Kültürleme Caenorhabditis elegans Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

Özet

C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.

Özet

Bu protokol, biz gerekli malzemeleri mevcut, ve modifiye C yapmak için prosedür. E Legans Alışma ve Üreme medya (mCeHR). Ayrıca, C teşhir ve acclimatizing için adımlar E. yetiştirilen elegans sıvı ortam aksenik coli açıklanmaktadır. Aksenik C kullanmaktadır Son olarak, alt-deneyler elegans Bu işlemin yararlarını gösterir. C analiz ve tespit yeteneği elegans besin gereksinimi değişen heme konsantrasyonları ile aksenik sıvı ortamda N2 yabani tip solucanlar büyüyen tarafından izah edildi. Bu prosedür, solucan büyüme ve gelişme için optimal konsantrasyonunu belirlemek için ya da ilaç tedavilerinin toksikolojik etkisini saptamak için söz konusu besin ile çoğaltılabilir. Yabani tip solucanlar büyümesi üzerinde çeşitli heme konsantrasyonlarının etkisi niteliksel mikroskopik gözlem yoluyla ve t ölçülmesi ile tespit edilmiştirHer bir heme konsantrasyonda büyüme solucanlar O sayısı. Buna ek olarak, çeşitli besin konsantrasyonlarının etkisi, ilgi konusu besin değişikliklere yanıt floresan sensörler ifade solucan kullanılarak analiz edilebilir. Ayrıca, solucan, çok sayıda mikro-parçacık bombardımanı ile kolayca transgenik C. elegans üretimi için üretilmiştir.

Giriş

Toprak nematod, Caenorhabditis elegans, toksikoloji genetikten çok sayıda çalışmalarda kullanılan güçlü bir model organizmadır. Bu 1 mm boyutu, dört gün, yetiştirme kolaylığı, hızlı bir üretim süresi ve büyük döl numaralarının bir sonucu olarak, bu nematodlar genetik ve farmakolojik ^{ekranlar, 1, 2,} bir dizi olarak kullanılmıştır. Araştırmacılar omurgalı sistemlerinde muhafaza molekülleri ve yolları belirlemek için bu solucanın yararlanmak. Bu yollar hücre ölümü sinyalleri, yaşlanma ve metabolizma yolları ve sinir sistemini ^3-6 arasındadır. Buna ek olarak, C şeffaflık elegans doğrudan gen ekspresyonu ve protein lokalizasyonu analiz etmek görselleştirilebilir floresan protein muhabir kullanılarak transjenik nesil için izin verir.

Birçok çalışmada bu nematod nematod büyüme ortamı (NGM) plakalar kullanılarak, bir katı agar-bazlı bir yüzeye veya l kültürlenirJK monitörler kültürler bir besin kaynağı olarak ^7,8 Escherichia coli ile tohumlandı. Bu bakteri gıda kaynakları tarafından ürünlerin sonuçların yorumlanmasını etkileyen bakteriyel müdahalesi ile biyokimyasal ve toksikoloji çalışmaları karıştırabilir. , C. Bu bileşik etkileri önlemek için, elegans bir besin kaynağı olarak bakteri yoksun olan bir aksenik sıvı ortam içinde kültive edilebilir. Bu medyayı kullanarak, başarılı birçok standart C için son derece senkronize solucan milyonlarca kültüre C. farklı olarak düzenlenen genlerin dahil olmak üzere, mikro-dizi analizi elegans protokolleri elegans heme farklı konsantrasyonlarına maruz bırakılır ve gen bombardımanı ile transgenik solucanlar üretimi. Bu ortam, kimyasal olarak tanımlanmış ve Dr Eric Clegg ⁹ formüle orijinal bir reçete modifiye edilir. Bu mCeHR medyayı kullanarak, başarılı heme homeostazda ilgili genleri tespit ettik, ¹⁰ (hrg ler) olarak heme duyarlı genlerin ifade yönelecekE ile ekim yapılmış olan NGM agar plakalar kullanmak normal büyüme koşullarında mümkün olmamıştır coli.

