin; hava kabarcıkları sıkıştırmak ve aslında beyin içine enjekte edilen hacim azalacak, çünkü çıkarılmalıdır hücreleri üzerinde bir hava kabarcığı olacaktır.
   16. Sadece kortikal astrosit süspansiyonun üstünden iğne ucu tutun ve hızlı bir şekilde pistonu itin. Hava kabarcığı hızlı hücre süspansiyonu daha hareket edecek ve çoğunlukla ihraç edilecektir.
   17. Tüm hava kabarcıkları olana kadar, tekrarlayın Adım 3.2.16 iğne kaldırılır.
   18. Yaklaşık ~ 200 ul şırınga doldurun, sonra iğne yukarı tutun ve duruncaya kadar geri pistonu çekin. Küçük hava kabarcıkları iğne ucu tuttuğunu ve hızlı bir şekilde yaklaşık 5 pistonu iterek çıkarılabilir0 ul sonra yavaş yavaş tam kapasite çekilmesi.
   19. Dik ucu tutun ve adımı 3.2.18 4-5x tekrarlayın.
   20. 18 iğne atın ve şırınga üzerine 27 G iğne sığacak.
   21. Sıvı iğne çıkana kadar antijen dağıtıcı üzerindeki düğmesine basın. NOT: 1 Astrosit hücre hattı için, 3.2.1-3.2.21 ~ 60 dakika sürer adımları.
3. Enjeksiyon için MGK hazırlanması
   1. Neurospheres çapı> 100 mikron olduğunda, 15 ml tüplere aktarmak ve Neurospheres> 5 dakika boyunca yerçekimi tarafından razı olsun.
   2. Süpernatantı, örneğin kök hücre ayrışma çözeltisi ya da ⁴² tarif edildiği gibi, üreticinin talimatlarına göre veya% 0.05 tripsin-EDTA ile uygun Accutase gibi hafif bir ayrışma reaktif ile neurospheres, ayrışır.
   3. Serum MGK maruz kalmadan, üreticinin talimatlarına uygun olarak ayırma reaktifleri inhibe eder. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
   4. Hücre / ul sayısını belirlemek için bir hemasitometre ya da başka bir uygun hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın.
   5. Yeni bir 15 ml konik tüp MGK istenilen sayıda aktarın. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
   6. 37 ° C'de 800 ul HBSS içinde süspansiyon hücreleri. Hücre topağı hacmini (- 800 ul hücre süspansiyonu, toplam hacim) belirler. NOT: Bu enjeksiyon için doğru bir hücre konsantrasyonu elde etmek esastır. Bu durumda, hücre topağın hacminin aşamasında 3.3.9 eklemek% 5 metil selüloz hacmi hesaplamak için bu aşamada tespit edilmelidir.
   7. Steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne hücreleri transferi ve daha sonra 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj.
   8. Süpernatantı aspire ve 3.2.12-3.2.21 gibi ortotopik enjeksiyon için hücrelerin hazırlanması bitirmek. NOT: 1 MGK hücre hattı için, 3.3.1-3.3 adımları.9 ~ 60 dakika sürer.
4. Enjeksiyon için Fare hazırlanması
   1. Kurumsal IACUC kurallarına göre 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribromoetanol) ya da 100 mg / kg ketamin artı 10 mg / kg ksilazin bir İP enjeksiyonu vasıtasıyla, alıcı hayvan anestezisi. NOT: Kullanılan burada allogreft olarak ana yaşı 3-6 ay farenin vardır. Farklı yaşlarda farenin ur gelişimi üzerindeki gelişimsel beyin yaşın microenvironmental etkisini araştırmak için kullanılabilir.
   2. Clippers ya da makasla kesi sitesi üzerinden kafa derisi tıraş.
   3. % 70 etanol ve betadin 3 alternatif çubukla cerrahi siteyi sterilize.
   4. Göz kırpma refleksi kaybı nedeniyle herhangi bir zarar görmesini önlemek için gözleri oftalmik merhem sürün.
   5. Pedalı geri çekme (ayak tutam) refleks ile anestezi derinliği değerlendirin. NOT: 5 fareler için, 3.4.1-3.4.5 ~ 15 dakika sürer adımları.
5. Orthotopik İmplantasyon
   1. Stereotaksik çerçeveye hayvan edin.
   2. Makgözleri ve kulakları arasındaki yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda sagital sütür üzerinde bir kesi e.
   3. Koronal ve sagital sütür (Bregma) kesişimi yanı sıra lambdoid ve sagital sütür (Lambda) kesişimini bulun. Bregma ve Lambda aynı yatay düzlemde olduğundan emin olun.
   4. Şırınga hücre süspansiyonu içeren ve başının üzerinde stereotaksik çerçeve antijen dağıtıcı yinelenen takın. Bregma ile temas, 27 G iğne ucu getirin. Bu, üç boyutlu koordinatlar manipülasyonu için kullanılacak kökenlidir.
   5. Kafatası yüzeyinden hafifçe iğne kaldırın ve 2 mm lateral ve bregmadan 1 mm rostral taşıyın.
   6. Bregmadan, hedef 4 mm ventral kafatası dikkatle iğne indirin. NOT: bazal ganglionlar hedeflemek için bu stereotaktik koordinatları kullanılmıştır. Farklı Stereotaktik koordinatları farklı microenvironmental etkisini araştırmak için kullanılabilirur gelişimi üzerindeki etkileri beyin bölgelerinde.
   7. Yinelenen antijen Dispenseri bir kez aktive ederek hücre süspansiyonu 5 ul enjekte edilir. 2 dakika kafa içi basıncı dengelenmeye gelmeye bırakın için iğneyi yerinde bırakın.
   8. Yavaş yavaş 30 saniyelik bir süre boyunca iğnenin geri çekilmesi. Oluşabilecek herhangi bir kanama basınç uygulamak için bir pamuklu çubuk kullanın.
   9. Yara kenarları yaklaştığı ve doku yapıştırıcı kullanılarak kesi kapatın. Kesi yerinde Lidokain subkutan 20 ul uygulayın. NOT: 5 fareler için, 3.5.1-3.5.9 ~ 50 dakika sürer adımları. UNC IACUC sadece lokal anestezi postoperatif kullanımını onayladı. Yerel kurumsal IACUC ile istişare Bu işlemden sonra postoperatif analjezik kullanım şartlarına ilişkin tavsiye edilir.
6. Post-Cerrahi Bakım
   1. Kurtarmak için temiz, sıcak bir kafeste hayvanları yerleştirin. Kazara oluşabilir aspirasyon gibi hayvanlar, doğrudan yatak içine yerleştirilmiştir olmamalıdır.
   2. GözlemleyinBu tımar, yeme ve dışkılama gibi normal davranışı sürdürme hayvanlar. NOT: Normal davranış Sürmesine ~ 60 dakika sürebilir.

