Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster

22.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51814

⸱

21 Ağustos 2014

 , 
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience, Istituto Italiano di Tecnologia

Bu makalede

Özet

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Özet

Geçen yıl RNA düzeyinde gen ekspresyon kontrol mekanizmaları etrafında bilimsel ilgi patlaması yaşandı. Moleküler biyoloji dalı ölçüde post-transkripsiyonel düzenlenmesinde önemli oyuncu olarak RNA'lar kodlamayan keşfiyle tarafından desteklendi. Böyle bir devrimci perspektif yüksek verimlilik düzeyi (genom tanımlama) ya da tek aday analizi (spesifik türlerin kararlı durum birikimi) gibi hem, eşlik ve kısa RNA'lar ifade profilleme için güçlü teknolojilerin geliştirilmesi tarafından tetiklenen olmuştur. Birkaç state-of-sanat stratejileri dozlama veya kaçan moleküllerin görüntülenmesi için mevcut olmasına rağmen, Northern Blot tahlil RNA ifade anında ve doğru değerlendirilmesi için moleküler biyolojide uygun yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bu birçok durumda daha sofistike, pahalı teknolojiler ve uygulama doğru bir ilk adım, kolayca anlayışlar kazanmak için tercih edilen bir yöntemdir kalır temsilRNA biyoloji içine. Burada elle larva / yetişkin dokular kesilmiş ya da in vitro kültürlenmiş hücrelerde, insan embriyosu Drosophila melanogaster ikinci zayıf eksprese microRNA (ya da diğer küçük düzenleyici RNA türlerini) tespit edilmesi için (Kuzey Benek Gelişmiş) verimli bir protokol genel bakış. RNA çok sınırlı bir miktarı ve sitometri izole edilmiş hücreler olabilir, akış malzeme kullanımı da öngörülmektedir.

Giriş

RNA biyokimya geçmiş yıllarda 1 muhteşem ilerlemeler yaşanmıştır. Gen ifadesinin kontrolü RNA potansiyeli son anlama yeni RNA bazlı düzenleyici mekanizmaların 3,4 keşfedilmesiyle ve bilinen transkripsiyon sonrası olayların bir derin karakterizasyonu ile, güçlü bir kodlayıcı olmayan ribo-düzenleyiciler 2'nin tanımlanması ile patlama edilmiştir 5. Hep birlikte bu çalışmalar izin RNA biyoloji dramatik güncel bilimsel peyzaj önemli bir araştırma konusu haline sahneyi yapmak. Özellikle, son yıllarda biz moleküler nörobiyoloji 6, modern hayatın bilimde en dinamik araştırma alanlarında birinde "RNA dünyası" yaygın etkisi duygusu alıyorsanız. Geçtiğimiz yüzyılın son on yılında, toplam bilimsel senaryo RNA müdahelesi 7,8 keşfiyle ve küçük düzenleyici RNA'ların 9,10 devrim olmuşturmicroRNA özellikle 11 ile ilgili olarak, endojen gen ekspresyonu ve kombinasyon pleiotropik düzenleyici olarak hemen hemen tüm hücre fonksiyonlarının düzenlenmesinde implike küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar ifade edilmiştir.

MiRNA'ların yüksek sayıda Drosophila ve de 12-15 insan hücrelerinde tespit edildiğinde neredeyse 10 yıl Ambros ve Ruvkun laboratuarlarında tarafından Caenorhabditis elegans miRNA ilk keşiften sonra, yenilenen dikkat alanına döndü. O zamandan beri, çok yönlü transgenik yaklaşımları sayesinde, Drosophila melanogaster miRNA biyosentezi ve aktivite araştırılacağı değerli bir biyolojik bağlamda olarak durdu. Drosophila miRNA'ların yolları, metabolizma yaşlanma sinyalizasyonu kapsayan,-böcek spesifik veya evrimsel olarak korunmuş süreçlerinde farklı işlevleri ortaya çıkarmıştır , davranış ve, elbette, nörojenez. Bu doğrultuda, son zamanlarda ilginç co bir roman bağlantı 16 tanıttıana gen gsm / kayma ve RNA yolun arasında meydana gelen rrelation. Sinek transkripsiyon faktörü GCM / Glide 17-19 multipotent glial vs nöronal kaderi seçim nöral öncüleri 20 uçmak dikte hücre kaderinin belirleyicisi, eşsiz bir örneğini oluşturmaktadır. Yirmi yıl bu konu üzerinde uzun araştırmalar gsm / üzerinde yakınsak gen ekspresyon düzenleme çoklu ve çakışan girdilerin oluşumunu nöral gelişim sırasında nöronal ve glial meslektaşları arasındaki hassas oranını dengelemek için gerekli eşik seviyelerini kurmak için 21-28 kayma altını açıkça gelmiştir.