Bu protokolde C tanıtmak ve korumak için prosedürü tarif E. yetiştirilen elegans coli aksenik mCeHR ve transgenik C üretmek için solucan çok sayıda elde etmek için bu yöntem kullanmak mikro-parçacık bombardımanı kullanılarak elegans hatları. C beslenme gereksinimini belirlemek için aksenik medyayı kullanmanın yararını göstermektedir biz de mevcut çalışmalar elegans bir örnek olarak heme kullanılmıştır. Bu çalışmalar mCeHR medya kullanarak C arasındaki bir sayıda hızlı büyüme sağlar olduğunu göstermektedir solucan araştırmacılar tarafından kullanılan birçok downstream uygulamalar için elegans.

Protokol

1.. Solucan Suşları

1. C'yi elde elegans Caenorhabditis Genetiği Merkezi (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) için Bristol N2 ve vahşi tip suşu NGM plakalar üzerinde onları korumak E ile tohumlandı coli suşu OP50 ^7. Not: Transgenik solucan IQ6011 (Phrg-1 :: GFP), daha önce tarif edildiği gibi ^11, kullanılan suşları üretilmiştir. IQ6011 yazara talep edilebilir.

Değiştirilmiş C 2. Hazırlanması elegans yerleşime ve Üreme Orta (mCeHR)

¹² aşağıda tarif edildiği gibi mCeHR sıvı ortam hazırlayın. Bu aksenik sıvı medya solucanlar herhangi bir ek gıda kaynakları olmadan büyümeye olanak sağlar. Böyle bir laminer akış kaputu gibi kesinlikle steril koşullar kullanılarak aksenik sıvı medya ve aksenik solucanlar tüm manipülasyonları yürütmek.

1. Bir bakkal ultra pastörize yağsız süt alın. Buzdolabında pro kullanınkanal değil, oda sıcaklığında bir ürün. MCeHR orta çizgi olarak agar plakaları Brain Heart İnfüzyonu (BHI) ile ilgili en süt kullanımı ve kısırlık kontrol etmek için, 30 ° C ve 37 ° C 'de 3 gün boyunca inkübe önce. -80 ° C'de 50 ml steril tüpler ve saklamak için süt transfer
2. Aşağıdaki bileşenlerin her hazırlamak ve düzen ve mCeHR 1 L hazırlanması için belirli bir miktarda (Tablo 1) içinde bir araya getirilir: 2 mM kolin diasit sitrat 10 mi, vitamin ve büyüme faktörü karışımı, 10 ml (Tablo 1B 'de tarif bakınız), 2.4 mM miyo-inositol, 10 ml, 10 ml 2 mM hemin klorür, deiyonize su 250 ml. 0.22 mikron filtre ünitesi sayesinde emme ve filtre uygulayın.
3. Nükleik asit karışımı 20 ml (Tablo 1C'de tarifi), mineral karışımı, 100 ml (Tablo 1D'de tarifi), 170 mg / ml laktalbümin hidrolizat 20 ml, esansiyel amino asitler, 20 mi, gerekli olmayan amino 10 ml ekleme asitler, 450 mM KH ₂ PO ₄ 20 ml,1.45 M D-glükoz, 1 M HEPES, 10 ml, sodyum tuzu, 250 ml deiyonize edilmiş su, 50 mi.
4. Bileşenleri sterilize filtre emiş uygulayın. Filtreyi kaldırmak ve 5 mg / ml kolesterol 1 ml ekleyin. Ortamın pH değeri yaklaşık olarak 6-6.5 olduğundan emin olun. Not: Bu çözelti, bir yıla kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
5. Kullanmadan önce mCeHR ortamına% 20 (v / v) organik ultra pastörize kaymağı alınmış süt ekleyin. Süt açma ve aliquoting zaman (bir laminar akış başlığı içinde örneğin) titizlikle steril tekniği kullanarak. 4 ° C'de saklayın Ortamı

