Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

14.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51829

⸱

21 Eylül 2014

 ,  , 
1Centre de Résonance Magnétique Biologique et Médicale, UMR 7339 CNRS, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université, 2Centre de Recherches en Oncologie Biologique et Oncopharmacologie, UMR 911 INSERM, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université

Bu makalede

Özet

Memeli beyninin nörokimyası birçok nörolojik ve sistemik hastalıkta değişmiştir. Serebral metabolitlerin karakteristik profilleri, beyin dokusunun ham ekstraktlarına dayalı olarak verimli bir şekilde elde edilebilir. Bu amaçla, metabolit konsantrasyonlarının (metabolomikler) ayrıntılı kantitatif analizini sağlayan yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanılır.

Özet

RNA ve protein seviyeleri üzerindeki gen ekspresyonu çalışmaları, hastalığın altında yatan biyolojik süreçleri araştırmak için uzun süredir kullanılmaktadır. Daha yakın zamanlarda, genomik ve proteomik, biyolojik sistemlerde bulunan metabolit havuzunun kapsamlı kantitatif analizi ile tamamlanmıştır. Metabolomik olarak adlandırılan bu strateji, metabolizmada yer alan küçük moleküllü tamamlayıcının küresel bir karakterizasyonunu sağlamaya çalışır. Genom ve proteom, hücrelerin gerçekleştirebileceği görevleri tanımlarken, metabolom gerçek fenotipin bir parçasıdır. Şu anda metabolomikte kullanılan yöntemler arasında, spektroskopik teknikler özel bir ilgi alanıdır, çünkü belirli biyokimyasal yollar için önceden seçim yapmadan çok sayıda metabolitin aynı anda analiz edilmesine izin verir, böylece geniş bir tarafsız yaklaşımı mümkün kılar. Burada, doku metabolitlerinin verimli bir şekilde ölçülmesi için tercih edilen yöntem olan yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi ile metabolomik analiz için optimize edilmiş bir deneysel protokol sunulmaktadır. Bu yöntemin önemli güçlü yönleri şunlardır: (i) numunenin saflaştırılmasına ve/veya metabolitlerin ayrılmasına gerek kalmadan ham ekstraktların kullanılması; (ii) NMR'nin doğası gereği kantitatif doğası, bir NMR spektrumu ile temsil edilen tüm metabolitlerin sadece bir referans bileşiği ile kantitasyonuna izin verir; ve (iii) NMR'nin tahribatsız doğası, aynı numunenin birden fazla ölçüm için tekrar tekrar kullanılmasını sağlar. Aşırı düşük konsantrasyonlarda meydana gelen metabolitlerin tespit edilmesi zor olsa da, NMR sinyallerinin doğrusal tepkisi nedeniyle kapsanabilen dinamik metabolit konsantrasyonları aralığı dikkate değerdir. En az bulunan bileşikler için, oldukça hassas kütle spektrometresi yöntemi avantajlı olabilir, ancak bu teknik NMR spektroskopisinden daha karmaşık numune hazırlama ve miktar tayini prosedürleri gerektirir. Burada sıçan beyin analizine göre ayarlanmış bir NMR protokolü sunuyoruz; Ancak aynı protokol küçük değişikliklerle diğer dokulara da uygulanabilir.