Biz DMEL-miR279 hedefleme yoluyla düzenlemenin gsm yayınlayabilmesine-transkripsiyonel ince ayar / ifadesini 16 kayma katkıda bulunan bir diğer kontrol düzeyi temsil keşfetti. Küresel olarak, bu araştırma çizgiler gerektirmiştir belirli metodolojik iyileştirmeler: yıllar boyunca, çeşitli teknolojiler aslında trad analiz etmek için geliştirilmişitional RNA'lar gibi küçük olmayan bir kodlama RNA miktarının belirlenmesi için dönüştürülmüş, RNase koruma tahlilleri, cDNA dizileri 29-31, gerçek zamanlı PCR yöntemleri 32-35 ve 36,37 dizi analizi gibi. Diğer taraftan, teknik yaklaşımlar yeniden kalibre alanında sürekli ilerlemeler önemli avantajlar sağlamaktadır.

Northern blot analizi (nb ya da RNA jel leke analizi) temsili bir örneğini teşkil eder: Bu boyut belirlenmesi yanı sıra, her iki ekspresyon seviyesi kantitatif sağladığından büyük ölçüde, RNA birikmesine profil kullanılır. Bununla birlikte, yöntemin içsel zayıf hassasiyet kısa RNA gibi, düşük miktarda gen ifadesi ince ayarlayıcıları uygulanacak olduğunda sınırlayıcıdır. Bir zararlı sonucu belirli biyolojik numunelerin zor başvurusunu yapan toplam RNA, büyük miktarda gerekliliktir. Bu gibi sebeplerle, küçük RNA'lar tespiti için spesifik NB varyantları için 38-40 geliştirilmiştir: Biz geliştirilmiş NB yordam yararlandıedure 41 (ENB, Gelişmiş Northern Blot), DMEL-miR279 ve gsm / kayma arasındaki yukarıda belirtilen etkileşimi durulaştırmada ederken.

Bu yöntem, bir karbodiimid türevi aktivitesine dayanarak diğer kimyasal çapraz bağlama adımı dayanır [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid, EDC] bir katı destek üzerine sabitlemek için bir nükleik asit. Karbodiimid aktive karboksil veya fosfat grupları ve amin grupları arasında amid 42 bağların oluşumunu katalize etmek üzere bilinen çok yönlü bir çapraz bağlayıcıdır. Bu özellik, naylon membran yüzeyinde amino gruplarına da mono-fosforile edilmiş 5'-hidroksil grubu vasıtasıyla kovalent olarak çift küçük RNA'ların etmek için kullanılabilir. Elde edilen bağlantı konfigürasyonu, sırayla, dikkate değer tespiti ile sonuçlanan iyileştirme 43 prob hedef hibridizasyon verimliliğini hareketsizleştirilmiş nükleik asidin erişilebilirliğini arttırmaktadır.

Bu teknik belli relevanc kabulDrosophila moleküler çalışmalar e, hangi küçük kodlamama RNA'lar yeni ve farklı sınıfların oluşumu 44 ortaya çıkmaktadır. Bunlar arasında, 45,46 diziye özgü gen susturma katılan piwi etkileşen RNA'lar (piRNAs 47), belirli bir alt tipi teşkil rasiRNAs. Bu yöntemin operasyon detayları tam olarak tarif edilen ve bir rasiRNA, rasi4 arasında, ilk kez, microRNA DMEL-miR279 ve DMEL-miR286 analizine göre ve bundan sonra görselleştirilebilir. Biz RNA (az 1 mikrogram) minimal miktardaki kötü ifade hedeflerini ortaya bize izin bu yöntemi, extremes itti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Numune Toplama

  1. Pipetleme yarı yapışık Schneider'in 2 hücreleri, (ortalama 1-5 x 10 6 hücre), ayırmak ve santrifüj (1 dakika için 100 xg) hasat. In vitro kültürlenmiş hücrelere yapışık durumunda, standart koşullarda bunları trypsinize veya doğrudan bir hücre kazıyıcı yardımı ile, RNA ekstraksiyon reaktifi için uygun bir miktar içine levhalardan toplarlar.
  2. Embriyo toplanması için, sinek kafeslerde Drosophila suşları büyümeye ve izin embriyolar yumurta döşeme plakaları üzerinde birikir. Damıtılmış su içinde bir fırça (dH 2 O) embriyolar siliniz, elek filtreleme tarafından enkaz atmak yıkayınız ve bir şişe 48 embriyolar kurtarmak.
  3. Bir diğer yöntem olarak, elle dokular / organlar teşrih. Vis gibi diseksiyon iğneler veya forseps kullanılarak, bir stereo mikroskop (20 X büyütme) altında, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde, Drosophila karın testisler (piRNA analizi için tercih edilen bir sistem) yalıtmakSullivan ve arkadaşları 49 ayırd.
  4. Pestle RNA ekstraksiyon reaktifi 0.5 hacim bağımlılığı üzerine örnekleri homojenize.