3.. C'yi hazırlayın aksenik mCeHR Sıvı Ortamda Kültür elegans

1. Birçok gebe solucanlar ve OP50 E. az miktarda vardır kadar on 60 mm NGM plakalar üzerinde solucanlar büyütün plakalar üzerinde coli.
2. M9 tampon maddesi (Tablo 1F'de tarifi), 5 ml ile durulanarak, her plakadan solucanlar çıkarın ve 50 ml konik bir tüp içinde bir araya getirir.
3. S solucanlar izinettle 5-10 dakika için beklemeye tüp bırakarak daha sonra dikkatli bir şekilde E. içeren süpernatant kaldırmak coli.
4. Tekrar prosedürü devam etmeden önce mümkün olduğunca artık bakteri kadar çıkarmak için 3.2 ve 3.3 2x adımları.
5. , Üç katı olan bir hacim içinde 0.1 N NaCI içinde yeniden süspanse solucanlar, örneğin 1.5 ml, 3 ml ya da 6 ml olan tek tek solucanlar tüp görülebilir.
6. 5 N NaOH ve% 5 sodyum hipoklorit, sonsuz süspansiyona bir 01:02:06 oranında (çamaşır suyu) çözeltisi ekleyerek solucanlar Bleach. Örneğin, 1 ml 5 N NaOH: 2 ml% 5 sodyum hipoklorit: solucan süspansiyonu 6 ml. Solucan süspansiyonuna eklemeden önce NaOH ve ağartıcı karıştırın.
7. Vortex çözelti kuvvetli bir şekilde gebe solucanlar çözülene kadar ve sadece yumurta süspansiyonu (yaklaşık 5-10 dakika) içinde görülebilir. 10X objektif ile bir faz kontrast mikroskop kullanılarak işlemi izler.
8. Solucanlar tamamen çözüldükten sonra, pelet hemenyumurta 45 saniye boyunca 800 x g hızında, 4 ° C 'de Süpernatantı ve 4 ° C'de 45 saniye boyunca 800 x g 'de santrifüj ile topak, steril 10 ml su ile iki kez durulama pelet
9. Ağartma sonra, 100 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen mCeHR ortam 10 ml içeren, 25 cm ² doku kültürü şişesine yumurta pelet aktarın. Steril teknikleri kullanarak bu işlemi yürütmek. Arzu edildiği takdirde, aksenik sıvı kültürlerde bakteri gelişimini önlemek için 250 ug / ml nalidiksik asit de dahil olmak üzere, ilave antibiyotikler ekleyin.
10. Yaklaşık 70 rpm bir çalkalama inkübatöründe 20 ° C'de, sıvı kültürleri inkübe edin.
11. Gelişme aşamasına ve büyüme oranını dikkate günlük solucanlar edin.
    Not: Worms başlangıçta yavaş büyür ve gebe olmak için 7 ila 10 gün gerektirir. Solucanlar sıvı ortama alışmak Ancak, nesil zaman vahşitip (N2) solucanlar için yaklaşık 4 gün düşecektir.
12. Solucanlar deve aldıktan sonrabir konik tüp solucan kültür aktarmak ve, salıncak kovalı bir rotor kullanılarak 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'de topak haline solucanlar, sıvı ortam içindeki sahne gebe miştir.
13. Süpernatantı ve yavaşça 0.1 M NaCI eşit hacimde solucan pelletini. Örneğin, mCeHR 10 ml kültür solucanlar için 0.1 M NaCl 10 ml kullanımı. Solucanlar buz üzerinde 5 dakika boyunca yerleşmek için izin verin.
14. 3,5-3,8 adımları yukarıda açıklandığı gibi ağartma prosedürü uygulayın ve solucanlar aksenik sıvı ortam maddesi içinde bir ikinci nesil boyunca büyümeye izin verir. Gerekirse, bakteriyel büyümeyi inhibe etmek için yeniden antibiyotik ekleyin.
15. Yine bir senkronize bir popülasyonunun üretilmesi için adımlar 3,5-3,8 de tarif edildiği gibi yeniden ağartıcı, adımlar 3.12 ve 3.13 'te tarif edildiği gibi daha sonra 0.1 M NaCl içinde solucanlar ve pelet tekrar süspansiyon solucanlar gebe olmayı sağlar. Artık antibiyotik olmadan sıvı ortamda L1 larva solucanlar büyür.