Giriş

Murin modeller beyin araştırması 1 yaygın olarak kullanılmıştır. Genotip-fenotip, diğer korelasyon 2-6 üzerinde, bir yandan, RNA ve / veya protein seviyelerde gen ifadesinin inceleyerek fare ve sıçan beyinleri incelenmiş ve morfolojik fonksiyonel elektrofizyolojik ve / veya davranış fenotipleri edilmiştir. Ancak, tamamen genotipi ile fenotipi bağlayan mekanizmalarını anlamak için, o aşağı protein ifadesi, yani moleküler olayları araştırmak için zorunludur. enzimler 7 hareket bunun üzerine biyokimyasal substratların metabolizması. Bu gereklilik biyoloji 8,9 birçok dalında metabolik araştırma rönesans için, son 10 ila 15 yıl içinde, yol açtı. Klasik metabolik çalışmalar genellikle belirli yolların ayrıntıları odaklanmış olsa da, yeni metabolomic yaklaşım göz altında dokusunun küresel metabolik profilinin her şeyi kapsayan bir soruşturma yönelikse.Bu kavram bir sonucu özel metabolik yolları ve / veya bileşiklerin sınıflarına karşı verevi en aza indirmek analitik araçlar için açık bir ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, klasik biyokimyasal analizi deneyi gerçekleştirilir önce belirtilmesi gereken belirli bir analit bir kimyasal reaksiyona dayanır. Bunun aksine, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ve kütle spektrometrisi (MS) (i) spektroskopik teknikler biyokimyasal bileşiklerin, özellikle molekül (fiziksel) özelliklerine dayanır her biri bir spektrum içinde bir ya da birden fazla farklı sinyal yol açar bir deney sırasında tespit edilmiştir; ve (ii), deney başına farklı bileşiklerin çok sayıda tespit eder.

Böylece, her bir spektrum metabolitlerin bir dizi kombine bilgileri içerir. Önceden seçme analitin doğası ile ilgili 8 ölçülecek yapılması gereken Bu nedenle, spektroskopik yöntemler, metabolitler için uygun araçlardır . Bunlar büyük ölçüde beklenmedik metabolik değişimlerin saptanmasını kolaylaştırmak için bir sonucu olarak, bu teknikler, doğal keşif çalışmaları kendilerini katmaktadır.

NMR ve MS spektroskopi birçok metabolitlerin analizi için birbirlerinin yerine kullanılabilir, ancak her iki yöntemle de avantaj ve yakın zamanda gözden geçirilmiştir 10 dezavantajları da vardır. Kısaca, NMR spektroskopi, genellikle kaba özütündeki gerçekleştirilebilir ve analizden önce örnek bileşiklerin kromatografik ayırmaya gerek yoktur. Buna göre, MS gibi kütle spektrometresi görüntüleme gibi belirli son gelişmelerin dışında, gaz veya sıvı kromatografisi (GC veya LC) ayrılması ile çalışır. Farklı şekerlerin rezonans hatları (1H) NMR spektrası, proton aktif rol oynamaktadır, çünkü bu tür şekerlerin analizi bir kaç özel durumda, LC ayırma, hem de NMR spektroskopi için bir zorunluluk olabilir. CHR olmadan Bununla birlikte, 1H-NMR spektroskopisiomatographic ayırma en popüler, neredeyse evrensel uygulamalı metabolomic NMR yöntemi kalır. Genel olarak, bu numune hazırlama NMR spektroskopisi için olduğu gibi, MS daha zaman alıcı ve karmaşıktır. Matriks etkileri nedeniyle ciddi sorunlar çok onlar oldukça zayıflatılmış sinyallerine neden olabilir nerede MS daha NMR spektroskopisi az yaygındır. Metabolit niceleme Her iki yöntem ile elde edilebilir. Bununla birlikte, çoklu standart bileşiklerin, metabolitleri arasında matriks etkileri ve iyonizasyon verimliliği varyasyonlara MS için gereklidir. Buna karşılık, numune başına sadece bir standart için uygun ölçüm koşulları altında, bir NMR spektroskopisi ile analiz için gerekli olan, ikinci yöntem ise esas olarak gözlenen çekirdekleri tarafından kesinlikle lineer tepki NMR nicel sayesinde. NMR önemli bir dezavantajı nispeten düşük hassasiyettir. MS, özellikle LC-MS, büyüklük birkaç emir tarafından NMR daha duyarlıdır; Bu nedenle, MS için NMR fazla tercih edilmelidirçok düşük konsantrasyonlarda meydana gelen bileşiklerin analizi. Öte yandan, bir NMR deneyinde bozulmayan doğası MS üzerinde açık bir avantaj olan; Bu şekilde, örneğin 1 H-NMR, fosfor-31 (31 p), karbon-13 (13 ° C), farklı NMR aktif çekirdekleri için, örneğin, aynı numune üzerinde tekrar tekrar yapılabilir flor-19 (19 C) vb., MS ölçümleri karşı önemli bir NMR ile tüketilir gibi.