2. RNA Ekstraksiyon / Analiz

  1. Aşağıdaki Üreticilerin talimatları ticari reaktif ile RNA izolasyonu gerçekleştirmek. DİKKAT! RNA ekstraksiyon ajanlar genellikle zehirli ve yakıcı vardır. Alternatif bir şekilde, RNA izolasyonu için bir 50 Proteinaz K tabanlı bir protokol uygulanır:
    1. Durdurma Mix 400 ul numune içine seyreltilir ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    2. Kloroform: izoamil alkol ve kloroform ekstraksiyonu ve etanol (EtOH) çöktürme / yıkama, standart fenol suda çözülebilen komponentlerin reküperasyonu. Hava örnekleri kuru ve dietilpirokarbonat (DEPC) içine tekrar süspansiyon çift (dd) H 2 O damıtılmış -lı
  2. UV spektrofotometrik ölçümü ile RNA konsantrasyonu değerlendirin. Ayrıca, RNA saflık 2.0 civarındadır, yüksek bas sağlamakA 260 üzerindeki ed / A 280 okuma.
  3. Aşağıdaki gibi agaroz jeli denatüre edici RNA, hazırlık Kontrol
    1. Bir temiz bir beher içinde, sürekli karıştırma altında, DEPC ile GKD 2 O 82 ml, 1.2 g Agaroz çözülür. Tamamen eriyene kadar kaynatın.
    2. Jel solüsyon soğumaya bırakın; sıcaklığı 60 ° 10X 4-morfolinpropansülfonik asit 10 ml eklemek C ulaştığında (MOPS) 1X son konsantrasyonda (YP) için tampon, ve 8 ml 3 formaldehit% 37% FC. DİKKAT! Formaldehit kanserojen.
    3. Yatay elektroporez hücresine jel dökün. Jel en az 1 saat boyunca bir başlık altında katılaşması için izin verin. Katılaşma sonrasında, MOPS 1X içine jel daldırın.
    4. Tümbölen RNA numunesinin 2 mikrogram ve Ladder 1 mikrogram (doğru değerlendirilmesi istendiğinde bir RNA işaretleyici kullanın). RNA agaroz yükleme boyası (ALD) 3 cilt ve Ladder'a. Sıcaklık 70 ° C'de 5 dakika boyunca buz üzerinde ve hemen serin. CAKatkı! ALD İçeriği (etidyum bromür ve formamiddir, Malzeme bakınız) sırasıyla, mutajen ve aşındırıcı.
    5. Örnekleri yükleyin ve arada tampon geri dönüşümü ile yaklaşık 1 saat boyunca 50 V de jel çalıştırın. UV görselleştirme veya jel görüntüleme ile RNA fraksiyon desenini kontrol edin. 28S ve 18S rRNA ve tRNAs tekabül eden somut bantları tanır (Şekil 1).
  4. -80 ° C'de Kuzey Testi veya saklamak RNA devam edin.

3. denatüre Akrilamid Jel Hazırlanması

  1. Bu bölme aşamasında için küçük bir dikey elektroforetik cihazı (plaka boyutu yaklaşık 8 cm x 9 cm, tarak kalınlığı 0,75 mm) kullanın.
  2. Bir döküm çerçeve içinde birbirine temiz gözlük birleştirin.
  3. (19: 1), MOPS 1X çözelti, 7 M üre,% 10 akrilamid / bis-akrilamid, 10 ml hazırlayın. Dökümden hemen önce,% 10 amonyum persülfat ve TEMED 100 ul, 10 ul ve süratli bir şekilde karıştırın. DİKKAT! Akrilamid nörotoksik ve kanserojendir.
  4. Cam plakalar arasındaki jel dökün ve kabarcıkları önlemek için dikkatli iyi tarak yerleştirin. Jel, kullanılmadan önce en az 45 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize edelim. Alternatif olarak, jel O / N, su ile ıslatılmış filtre kağıdı ile sarılmış ve saran sargısına kapalı olarak muhafaza edilebilmesi.