Bu, fenotipik olarak in vitro ve in vivo olarak karakterize edilebilir koşullu onkojenik alelleri (Şekil 1) floxed yenidoğan GEM barınağı hasat kortikal astrositler ve MGK bir nGEM model sistemi geliştirmiştir. Özellikle in vitro kortikal astrositler onkojenik mutasyonların sonuçlarını incelemek için, ilk olarak astrositleri zenginleştirmek için kritik öneme sahiptir. Kortikal astrosit hasat mikroglia, astrositler, oligodendrositler, OPC ve nöronların bir karışımını içeren, mekanik ve genetik yöntemler astrosit zenginleşmesine yardımcı olabilir. Nöronlar normal kültür koşulları altında kalıp ise, mikroglia ve oligodendrosit gece boyunca çalkalanarak 41,43 çıkarılabilir. Ayrıca, bir Ad5GFAPCre kullanarak GAFP + astrositlere hedefleyen floxed, onkojenik allel genetik rekombinasyon astrositlerde için zenginleştirebilirsiniz. Biz flo ile Rb1 loxp / loxp GEM yavrular kortikal hasat bulaştırmak için bu yöntem kullanılırxed Nf1 loxp / loxp ve / veya PTEN loxp / loxp alelleridir. Ad5GFAPCre enfeksiyon,% 59 5 sonra>% 90 saflık için ideal astrosit artan yeniden birleştirilen GFAP + astrositler, proliferatif bir avantaj neden - Kültürde 9 geçişleri (Şekil 2A ve 2B). Alternatif olarak, 121 TgGZT farelerde (Şekil 2C) hasat astrositlerde proliferatif avantaj indüklemek için GFAP promoterinin kontrolü altında tanımlanması suretiyle T 121 astrositlerin zenginleştirilmiş. Kortikal astrositler kültür çanağı (Şekil 2C) için yapışkan büyürken NSC nitro (Şekil 3A) olarak yapışkan olmayan neurospheres olarak büyür. TRP olarak adlandırılan TgGZT 121 (T), Kras G12D (R) ve homozigot PTEN delesyonu (- P - - /) yeniden birleştirilmiş olan WT MGK ve NSC ikisi de onkojenik allel floxed- / - - Sadece MGK TgGZT 121 içeren GEM hasat Cre-aracılı rekombinasyon (Şekil 3B) sonra T 121 ifade ederken, MGK işaretleyici Sox2 ifade eder.