NMR ve MS hem farklı modlarda kullanılabilir, her biri özel bir kimyasal özelliklere sahip bileşiklerin tespit edilmesi için uygun olan. Hemen hemen tüm fosforlu metabolitleri de protonlar ihtiva eden, ancak, örneğin, 31P NMR, genellikle orta konsantre fosforlu bileşiklerin analizi için 1H NMR göre daha uygundur. Ancak, 1H NMR sinyalleri ise ikinci, diğer fosforilatlanmamış bileşiklerinden 1H NMR sinyallerinin tarafından gizlenmiş edilebilirAçıkçası 31P NMR spektrumlarda arka plan sinyallerini neden olmaz. 13C NMR özel durum neredeyse sadece ilgi ise analog durumda, 19 NMR analizi, florlanmış bileşikler, örneğin, florinlenmiş ilaçlar (endojen metabolit herhangi bir arka plan sinyalleri) için tercih edilecek ise 13 C kaderi Eksojen etiketli metabolik ön yüzünden 13 C izotopu (yaklaşık% 1), son derece düşük bir doğal bolluğu, takip edilmelidir. Birçok kütle spektrometreleri da negatif iyon modunda ya pozitif iyon modunda ya da çalışır. Bu nedenle önümüzdeki iyonlar negatif veya pozitif yüklü hale gelen dikkat edilmesi olup analiz bilmek önemlidir. Bu yöntem örnek hazırlama a için gerekli (I) 'in zaman açısından düşük maliyetle önemli metabolit konsantrasyonları çok sayıda verir çünkü 1H ve31P NMR spektroskopi ile beyin dokusu metabolome analizi için bir protokol burada odaknd, (ii) bir çaba metabolit miktarının belirlenmesi için gerekli. Bütün deneyler, standart bir ıslak-kimya laboratuvar ekipman ve yüksek resolüsyon NMR spektroskopisi odası kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bundan başka değişiklikler aşağıdaki protokol kısmında açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: HAYVAN ETİK BEYANI
Sıçanlarda Hayvan çalışmaları Fransa'da geçerli yönergeleri takip ve Yerel Etik Kurulu (# 40.04, Aix-Marseille Üniversitesi Tıp Fakültesi, Marsilya, Fransa) tarafından onaylanmıştır.