4. Numune Hazırlama

  1. 0,5-20 kısım her numune için toplam RNA'nın ug. 3-4 ul hacim aşarsa, vakum örnek kurutun.
  2. Boyut tayini için bir belirteç olarak (hazırlanması için, Bölüm 4.3 ve 4.4), örnekler paralel radyo-etiketli düşük frekans merdivenin bir kısım (20-30 cps) çalıştırın. Aşama 4.5 de tarif edildiği gibi, örnekler paralel olarak işleme tabi tutmaktadır.
  3. Merdiven: 10 bp-merdivene 0.1 ug kullanılarak fosfat ileri reaksiyonu kurmak. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir ve 20 mM FC kadar etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave ederek reaksiyonu durdurun.
  4. EtOH yağış / yıkama, kuru hava ve saflaştırarakGKD 2 O (yaklaşık 100 ul). tekrar süspansiyon DİKKAT! 32 P radyoaktif bir kaynağıdır.
  5. Her bir numune için akrilamid mavi boya (ABD) bir eşit hacmi ekleyin. 5 dakika boyunca 80 ° C'de ısıtılarak denatüre etmek ve yükleme. DİKKAT kadar buz üzerinde serin! Formamid (ABD cinsinden) aşındırıcıdır.

5. Elektroforetik Fraksiyonasyon

  1. Döküm destek cam plakalar çıkarın ve düzgün elektroforez hücrede bir araya. Yeterli Running Buffer (RB), her iki iç ve dış bölmeyi doldurun.
  2. Yavaşça tarak kaldırmak ve 10 dakika boyunca 200 V'de jel ön çalıştırın. Yükleme örnekleri önce, bir şırınga aracılığıyla bazı RB squirting kuyulardan üre mevduat silsin.
  3. Düz ipuçlarına her oyuğa altındaki aşama dikkatlice 4,5 tabakalandırmak örnekleri için. Ters akmasını önlemek için anot ve katot bağlantıları kontrol edin. Numuneler 5 dakika boyunca 100 V'ta jel girdikten sonra, ben200 V'a voltajı arttırın
  4. Yaklaşık 7 cm uzunluğunda, bir fraksiyonlara ayırma, bir 45 dakika süren bir çalışma yeterlidir. Jel taşma Bromofenol mavisi (ABD bir izleme pigment) kaçının.
  5. Tercihe bağlı bir adım olarak, etidiyum bromür (EtBr) boyama ile parçalanmış uzun RNA jel üzerinde: Görsel
    1. Jel üstünden uzağa 2 cm kesmek ve kısaca GKD 2 O. dilim durulayın
    2. RB, EtBr 0.5 ug / ml YP nazik karı koca gibi yaşayacaklar ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında jel dilim inkübe edin.
    3. RB 15 dakika jel destain, UV ışınlaması veya jel görüntüleme uzun rRNA görselleştirmek. RNA yükleme ve kalitesi (bkz Şekil 1, Panel 7). DİKKAT edin! Etidyum bromür bir mutajen.
  6. Bu arada küçük RNA türlerini içeren jel alt kısmı blot devam edin.

6. Jel Blot

  1. 6 lekeleme alanına sığdırmak için kurutma kağıdı parçaları ve uncharge eşdeğer bir parça kesmekd naylon membran. Kağıt yapraklarını, membran ve RB 2 blot pedleri nemlendirin. Tamamen art arda RB onları sıkarak pedleri emmek için emin olun.
  2. Aygıtından jel çıkarın ve bir spatula ile ortalama gözlük açın. Kuyu kaldırmak için temiz bir kesici kullanın. Jel ıslak whatman bir kağıt yerleştirin ve hafifçe yukarı kaldırın.
  3. Jelin serbest yüzünde bir naylon zar yerleştirin. Numune yükleme işlemi göre olan filtre yönlendirmek için bir köşe işaretleyin. "Sandviç" (3 Kağıt parçalarını her tarafı) tamamlayın. Olası bir hava kabarcıklarını çıkarmak için, yüzey üzerinde leke plastik çubuk döndürün.
  4. Blot kaset iki lekeleme pedleri ve daha sonra arasındaki blot yerleştirin. , Blot modülü kaseti monte RB ile bölmeyi doldurup (jel ve pozitif terminali arasında kalmalıdır naylon membran) doğru yönde kontrol edin.
  5. 20 dakika boyunca 20 V aktarın. Not: 10 dakika kurutma modülü ve r açtıktan sonra, homojen koşulları sağlamak içintransferi tamamlamadan önce 180 ° sandviç otate.

7. Membran Çapraz

  1. Taze Çapraz Çözüm (XLS) 6 ml hazırlayın. Doyurabilecek 10 cm (naylon membran daha büyük) 10 cm XLS. DİKKAT kurutma kağıdı parçası x! HCI (XLS bir bileşeni) son derece yakıcıdır.
  2. Blot sökün ve ıslak 3MM filtre kağıdı üzerinde membran yerleştirin. Not: RNA, doymuş kağıt ile doğrudan temas halinde olmamalıdır. Iki cam levha arasında filtresi ve kağıdı yerleştirin ve Saran-şal sarın.
  3. Bir GKD 2 O yıkama, ardından 2 saat boyunca 60 ° C 'de membran, ısıtın. -20 ° C'de saklayın veya melezleşme geçin.