G 1 / S (Rb), MAPK ve / veya PI3K yolu değişiklikler GFAP'nin büyümesini nasıl etkilediğini belirlemek için + Astrositler in vitro, proliferasyon iki yöntem kullanılarak incelenmiştir. MTS ve T hücre sayımı ve 121 Kras G12D ifade kortikal astrositler (Şekil 4A ve 4B) çoğalmasını arttığını göstermiştir. Benzer şekilde, homozigot RB1 (Rb) ve Nf1 (K), heterozigot PTEN (p +/-) delesyon aynı zamanda artan kortikal astrosit proliferasyon (Şekil 4C) ile birleştirildi silme. Dönüştürülmüş hücreler sınırsız çoğalma kapasitesine sahiptir. Mutasyonların dönüştürme etkisi col kullanılarak in vitro ölçülebilirony oluşum analizleri. Daha önce tarif edildiği gibi 44 koloni oluşturma deneyi ile kortikal astrositler - / - Bu nedenle TRP T 121 ve Kras G12D ifade ve homozigoz PTEN delesyonu dönüşürken etkilerini test ettik. WT Astrositler koloniler teşkil etmedi Oysa, T astrocytes 1.03 verimliliği% koloniler kurdu. Özellikle, TRP - / -% 6.40 astrositler (Tablo 1) en yüksek koloni oluşumu etkinliği vardı. Klinik öncesi bir ilaç testleri için uygun olması amacıyla, in vitro tümör modellerinde kolayca Genetik olarak manipüle edilmesi önemlidir. İlave genetik değişiklikler stabil olarak plazmid ya da viral vektörler tarafından kortikal astrositler içine sokulabilir. Bir VSV-psödotipli pMSCV retroviral vektör kullanılarak - / - astrositler (luc - / - TRP), bir örnek olarak, kararlı bir şekilde TRP içine lusiferaz geni transduse. Lusiferaz ekspresyonu, ebeveyn hücreleri ile karşılaştırıldığında ışık yayılması ~ 1000 kat arttı ( astrositler, in vitro olarak hedef inhibitörlerinin etkinliğini belirlemek için kullanılabilir. Düşük doz PG-103, ikili bir mTOR / PI3K inhibitörü ile tedavi hücre canlılığı 30 etkilemeden PI3K sinyallemesini inhibe ettiği daha önce gösterilmiştir. Ancak, daha yüksek PI-103 doz sitostatik / sitotoksik etki tespit edilmedi. In vitro astrocyte büyüme - / - Böylece biz PI-103 TRP azaltabilir olup olmadığını test ettik. - / - Astrosit büyüme (Şekil 4E) PI-103 TRP maksimal% 88 azalmaya neden oldu. Astrositler in vivo diğer klinik ilgili terapötiklerinin test etmek için (Schmid ve ark, el yazması teslim.) 45,46 - / - Biz daha önce TRP ortotopik alograftlarını kullanmıştır. Bu veriler, koşullu GEM hasat dönüştürülmüş kortikal astrositler Bağışıklık olarak güçlü mikrofon ön-klinik ilaç testi gerçekleştirmek için olan esnek bir model sistemi temin edebileceğini öne sürmektedirör.