1. Hasat ve Rat Beyin Donma

  1. Gerekli öğeleri hazırlayın: Sıvı azot (N 2liq.) Dewar bir dondurma kelepçe (en azından 2-3 L hacim) tutmak için yeterince büyük olduğunu; anestetik (örneğin, izofluran, ya da, ketamin / ksilazin); anestezi bölmesi; Steril diseksiyon araçları: cerrahi makas, neşter, forseps; doku mendil ve alkol (etanol) temizliği ile şişe; iğneler (25 g); 1 ve 10 ml şırıngalar. Yapışkan bant ile etiket alüminyum levhalar (yaklaşık 10 x 10 cm). Bireysel donuk-kenetli sıçan beyinleri sarmak için yapraklarını kullanın.
    NOT: Sıvı azot tutarken her zaman koruyucu eldiven ve göz koruyucu gözlük takılmalıdır!
  2. N 2liq ile Dewar doldurun. Ve ücretsiz yerBir Dewar vınlama kelepçe. Dewar N 2liq miktarı, tekrarlanan donma-kelepçe işlem için yeterli olduğundan emin olun (birkaç litre, her dondurarak toplanma esnasında buharlaşan K 2liq miktarı kelepçenin boyutuna bağlıdır).
  3. (Izofloran ile, örneğin, ya bir ketamin / ksilazin karışımın peritoneal içi enjeksiyon ile) hayvan anestezisi. Kafa derisi kaldırılır ve kafatası açıldığında kanamayı önlemek için kalp ponksiyonu ile ötanazi geçin. Adımlar 1.4-1.7 aşağıdaki Bu standart prosedürü açıklar.
    NOT: huni-dondurma N ile anestezi hayvanın beyin glikoz ve yüksek enerjili metabolitler, kurban sıçan maksimum korunmasını gerektiren özel protokollerde kafa derisi geri çekilmeden sonra, 11 2liq. Sonra, otopsi metabolizmasını 12 aza indirmek için aralıklı N 2liq altında kafatası dışarı beynini incelemek.
  4. Alkol temizliği ile sıçan başını nemlendirin. (I) rem cerrahi makas kullanınove kafa derisi, kafatası ve dikişler boyunca (ii) açık kafatası.
  5. Daha kafatasını açmak için forseps kullanın ve baş aşağı kafa konumlandırma, açık kafatası altından tüm beyin kaldırmak için. Hızlı doku mendil kullanarak herhangi bir kan izlerini çıkarın. Beyin hemisfer metabolik ve morfolojik simetrik iseniz, neşter ile kesi ile diğer yarımkürede ayıran sonra metabolik analiz için yarıkürelerinin birini kullanmak daha uygun olur. Gerekirse, bu histoloji gibi diğer beyin çalışmalar için kalan yarımkürede kullanın.
  6. Çabuk kaldırmak Dewar N 2liq gelen kelepçe -filled dondurma, bir iç yüzeyi, kelepçe üzerine tüm veya yarım sıçan beyin yerleştirin ve hemen N 2liq içine kelepçe dondurma yerleştirin sıkıca sıkıştırılmış kelepçe tutarken Dewar -filled. O 1.3-1.6 60 saniye daha uzun sürer adımları emin olun.
  7. Dewar, açık kelepçe 1-2 dk kaldır dondurma kelepçe sonra, dondurulmuş beyin kelepçe doku ve şal gevşetinşekilde etiketlenmiş alüminyum levha dondurulmuş doku (yukarıda 1.1). Etiket okunaklı ve numune sarılır sonra sıkıca kalır emin olun. Hızla N 2liq sarılı örnek yerleştirin. Dondurulmuş beyin dokusu çözülme önlemek için mümkün olduğunca çabuk tüm prosedürü uygulayın.
  8. K 2liq bölgesi veya metabolit ekstre kadar -80 ° C'de bir dondurucuda donmuş numune saklayın.
    Not: bir biyolojik numune birden fazla yıl boyunca saklanabilir olduğunda, K 2liq sıcaklıkta depolama -80 ° C den daha çok tercih edilir. Bu da bu protokolün kalanı için de geçerlidir.