Sıvı 4. Senkronizasyon WormsKültür

1. Pellet ve adımlar 3.12 ve 3.13 de yukarıda tarif edildiği gibi, 0.1 M NaCl içinde solucanlar tekrar süspansiyon. 3,5-3,8 adımları yukarıda açıklandığı gibi ağartma.
2. M9 tampon, 10 ml yumurta pelletini ve larvalar döner platformlu sallayıcı üzerinde 20 ° C 'de O / N yumurtadan izin verir. Not: Yumurta L1 larva cünyır olacak, ama daha fazla geliştirmek değil, L1 aşamada solucanlar senkronize.
3. Korumak ve alt kültür solucan, 5 dakika boyunca 800 x g'de topak L1 larvalarının, daha sonra 10 ml mCeHR ve bir 25 cm ² şişesine transfer larvaları için tekrar süspansiyon. Solucanlar dönen bir platform üzerinde 20 ° C'de büyümeye izin verin. Solucanlar için yeterli beslenme sağlamak için 3.000 solucan / ml / cm ² maksimum yoğunluğunu korumak.
   Not: Bu aşamada, antibiyotikler işlemleri bir laminar akış başlığı içinde steril teknikler kullanılarak gerçekleştirilmektedir zaman aksenik koşullarını korumak için gerekli değildir. Worms büyümesini izlemek için her gün kontrol edilmelidir.

5. Bedavaaksenik Orta Kültürler kuvvet ve Çözülme Worms

1. Aksenik asenkron solucan kültürleri veya sıvı azot içinde senkronize L1 larva dondurun. 5 dakika boyunca 800 x g Pellet solucanlar daha sonra her bir şişeye 0.5 ml 'si kullanılarak S tamponu (6,45 mM KHPO _4, 43,55 mM KHPO _4, 146,25 mM NaCI) yeniden süspanse edin. Her bir şişeye,% 30 h / h gliserol, S tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve sıvı _N2 içinde uzun süreli depolamadan önce -80 ° C'ye kadar solucanlar aktarın. Her bir şişe içinde, ml başına yaklaşık 1 x 10 ⁶ solucanlar dondurun.
2. Hemen hemen tüm buz eriyene kadar yaklaşık 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek şişe solucanlar çözülme. Bir laminar akış başlığı içinde, mCeHR içeren steril bir şişeye solucanlar transferi ve 20 ° C 'de koyun

6.. MCeHR Büyüme ve Üreme üzerine Hemin Konsantrasyon Etkisi belirleyin

1. C arasında besin bağımlı büyüme analizi için mCeHR aksenik ortamı kullanın elegans. Etkisi o belirlemeksolucan büyüme ve gelişme üzerinde f hemini konsantrasyon, aksenik N2 solucan veya diğer ilgi suşları senkronize kullanın. Bölüm 4'te yukarıda tarif edildiği gibi L1 larvalarının senkronize.
2. Ertesi gün, pelet ve senkronize L1 larvaları saymak ve aksenik medya ul başına 1 solucan sulandırmak üzerine. 0.3 M _NH4 OH 10 mM hemin klorid yapın ve konsantre HCI kullanılarak pH 8'e ayarlanır.
3. Bir 24-yuvalı plaka mCeHR medya 800 ul ekleyin. Ortam 100 ul her bir oyuğa 100 solucanlar ekleyin. 0 uM, 1.5 uM, üç kopya halinde 1.000 uM arasında değişen konsantrasyonlarda her bir göze hemin klorür ekleyin. Tüm çukurlar 0.3 M _NH4 OH aynı konsantrasyonunu içeren emin olun. Yavaşça 100 L1 larvalarının her bir göze ilave emin olmak için pipetleme önce solucanlar yeniden süspansiyon haline getirildi.
4. Günlük solucanlar inceleyin ve her bir konsantrasyonda her bir büyüme not edin. Inkübasyon 9 gün sonra solucanların sayısını ve her bir heme tekabül solucanlar / ml sayısını arsakonsantrasyonu, (Şekil 1).