Oluşturulmuş insan hücre çizgileri ve PDX Ksenograftlar bağışıklık yetersizliği olan ana gerektirir. PDX aksine, bir çok insan GBM kurulmuş hücre çizgileri GBM histopatolojik özellikleri özetlemek yoktur. Örneğin, U87MG orthotopik ksenogratflardır, normal beyin (Şekil 5A) istila etmedi sınırlı tümörler kurdu. Bunun aksine, TRP enjeksiyonu - / - Bağışıklık olarak güçlü, sinjeneik farelerden beyinlerine astrositler insan muadilleriyle normal beyinden (Şekil 5B), özellikle istilasının histolojik özelliklerini değinmeyecek invaziv tümörleri verdi. - / - Uzunlamasına TRP ölçmek için alograft büyüme fareler, 5 günde bir hücre enjeksiyonundan sonra kurban edildi ve tümör yükü H & E ile boyanmış beyin kesitleri üzerinde tümör alanı ölçülerek belirlenmiştir. Tümör alanı zaman (Şekil 5C) katlanarak arttı. 10 5 TRP ortotopik enjeksiyon - / - r içine astrositleriecipient beyinleri 22 gün (Şekil 5D) medyan sağkalım, nörolojik morbidite yol açtı. - / - NSC kortikal astrositleri ek olarak, TRP kullanılarak ortotopik enjeksiyonları uygulandı. TRP - / - NSC-türevli tümörler proliferatif pozitif T 121 idi, ve (Şekil 6) MGK işaretleyici Sox2 ifadesini sürdürdü. Koşullu GEM bu zaman dilimi boyunca tümörogenez ortaya çıkarmada başarısız ikinci not, unrecombined wt C57BL / 6 fareler gibi fenotipik WT kortikal astrosit veya NSC hasat kortikal astrositler ve MGK enjeksiyon, (veriler gösterilmemiştir) onkojenik aleller floxed. In vivo görüntüleme Boyuna ilaç tedavileri 40 tepki olarak tümör büyüme kinetiklerini izlemek için kullanılmıştır. Bu nedenle TRP - / - Luc astrositler seri biyolüminesans görüntüleme ile tespit edilmiştir, bağışıklık yetkin sinjeneik litermatı ve tümör büyümesinin beyinlerine enjekte edildi. Biyoparlaklık 16 gün zarfında 15 kat arttı(Şekil 7A ve 7B). Koşullu GEM hasat kortikal astrositler ve MGK genetiği değiştirilmiş ve fenotipik in vitro ve genetik ve astrositom patogenezinde hücre biyolojisi tanımı için in vivo özelliği ve potansiyel klinik öncesi ilaç geliştirme için kullanılabilir olduğunu ortaya koyduk.

NGEM kortikal astrosit ve MGK hasat Şekil 1. Şematik. Fenotipik WT kortikal astrositler ve MGK koşullu onkojenik allelli GEM hasat edildi. Genetik rekombinasyon bir AdCre vektör ile in vitro olarak uyarıldı. Dönüştürülmüş hücreler fenotipik olarak, bağışıklık-kompetan beyinlerine çeşitli yöntemlerle ve ortotopik enjeksiyonu ile in vivo, in vitro olarak karakterize edilmiştirSingeneik litermatlarının.

In vitro seri pasaj üzerine GAFP + astrositlerde Şekil 2. Zenginleştirme. RB1 loxP hasat GFAP + astrositler gösterilen Örnek imüno görsel / Nf1 loxp / loxP ve / veya PTEN, loxP / loxP ile loxp gem yavrular olan genetik rekombinasyon Ad5GFAPCre ile görülmüş ve X, kat (PX) pasajlama hücreler (A). Paneli A. Barlar GAFP + astrositlerde zenginleşme Kantitasyonu 3-24 çoğaltır (B) standart hata temsil eder. Temsilci immünfloresans (üst) ve faz kontrast (alt) geçişte de GAFP promoterinden T 121 ekspres TgGZT 121 GEM yavrular hasat yapışık kortikal astrositlerde görüntüleriYaş 9 Ad5CMVCre in vitro olarak (C), sonra yeniden bağlanma. Astrositler her geçiş DAPI ile boyanmış çekirdekleri (mavi) toplam sayısına bölünerek GFAP + (yeşil), hücrelerin sayısı olarak ölçüldü. Görüntüler 10X orijinal büyütme (A, C) alınmıştır. Ölçek çubukları 100 mikron (A, C) temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