Metabolizma Ekstraksiyon Usulü 2. Hazırlık

  1. Doku homojenleştirici ve uygun test tüpleri (, genelde plastikten yapılan bir homojenleştirici şaftının çapına bağlı olarak, örneğin, 10 mm iç çap) hazırlayın. Elektrik homojenizatörlerinin ziyade elle tahrik homojenizatörlerinin (doku öğütücüler) kullanın. Önvortexer ve laboratuvar dengesini pare.
  2. Ezilmiş buz dolu kova hazırlayın. Buz (4 mi 250-350 mg dondurulmuş beyin doku başına her biri) ile, metanol, kloroform ve su arasında yeterli quantitites tutun.
  3. Transferi pipetler ve şişeleri hazırlayın.
    1. Cam buz üzerinde vidalı kapakları ve yer ile şişeleri (≥20 ml hacim) (doku özü başına bir flakon) hazırlayın. Fit vida kloroform dayanıklı Teflon septumlarla bereler.
    2. Kloroform, metanol ve dağıtmak için su ve cam pipetler ya da şırıngalar Hamilton dağıtmak için 5 mi plastik pipet hazırlayın. Doku homojenatı ve metanol karışımları aktarılması için ilave bir plastik pipet (5 veya 10 ml hacim) hazırlayın.
    3. Tüm emin cam damıtılmış su ile iyice durulanmış ve dikkatli bir şekilde küçük miktarda yabancı maddeler, özellikle NMR tespit format ve asetat giderilmiş, kullanılmadan önce kurutuldu olduğundan emin olun.
  4. Harç N 2liq, yer porselen havan tokmağı ile porselen havan doldurun ve N 2l ile dolduruniq. Havan ve tokmak sıcaklığı yeterince düşük olana kadar azot buharlaşır. Harç N 2liq az miktarda tutunuz.

METABOLİTLERİN 3. Ekstraksiyon

  1. Depolama (N 2liq tank veya -80 ° C derin dondurucuda) dondurulmuş beyin doku örneği kaldırmak. Daha sonra, hemen N 2liq kısmen doldurulmuş bir harç doku örneği aktarın.
  2. Kolayca doku homojenizasyon için kullanılan test tüpleri içine sığacak küçük parçalar halinde dondurulmuş beyin dokusu kırmak için N 2liq Soğuk havan tokmağı kullanarak. , Süreç içinde harcın dışarı yansıtılan dondurulmuş doku parçalarını engellemek hala alüminyum levha sarılı olurken doku kırmak için. Bu test tüpü daha zor (Su yoğunlaşması riski) transfer yapmak gibi toz dondurulmuş doku eziyet etmeyin. ÖNEMLİ: bütün prosedür boyunca, derin dondurulmuş örneği tutmak için gerekli harç N 2liq ekleyin.
  3. Mix sİyice dondurulmuş beyin dokusu merkezi parçalar, 250-350 mg tartılır ve buz soğukluğunda metanol (250-350 mg beyin dokusu boyunca 4 mi) ile dolu bir deney tüpüne aktarılır. Dondurulmuş doku parçaları her zaman doku homojenleştirici ile homojenize, sözkonusu ilave edilir.
    NOT: numune ağırlığının hesaplanmasına yol açar ve numunenin (ii) ısıtma ve çözme olurdu numune üzerinde önemli su yoğunlaşmasını (i) kaçınmak için hızlı tüm bu yordamı tamamlayın. Bağımsız doku parçaları homojen hale getirme işleminin başlangıcında donmuş bir halde olması gerekir.
  4. Donmuş sıçan beyin numunesinden son parçası test tüpüne homojenize eklenmiş sonra, ≥20 ml hacimli bir cam şişe, mevcut vidalı kapağa Homojenat transferi ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir. Test tüpünün hacmi ≥4 ml metanol için yeterince büyük değilse, için karışımın transfer dondurulmuş beyin dokusu homojenize bir parçası için daha küçük bir metanol hacmi kullanınCam şişe ve taze metanol ile kalan doku parçaları homojenize devam etmektedir. Toplam metanol hacmi 250-350 mg beyin dokusu başına 4 mi olduğundan emin olun.
  5. İyice homojenat, girdaba buzla soğutulmuş kloroform (örneğin, 250-350 mg beyin dokusu başına 4 mi) aynı hacimde eklenir ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.
    NOT: özellikle kloroform, uçucu solventler tutarken her zaman havalandırılmış kimyasal kaputu kullanın!
  6. Su aynı hacimde ekleme (örneğin, 250-350 mg beyin doku başına 4 mi) homojenat, girdaba iyice ve -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca bekletildi.