8. Membran melezleme

  1. RNA yükleme (isteğe bağlı adım 5.5) kontrol edilmiş ise, doğrudan melezleme devam edin. Ya da, bir naylon filtreden en üstüne uzak 1 cm kesmek sistemi çapraz hybridizatio bilmekparçalanmış uzun RNA'lar ns.
  2. 37 ° C'de hibridizasyon çözeltisi (HS) 10 ml ön ısıtma. , 5 dakika boyunca 95 ° C 'de somon spermi, 1 mg denatüre buz üzerinde serin ve hümik ekleyin.
  3. , Bir hibridizasyon etüvü içinde dönme altında, en az 1 saat boyunca 37 ° C'de HS filtreyi inkübe edin. Filtrenin RNA tarafı HS karşı karşıya olduğunu kontrol edin.

9. Probe Sentez

  1. 4.3 de tarif edildiği gibi, belirli bir antisens oligonükleotid olarak 10 pmol bir fosfat ön reaksiyonu ayarlayın.
  2. (EtOH ya da çökeltme yoluyla) Tris-EDTA-NaCl (TEN) 5 hacim, reaksiyona tampon ve bir Sephadex G-25 sütun üzerinde jel dışlama kromatografisi ile birleşmemiş nükleotidlerden işaretli primer arındırmak ekleyin. Prob aktivitesi sıvı parıltı sayacı ile değerlendirilebilir.

10. Membran Hibridizasyon

  1. 10 ml taze alikot (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan ve tamamlanan) ile bitmiş HS değiştirin. Isı için sondaBuz üzerinde serin ve yeni ekle HS 10 dakika boyunca 95 ° C olarak ölçülmüştür. 37 ° C AÇIK filtreyi inkübe.

11. Membran Yıkama

  1. Hibridizasyon çözüm kurtarmak ve bir radyoaktivite-koruyucu kutusuna -20 ° C'de saklayın.
  2. Yıkama Tamponu (WB) 'de durulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika süre ile iyice yıkayın.
  3. Filtre köşelerde bakiye radyoaktivite kontrol etmek için bir Geiger Mueller Dedektörü kullanın. Arka plan emisyon yaklaşık 5 cps olduğunda, fuar zar geçin.

12. Sinyal Algılama

  1. Otoradyografisidir filmlerde ya da moleküler görüntüleme ekranı ON filtreyi Açığa. Fotografik işleme veya dijital dönüşüm ile sinyallerini veriyor.
  2. Özel ölçüm yazılımı (İmageJ veya Optiquant) tarafından bant yoğunluğu analiz edin.

13. Membran sıyırma

  1. Soyma çözeltisi kaynayan 500 ml su altında, zar birincil sinyalleri kaldırmak için, Daha sonra 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Yeni bir (ön) hibridizasyon ile devam ya da -20 ° C'de filtre saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 'de metinde tarif edilen ve şematik bir şekilde temsil genel prosedür takip edilerek, farklı kökenlerden gelen karmaşık bir RNA örneklerinden küçük RNA'ların tanımını inceledik. (: Agaroz jel fraksiyonasyon denatüre bağlı bir adım) ve çift yüklü Şekil 1'de sunulan deneyde, RNA bütünlüğü açısından kontrol Proteinaz K ekstre Drosophila Schneider 2 hücrelerinden izole edilmiştir. Jelin yarısı nötr bir zar üzerinde kurutulur ve kimyasal olarak çapraz bağlantılı EDC; ikinci ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

RNA nörogenezi düzenleyen hangi aracılığıyla intertwining sophisticate bizim takdir sürekli artmasına rağmen, nöral kök hücre biyolojisi, nöronal farklılaşma / fonksiyonel entegrasyon, sinir patolojileri ve kanser gelişimini etkileyen RNA bazlı circuitries mekanik etkileri keşfedilmemiş kalır. Drosophila kısa kodlamama RNA'lar ve transkripsiyon faktörleri majör moleküler oyuncuları olarak hangi keşfedilmemiş hücresel yollar, çözülmeye enstrümantal melanogaster gibi krallıklar aracılığıyla bu ağları...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale tarafından desteklenen, Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg, Hopital de Strasbourg, pour la Recherche Derneği sur le Kanser, Institut National du Kanser, Agence Nationale de la Recherche ve Bölge Alsace.