- / - GEM Şekil 3. WT ve recombined MGK TRP hasat. - / -, Fenotipik olarak WT ile (üst) ve TRP temsili Faz kontrast görüntüleri (alt) NSC Neurospheres in vitro olarak (A) gibi büyütülür. T 121 (yeşil) ve Sox2 Temsilcisi immünoflüeresans boyama- / - (Alt) Neurospheres (B), WT ile (üst) ve TRP (kırmızı) ekspresyonu. Ölçek çubukları temsil 100 mikron (A, B). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

In vitro kortikal astrositlerde 4. Karakterizasyonu Şekil. WT ve TR kortikal astrositler büyümesi 1-7 günlük (A) hücre sayımı yolu ile belirlendi. WT ve TR kortikal astrositler nispi optik yoğunluk (OD) MTS (B) ile belirlenmiştir. WT nispi büyüme ve yeniden bir araya RB1 - / -; Nf1 - / -, PTEN +/- (RbNP +/-) MTS (C) ile belirlenmiştir astrositlerden salınmaktadır. - / - Ve lucifer ebeveyn TRP arasında Lüminesansase ifade TRP - / - astrositler (TRP - / - luc), (D). - / - TRP göreli OD MTS (E) ile belirlenen, 5 gün boyunca PI103 ile muamele astrositlerden salınmaktadır. Çoğalma ve doz-yanıt 5. Barlar durum başına 6 çoğaltır standart hatasını temsil GraphPadPrizmasındaki üstel büyüme denklemi kullanılarak hesaplandı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Vivo gliom Şekil 5.. Bir U87MG xenograftlarının Temsilcisi H & E boyalı bölüm ayrık tümör kenar (A) gösterir. - / - Bir TRP Temsilcisi H & E boyalı bölüm allogreft normal beyindeki yaygın işgali (gösterirB). Sağ ve sol H & E görüntülerde Ölçek barlar sırasıyla, 1 mm ve 100 mikron temsil eder. - / - Tümör alanı 10 5 TRP enjekte-immün yetkili, singenik litermatlarından gelen formalin fikse parafin gömülü beyinleri H & E boyalı kesitler analiz ile belirlendi astrositlerde ve 5 günlük aralıklarla enjeksiyon sonrası kurban. (° C). - / - TRP Kaplan-Meier sağkalım analizi morbidite yaş arası allogreft farelerde 22 gün (D) ortalama sağkalım gösterir.

Şekil TRP +/- MGK allograftlann 6. İmmünofloresan. Temsilci immünfloresans görüntüleri T 121 (yeşil) ve Sox2 (beyaz) ifade TRP +/- NSC-immün yetkili, singenik littermates beyinlerine enjekte olduğunu göstermektedir edu (kırmızı) birleştirilmesi ile tanımlanan ve çoğalır. Fareler edu ile perfüze ve 6 haftaları paraformaldehid post-enjeksiyon ve beyinlerini kurban edildi. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

TRP Şekil 7. Boyuna görüntüleme - / - luc allogreftler. Zaman (B) üzerinde lusiferaz akı Temsilcisi biyoışıldama görüntüleri (A) ve miktar TRP büyüme gösteriyor - / - belirtilen günlerde sonrası en luc kortikal astrositlerde ve görüntülü - / --immün yetkili, sinjenik farelerde allogreftler 10 5 TRP ile enjekte enjeksiyon.g "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kortikal astrositlerde Tablo 1. Koloni oluşumu. AWT T ve TRP - / - kortikal astrositler / oyuk, sırasıyla 4000, 2000 ve 250 hücreler üç kopya halinde plakalanmıştır. Koloniler, 14 gün sonra kaplama kristal viyole ile boyanmış görüntülü ve işbirliği edildiImageJ kullanarak unted. Kaplama verim kaplama hücrelerinin sayısı bölü kolonilerin sayısı olarak hesaplanmıştır.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.