Faz Ayırma ve Solvent Buharlaşma 4. hazırlanması

  1. Soğuk santrifüj (4 ° C, maksimum yarıçap 13.000 xg) ve santrifüj tüplerini hazırlayın. Kloroformda dirençli ≥20 ml hacim vardır ve 13,000 x g santrifüj kuvvetlerine dayanabilmesini sağlamak. Olmak damıtılmış su ile özel cam santrifüj tüplerini kullanın ama (bütün cam eşya gibi) durulamaön kullanım (2.3).
  2. Iyice durulanır cam Pasteur pipetler ve uygun bir propipettor hazırlayın (ampul, manuel pipet pompası, otomatik pipet yardımı / pipeti, vb.).
  3. (Cam veya teflon), kloroform dayanıklı olması gerekir ki, bir beyin ve numune başına iki ek tüp iyice çalkalandı (≥15 ml hacim), metanol (ya da cam dayanıklı plastikten yapılmış), metanol diğer bir hazırlayın.
  4. (Ticari olarak temin edilebilir ya da homebuilt) çözücü buharlaştırma aparatı hazırlayın. Bu cihaz, uçucu çözücüler (metanol, kloroform) ihtiva eden bir ekstre çözeltisinin yüzeyine doğru yönlendirilir, kuru bir nitrojen gazı son derece kontrollü akışını sağlar emin olun.
  5. Buz dolu iki ek tepsileri veya kova hazırlayın: bir örnek buz üzerinde taşıma, ve buharlaşma esnasında soğuk örnekleri tutmak için başka biri için.
  6. , Liyofilizasyon için gerekli dondurarak kurutucunun (dondurarak-kurutucu) ve malzemelerin hazırlanması: (i) bir 50ml santrifüj tüpüne ya da vakum yuvarlak tabanlı bir şişe başına özü, ve (ii) K 2liq numune sulu fazın (numune başına ≤0.3 L), dondurulur. Santrifüj tüpü kullanıldığı takdirde, aynı zamanda liyofilizatör için müsait geniş boyunlu bir vakum filtre şişesi hazırlayın.