Heme Sensör Worms Hemin Konsantrasyon 7. Etkisi

1. 4 içeren mCeHR senkronize L1 heme sensörü solucanlar (Phrg-1 :: GFP) inkübe ilM, 8 uM, 10 uM ve 20 uM hemin.
2. Floresan konfokal mikroskopi, 48 saat sonrası inkübasyon (Şekil 2) kullanılarak görüntü solucanlar.

8. Transgenik C oluşturmak için mCeHR kullanmak elegans mikropartikül bombardımanı ile

Not: Şekil 3 ^13'te gösterilmiştir üreten ve unc-119 (ED3) mCeHR yetiştirilen solucanlar kullanılarak mikro-parçacık bombardımanı gerçekleştirilmesi için prosedür.

1. Solucan Hazırlık
   1. Bir 175 ^cm2 şişeye bir hafta önce bombardımanı için mCeHR ortam 90 ml, yaklaşık 1 x 10 ⁶ uyumsuz unc-119 (ED3) solucanlar aktarın. Solucanlar 20 ° C o büyümeye izinna 70 rpm (Şekil 3-1) ~ at platformu sallayarak.
      Not: Bir hafta sonra, solucan yoğunluk birçok yetişkin gebe solucanlar ile önemli ölçüde daha büyük olmalıdır. Yaklaşık 3 x 10 ⁷ solucanlar mikropartikül bombardımanı için gerekli olacaktır.
   2. Chill JM109 E. coli buz üzerinde 10 cm NGM plakaları seribaşı.
   3. Iki 50 ml konik tüplere aksenik solucanlar aktarın ve 2 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj solucanlar. Süpernatan aspire ve M9 tamponu (Şekil 3-2), 50 ml bir tüp içinde, her solucanlar tekrar süspansiyon.
   4. Büyütülmüştür buz üzerinde 10-15 dakika boyunca yerçekimi ile pelet izin verin.
      Not: 2 ml Pelet şimdi>% 90 erişkin solucanlar içermelidir. Bu pelet 2 ml, yaklaşık 5 x 10 ⁶ solucanlar ve bir mikropartikül bombardımanı için yeterli olmalıdır.
   5. Coat soğutulmuş JM109 tüm yüzeyi solucanların 2 ml pelet NGM plaka tohumlandı. Tamamen emilecek sıvı daha sonra plaka terk Veren(Şekil 3-3) geçmeden önce, buz üzerinde 30 dakika karıştırıldı.
2. Altın partikülleri hazırlanması
   1. Bir silikon mikrosantrifüj tüpüne altın partiküllerinin 30 mg tartılır. 1 ml% 70 etanol ekleyin ve 5 dakika için tüp vorteks.
   2. Tüp altın parçacıkları pelet 10 saniye boyunca 6000 x g'de santrifüj, ardından 15 dakika boyunca bekletin. Dikkatli bir altın parçacıklarına tüp ters tarafına ucu dokunarak bir pipet kullanarak süpernatantı.
   3. 1 dakika boyunca steril 1 ml su, girdap ile altın parçacıkları yıkayın ve kısa bir süre için 10 saniye boyunca 6000 x g'de santrifüj tüpü. Daha sonra steril% 50 gliserol, 0.5 ml altın parçacıkları tekrar süspansiyon, iki kez yıkama adımı tekrar edin.
      Not: altın parçacıkları son konsantrasyonu, 60 mg / ml olacak ve 4 ° C sıcaklıkta 1-2 ay boyunca saklanabilir
3. DNA-altın partikül karışım hazırlayın
   1. 10 ve istenilen plazmid DNA 10 ug birleştirin# 956, bir silikonize 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde unc-119 kurtarma plazmid g. DI su 50 ul ve de yeniden süspansiyon haline getirildi altın partikül çözelti daha sonra 1 dakika boyunca vorteks 100 ul ekle.