Pietro LaNeve la Recherche Médicale Fondation tarafından dökün desteklenmiştir. Şu anda, o bir Istituto Italiano Tecnologia (İİT) bursu bir alıcı. Yayın maliyetleri Neurex ağı tarafından desteklenmektedir (TriNeuron - Program İnterreg IV Yukarı Ren)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NİHAİ BİLEŞİM/İSİMŞİRKETKATALOĞU (Stok)YORUMLAR
GENEL GEREKSİNİM
Santrifüj, 5418Eppendorf5418 000.017
Dekontaminant, RNase AwaySigma-Aldrich83931Cam/plastik eşyalara uygulayın, silin ve durulayın
RNase inhibitörü, DEPCSigma-AldrichD5758Tehlikeli //// 1609-47-8
NUMUNE HAZIRLAMA
Stereo Mikroskop, M60Leica 
1X PBS Tamponu
137 mM NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
2.7 mM KClSigma-AldrichP95417447-40-7 
10 mM Na2HPO4Sigma-AldrichS32647558-79-4 
1.8 mM KH2PO4Sigma-AldrichP97917778-77-0 
RNA EKSTRAKSIYONU/ANALİZİ
UV-Vis SpektrofotometreThermo ScientificNanodrop 2000
Jel Görüntüleyici, ChemiDoc XRS+Biorad170-8265
Yatay Elektroforez, Mini-Alt Hücre GTBioRad170-4487EDU
RNA ekstraksiyon reaktifi, TRIzol ReaktifiYaşam Teknolojileri15596026Tehlikeli
PCA (25:24:1), ekstraksiyon için 1:1Sigma-Aldrich77617136112-00-0
Klorofor, ekstraksiyon için 1:1Sigma-AldrichC243267-66-3   
EtOH, 2.5 hacim. yağış için, yıkama için% 70Sigma-Aldrich5984464-17-5 
Gen Cetveli 1Kb DNA MerdiveniThermo ScientificSM0311
Karışımı Durdur
300 mM NaOAc, pH 5.5Sigma-AldrichS2889127-09-3
1x RSB Çözeltisi
%2 sodyum dodesil sülfat (SDS)Sigma-Aldrich71736Yağışı önlemek için SDS'yi asla soğutmayın  //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinaz KRoche Uygulamalı Bilimler0-3115828001EC 3.4.21.64 9
10X Retikülosit Standart Tamponu (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4Sigma-AldrichT59411185-53-1   
100 mMNaCl Sigma-AldrichS30147647-14-5   
30 mM MgCl2Sigma-AldrichM82667786-30-3
Denatüre Agaroz Jel
%1.2 AgarozSigma-AldrichA9539Jelinin en az 1 saat katılaşmasına izin verin //// 9012-36-2
10X MOPS Tamponu
0,2 M MOPS sodyum tuzu, pH 7Sigma-AldrichM9381MOPS sodyum tuzunu ile karıştırmayın MOPS //// 71119-22-7
Agaroz Yükleme Boyası
1x MOPS Tampon
%3 formaldehitSigma-AldrichF8775Tehlikeli //// 50-00-0
%50 formamidSigma-Aldrich47670Tehlikeli //// 75-12-7
Etidyum bromür (EtBr) 30 μ g/mlSigma-AldrichE1510Tehlikeli //// 1239-45-8
Bromofenol mavisi Sigma-AldrichB0126115-39-9 
KÜÇÜK RNA FRAKSIYONASYONU
Düz jel yükleme uçlarıYaşam TeknolojileriLC1002
Savant SpeedVac KonsantratörThermo Scientific DNA120
Dikey Elektroforez, Mini-PROTEAN Tetra Hücresi Biorad165-8000
Denatüre Edici Akrilamid Jel
%10 Akrilamid/Bis-Akrilamid (19:1)Sigma-AldrichA3449Tehlikeli. Kullanmadan önce jelin 45 dakika polimerize olmasına izin verin
1x TBE Tamponu (veya 1x MOPS Tamponu)
7 M üreSigma-AldrichU650457-13-6
%0.1 amonyum persülfatSigma-Aldrich2155897727-54-0 
% 0.1 TEMEDSigma-AldrichT9281110-18-9
Gen Cetveli Ultra Düşük Aralıklı DNA Merdiveni (10 bp-adım)Thermo ScientificSM1211Etiketi 0.1 & mu; g, "prob etiketleme" reaksiyonunda açıklandığı gibi