   2. 2.5 M _CaCI2 150 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca çözelti yine vorteks. Bu çözeltiye, 3-5 dakika boyunca 0.1 M spermidin ve vorteks 60 ul ekle.
   3. Pulse 10 sn boyunca 6.000 xg'de çözümü santrifüj, süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol 300 ul ekleyin. Vortex de 1 dakika boyunca, 6000 x g'de santrifüj puls,% 100 etanol içinde 170 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon çıkarın. Şiddetle 5 ila 10 dk sonra santrifüj nabız ve süpernatant kaldırmak için çözüm vorteks.
4. Bombardıman (Şekil 3-3)
   Not: Bu protokol, Malzeme / Ekipman Tablosunda belirtilen partikül teslim sistemi ile gerçekleştirilir. Mevcut parçacık teslim enstrüman için yönergeleri izleyin.
   1. 15 cm tabak içine doku bir kağıt yerleştirin. Cımbız kullanarak, ayrı ayrı% 100 etanol içine yedi macrocarriers daldırma ve kurumaya dokusu üzerinde onları yatıyordu.
   2. ,% 70 etanol ile biyolistik odası, makro-taşıyıcı tutucu, ve hedef plaka temizleyin. Temiz ve her bombardımanı işlem öncesi durdurma ekranları otoklav.
   3. Oturma aracını kullanarak tutucu içine cımbız ve basın kullanarak tutucuya macrocarrriers yükleyin.
   4. Eşit her bir makro taşıyıcı merkezinde DNA kaplı altın partiküllerinin 20 ul yayılır ve daha sonra çözelti, tamamen kurumaya bırakın.
   5. Etanol ile basınç bölücünün iki parçalarını temizleyin ve etanol temizlenmiş kopma diskler ile birleştirin. Bombardıman odasına monte basınç bölücü ve kopma diskleri vida.
   6. Macrocarrier sahibinin bir otoklava durdurma ekran birleştirin ve metal gerekli raf ve yerinde kilitlemek için aparat yerleştirin.
   7. Monte Macr kaydedinocarrier basınç altında ayrılmış bölücünün yuvasına biyolistik odasına cihaz ve basınç bölücü aynı hizaya gelir.
   8. Hedef plakası raf üzerine solucanlar ile açık NGM plaka bantla ve odasının kapısını kapatın.
   9. , Solucanlar bombardıman kopma diskleri kırmak için gerekli için basıncını ayarlamak için. , Hg basınç 28 inç vakum açın diskler delinmesine kadar sonra yangın düğmesine basın.
   10. Vakum bırakın ve aparattan NGM plaka çıkarın. Plakadan solucanlar yıkayın ve JM 109 E ile seribaşı yirmi 10 cm NGM plakaları yeniden dağıtma coli (Şekil 3-4).
   11. Solucanlar 25 ° C'de 10-14 gün boyunca büyümeye ve plakalar açlıktan izin verin. Unc-119 kusur kurtarıldı Worms normal hareketi olacak ve şu anda tespit edilebilir. Bu bağımsız transgenik satırları (Figür temsil olarak daha fazla analiz için ayrı levhalar en az 10 "Yabanitip" solucanlar almake 3-5).

Sonuçlar

C Kültürleme E. tarafından üretilen ikincil metabolit müdahalesi olmaksızın, solucan için gerekli olan besin belirlenmesinde aksenik sıvı ortam yardımcıları elegans coli. Yabanitip N2 solucanlar üç kuşak içinde mCeHR ortama alışmak ve NGM bakteriyel plakalar üzerinde yetiştirilen solucanlar karşılaştırılabilir büyüme göstermektedir. Nitekim, bu solucanlar OP50 bakteriler üzerinde yetiştirilen solucanlar için 3.5 gün ile karşılaştırıldığında 4 gün içinde gebe olur.

...

Tartışma

Bu protokolde hızlı C. sağlayan bir modifiye aksenik sıvı medya mCeHR sunmak solucanlar, çok sayıda üretim elegans üretimi. Solucanlar E. kirletmeden yetişir gibi bu ortam birçok avantajları göstermektedir coli veya bakteriyel yan ürünleri ve beslenme ve toksikolojik çalışmalar istismar edilebilir. E. kullanılması E. coli ya da bu tür çalışmalarda diğer bakterilerin çeşitli dezavantajları vardır. Örneğin, bakterilerin büyümesi çeşitli koşullar altında değiştirebilir ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MgCl2• 6H2O	Sigma	M-2393
Sodyum sitrat	Sigma	S-4641
Potasyum sitrat monohidrat	Sigma	P-1722
CuCl2• 2H2O	Fisher	C455-500
MnCl2• 4H2O	Fisher	M87-100
ZnCl2	Sigma	Z-0152
Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2O	Sigma	F-1018
CaCl2• 2H < alt > 2 < / alt >O	Fisher	C70-500
Adenozin 5 -monofosfat, sodyum tuzu	Sigma	A-1752
Sitidin 5 -fosfat	Sigma	C-1006
Guanozin 2 '- ve 3' -monofosfat	Sigma	G-8002
Üridin 5 -fosfat, disodyum tuzu	Sigma	U-6375
Timin	Sigma	T0376
N-Asetilglukozamin	Sigma	A3286
DL-Alanin	Fisher	S25648 ve nbsp;
p-Aminobenzoik Asit	Sigma	A-9878
Biotin	Sigma	B-4639
Siyanokobalamin (B-12)	Sigma	V-2876
Folinat (Ca)	Sigma	F-7878
Niasin	Sigma	N-0761
Niasinamid	Sigma	N-3376
Pantein	Sigma	P-2125
Pantotenat (Ca)	Sigma	P-6292
Pteroilglutamik Asit (Folik Asit)	ACRCS	21663-0100
Piridoksal 5'-fosfat	Sigma	P-3657
Piridoksamin 2HCl	Sigma	P-9158
Piridoksin HCl	Sigma	P-6280
Riboflavin 5-PO4(Na)	Sigma	R-7774
Tiamin HCl	Sigma	T-1270
DL-6,8-Tioktik Asit	Sigma	T-1395
KH2PO4	Sigma	P-5379
Kolin di-asit sitrat	Sigma	C-2004
myo-İnositol	Sigma	I-5125
D-Glikoz	Sigma	G-7520
Lakalbümin enzimatik hidrolizat	Sigma	L-9010
Beyin Kalp İnfüzyonu	BD	211065
Hemin klorür	Frontier Scientific	H651-9
HEPES, sodyum tuzu	Sigma	H-3784
Kolesterol	JT Baker	F676-05
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler	Invitrogen	11140-076
MEM Amino Asit Çözeltisi	Invitrogen	11130-051
Nalidiksik asit sodyum tuzu	Sigma	N4382
Tetrasiklin Hidroklorür	MP Biyomedikal	2194542
Biyolistik Dağıtım Sistemi	BioRad	165-2257
Altın parçacıkları (Au Tozu)	Ferro Elektronik Malzeme Sistemleri	6420 2504, JZP01010KM
veya
Altın Parçacıkları 1.0 & mu; m	BioRad	165-2263