Akrilamid Mavi Boya 
%50 formamidSigma-Aldrich47670Tehlikeli //// 75-12-7
Bromofenol mavisiSigma-AldrichB0126115-39-9 
Çalışan Tampon (RB)
1x MOPS Tamponu 
Alternatif RB: 1x TBE Tamponu
1x TBE Tamponu
5X TBE
445 mM Tris-baseSigma-AldrichT150377-86-1 
445 mM borik asitSigma-AldrichB790110043-35-3
20 mM EDTASigma-AldrichEDS60-00-4   
Jel Boyama Çözeltisi
Etidyum bromür 0.5 & mu; g/mlSigma-AldrichE1510Tehlikeli //// 1239-45-8
1x RBEtBr ile 15 dakika leke, EtBr
BLOTTING olmadan 15 dakika lekeleyin
3MM Whatman kağıdıSigma-AldrichZ270849
Nötr Naylon Membran, Hybond NXGE Healthcare Life ScienceRPN203TIşığa duyarlı
ÇAPRAZ BAĞLAMA
Çapraz Bağlama Çözeltisi (XLS)
%1 1-metilimidazol (h/h)Sigma-Aldrich336092Her zaman taze bir XLS alikotu hazırlayın //// 616-47-7
12,5 mM HClSigma-AldrichH1758Tehlikeli //// 7647-01-0
%3,1 EDC (w/v)Sigma-Aldrich345025952-53-8   
(PRE)-HİBRİT
Sıvı Sintilasyon Sayacı BeckmannLS 6500
Kesilmiş Somon Spermi, 0.1 mg/ml Yaşam TeknolojileriAM9680
rasi4 anti-sens prob5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA
anti-sens prob5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279
anti-sens prob5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286
anti-sens prob5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Arıtma
Kiti, Illustra MicroSpin G-25 SütunlarıGE Healthcare Life Science27-5325-01
(Ön)-Hibridizasyon Çözümü (HS)
%0.5 SDSSigma-Aldrich71736151-21-3 
5x Denhardt'ın Çözümü
20X SSPE
3.6 M NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
0.2 M sodyum fosfatSigma-Aldrich3424837601-54-9   
20 mM EDTA (pH 8.0)Sigma-AldrichEDS  60-00-4   
50x Denhardt'ın Çözeltisi
%1 Ficoll 400 (h)Sigma-AldrichF263726873-85-8
%1 PolivinilpirolidonSigma-AldrichPVP409003-39-8
%1 BSASigma-AldrichA79069048-46-8   
1X TEN Tampon
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)Sigma-AldrichT150377-86-1  
100 mMNaCl Sigma-AldrichS30147647-14-5   
1 mM EDTA (pH 8.0)Sigma-AldrichEDS60-00-4   
Prob Etiketleme
0.4 & mu; M oligonükleotid
1.5 & mu; l Ci/μ l [γ-32P] ATPPerkin ElmerNEG002ATehlikeli //// 51963-61-2
1x T4 Polinükleotid Kinaz TamponuBiolabsB0201
T4 Polinükleotid Kinaz 0.5 birim/μ lBiolabsM0201EC 2.7.1.78
YIKAMA
Geiger Mueller DedektörleriCanberra IndustriesMCB2/CPS –
Yıkama Tamponu (WB), 2x SSPE
Sıkı Yıkama Tamponları
0,2x SSPE
2x SSPE, %0,5 SDS
0,2x SSPE, %0,5 SDS
SİNYAL ALGILAMA
PharosFX Plus SistemiBiorad170-9460
Resim JÜcretsiz olarak temin edilebilen
Miktar BirBiorad
X-ray filmleri, BioMax XARSigma-AldrichF5888
X-ray filmleri için Işığa Duyarlı GeliştiriciSigma-AldrichP7042
X-ray filmleri için SabitleyiciSigma-AldrichP7167
SIYIRMA
Sıyırma Çözeltisi
10 mM Tris-HCl pH 8.8Sigma-AldrichT150377-86-1 
5 mM EDTASigma-AldrichEDS60-00-4   
%0,1 SDSSigma-Aldrich71736Köpürmeyi önlemek için kaynattıktan sonra SDS ekleyin //// 151-21-3
EM77021

Kaynaklar

  1. The RNA World. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2006).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell. 146, 353-358 (2011).
  4. Cesana, M., et al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 147, 358-369 (2011).
  5. Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression. Cell. 108, 439-451 (2002).
  6. Mehler, M. F., Mattick, J. S. Noncoding RNAs and RNA editing in brain development, functional diversification, and neurological disease. Physiol Rev. 87, 799-823 (2007).
  7. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M., Kostas, S., Driver, S., Mello, C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Hamilton, A., Baulcombe, D. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, (1993).
  10. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  11. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  12. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408, 86-89 (2000).
  13. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294, 853-858 (2001).
  14. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 858-862 (2001).
  15. Lee, R. C., Ambros, V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 862-864 (2001).
  16. Laneve, P., et al. The Gcm/Glide molecular and cellular pathway: new actors and new lineages. Dev Biol. 375, 65-78 (2013).
  17. Hosoya, T., Takizawa, K., Nitta, K., Hotta, Y. Glial cells missing: a binary switch between neuronal and glial determination in Drosophila. Cell. 82, 1025-1036 (1995).
  18. Jones, B. W., Fetter, R. D., Tear, G., Goodman, C. S. Glial cells missing: a genetic switch that controls glial versus neuronal fate. Cell. 82, 1013-1023 (1995).
  19. Vincent, S., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Glide directs glial fate commitment and cell fate switch between neurons and glia. Developement. 122, 131-139 (1996).
  20. Cattenoz, P. B., Giangrande, A. Lineage specification in the fly nervous system and evolutionary implications. Cell Cycle. 12, 2753-2759 (2013).
  21. Jones, B. W., Abeysekera, M., Galinska, J., Jolicoeur, E. M. Transcriptional control of glial and blood cell development in Drosophila: cis-regulatory elements of glial cells missing. Dev Biol. 266, 374-387 (2004).
  22. Ragone, G., et al. Transcriptional regulation of glial cell specification. Dev Biol. 255, 138-150 (2003).
  23. Akiyama-Oda, Y., Hosoya, T., Hotta, Y. Asymmetric cell division of thoracic neuroblast 6-4 to bifurcate glial and neuronal lineage in Drosophila. Development. 126, 1967-1974 (1999).
  24. Bernardoni, R., Kammerer, M., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Gliogenesis depends on glide/gcm through asymmetric division of neuroglioblasts. Dev Biol. 216, 265-275 (1999).
  25. Ragone, G., Bernardoni, R., Giangrande, A. A novel mode of asymmetric division identifies the fly neuroglioblast 6-4T. Dev Biol. 235, 74-85 (2001).
  26. Soustelle, L., Roy, N., Ragone, G., Giangrande, A. Control of gcm RNA stability is necessary for proper glial cell fate acquisition. Mol Cell Neurosci. 37, 657-662 (2008).
  27. Akiyama, Y., Hosoya, T., Poole, A. M., Hotta, Y. The gcm-motif: a novel DNA-binding motif conserved in Drosophila and mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 25, 14912-14916 (1996).
  28. Miller, A. A., Bernardoni, R., Giangrande, A. Positive autoregulation of the glial promoting factor glide/gcm. EMBO J. 17, 6316-6326 (1998).
  29. Krichevsky, A. M., King, K. S., Donahue, C. P., Khrapko, K., Kosik, K. S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 9, 1274-1281 (2003).
  30. Liu, C. G., et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9740-9744 (2004).
  31. Yin, J. Q., Zhao, R. C., Morris, K. V. Profiling microRNA expression with microarrays. Trends Biotechnol. 26, 70-76 (2008).
  32. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, E43(2004).
  33. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
  34. Shi, R., Chiang, V. L. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques. 39, 519-525 (2005).
  35. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J. M. Simple quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744 (2005).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  37. Linsen, S. E., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nat Methods. 6, 474-476 (2009).
  38. Valoczi, A., et al. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, e175(2004).
  39. Varallyay, E., Burgyan, J., Havelda, Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. Methods. 43, 140-145 (2007).
  40. Kim, S. W., et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38, e98(2010).
  41. Pall, G. S., Hamilton, A. J. Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA. Nat Protoc. 3, 1077-1084 (2008).
  42. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 2nd, Academic Press, Inc. (2008).
  43. Pall, G. S., Codony-Servat, C., Byrne, J., Ritchie, L., Hamilton, A. Carbodiimide-mediated cross-linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA, miRNA and piRNA by northern blot. Nucleic Acids Res. 35, e60(2007).
  44. Guzzardo, P. M., Muerdter, F., Hannon, G. J. The piRNA pathway in flies: highlights and future directions. Curr Opin Genet Dev. 23, 44-52 (2013).
  45. Aravin, A. A., et al. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11, 1017-1027 (2001).
  46. Vagin, V. V., et al. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science. 313, 320-324 (2006).
  47. Brennecke, J., et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128, 1089-1103 (2007).
  48. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  49. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. (51), e2641(2011).
  50. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  51. Alwine, J. C., Kemp, D. J., Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridisation with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5350-5354 (1977).
  52. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495, 384-388 (2013).
  53. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E., Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA. 19, 271-279 (2013).
  54. Specchia, V., et al. Hsp90 prevents phenotypic variation by suppressing the mutagenic activity of transposons. Nature. 463, 662-665 (2010).
  55. Várallyay, E., Burgyán, J., Havelda, Z. MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat Protoc. 3, 190-196 (2008).
  56. Koscianska, E., Starega-Roslan, J., Czubala, K., Krzyzosiak, W. J. High-resolution northern blot for a reliable analysis of microRNAs and their precursors. ScientificWorldJournal. 11, 102-117 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

RNA TespitiAkrilamid Jel ElektroforeziRNA EkstraksiyonuProb HibritlemeOtoradyografi TespitiRNA İzolasyonuJel Transferi
Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.