5. Faz Ayırma ve Solvent Buharlaşma

  1. Tam faz ayrılması için 13,000 x g'da bir kloroform-dirençli bir santrifüj tüpüne (≥20 ml hacim) ve santrifüj (3.6) metanol / kloroform / su / beyin dokusu Homojenat transferi ve 40 dakika boyunca 4 ° C'de.
    Not: iki faz çöken protein, bir katman ile ayrılmış oluşturacaktır. Üst (açık) faz, su, metanol ve çözünmüş suda çözünür metabolitlerin yapı göstermiştir düşük (ağır) faz, metanol, kloroform ve eritilmiş lipid içerir.
  2. Uygun bir ≥15 ml tüp (metanol dirençli plastik veya cam) için üst faz transfer etmek için bir Pasteur pipeti kullanılır. I devamce.
  3. Uygun bir ≥15 ml tüp (cam ya da Teflon) için alt faz transfer etmek için yeni bir Pasteur pipeti kullanarak. Buz üzerinde tutun.
  4. Toplam proteinin belirlenmesi için kullanılacak ise, -80 ° C de çökelmiş protein tabakası saklayın; ya da başka atın.
  5. Buz üzerinde su / metanol fazı (5.2) ile birlikte tüpü tutmak ve ekstrakt çözeltisinin yüzeyi üzerine, kuru bir azot akımının yönlendirilmesi ile metanol buharlaştırılır. Seçenek olarak, özüt çözeltisi içinden kabarcık yavaşça azot. Nitrojen kabarması, artık ekstrakt çözeltisi hacmi düşüşe neden olduğu buharlaştırma işlemini iptal eder. Şu anda, liyofilizasyon ile devam eder (5.7), ya da dondurarak ve tüp kapatılmış liyofilizasyon için kadar (vidalı kapak veya Parafilm ™), -80 ° C'de örnek hazır tutar.
  6. Buz üzerinde metanol / kloroform faz (5.3) ile tüp yerleştirin ve su'nun üzerine bir kuru azot akışı yönlendirerek metanol buharlaşmasıEkstre çözeltisi rface. Tüm çözücü buharlaştırılmış, işlemi sona erdirmek ve tüp kapatılmış NMR analizi için hazır oluncaya kadar (vidalı kapak veya Parafilm ™), -80 ° C'de örnek tutun.
  7. Liyofilizasyon için sulu faz hazırlanır
    1. Metanol buharlaştırma işleminin sonunda (5.5) sonra, iyice durulandı, 50 ml bir santrifüj tüpüne örnek aktarmak (örnek donmuş ise, çözülme aktarım işlemi). Alternatif olarak, manyetik olarak karıştırılan bir vakuma aktarılır.
    2. Kısmen tüp veya şişenin iç yüzeyi kademeli dondurulmuş, sıvı tarafından örtülecek kadar K 2liq eklenir santrifüj tüpü (ya da yuvarlak bir şişeye) çevirerek özüt çözeltisi dondurun. Emin hayır N 2liq olun. Yuvasını girebilirsiniz.
    3. Bütün sıvı donduğunda buhar çıkışına imkan vermek için bir kapak veya delinmiş vidalı kapaklı tüp kapak ve geniş boyunlu bir şişede vakum filtre tüpü yerleştirin.
    4. Atta liyofilizasyondan sonra Başlangıçching dondurarak kurutma için şişe veya şişe.
  8. Numune tamamen kuruduktan sonra liyofilizasyon işlemi iptal eder. Kapalı bir tüp içinde -80 ° C'de örnek tutun (sıkı bir kapaklı!) NMR analizi için kullanılana kadar.
    NOT: Genellikle en fazla 24 saat iyofilleşme ihtiyaç vardır. Çeşitli örnekler liyofilizatör tasarımına bağlı olarak, aynı zamanda liyofilize, geniş boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişe veya şişeler içinde santrifüj tüpleri kullanılmaktadır konusunda edilebilir.

NMR örnekleri 6. hazırlanması

  1. Mağaza kurutuldu ve çok düşük bir sıcaklıkta liyofilize ekstreleri (≤-80 ° C). NMR hemen önce deney NMR numunelerin hazırlanması için liyofilizatlar yeniden çözülür.
    Not: çözeltisi ve / veya oda sıcaklığı civarında numune numune saklama düşmesine neden olabilir!
  2. Aşağıdaki gibi, kenetleme maddesi, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic asit (CDTA) sulu 200 mM'lik çözelti hazırlayın:
    1. Bir test tüpü veya bir santrifüj tüpüne saf su (örneğin, 20 mi) ilave edilir ve 200 mM'lik bir çözelti oluşturmak için gerekli olan CDTA toz miktarını ekleyin.
      Not: CDTA asit formu CDTA tuz yerine kullanılmıştır çünkü pH değeri çok düşük olması nedeniyle CDTA önemli bir kısmı, çözünür olmayacaktır.
    2. Dikkatlice ilave CDTA çözeltisine CsOH tozu artan miktarlarda, adım adım ve iyice vorteks her ilaveden sonra.
      Not: Çözünür CDTA fraksiyon, sulu çözelti içinde CsOH içeriği arttıkça artacaktır. Yani CDTA çözeltisine CsOH bir stoykiometrik miktarından daha az ekle "overtitration" kaçının.
    3. Neredeyse bütün CDTA toz eritilir, her ek CsOH ve tam bir vorteks sonra pH derecesi ölçülerek başlar. Nihai pH (Tablo 1) ulaşıldığında CsOH ilave sona erdirebilir.
      NOT: Bu anda, tüm CDTA eritilecektir. CDTA için bir karşı iyon olarak Cs + `nin kullanımı olup Jeneratörortağı, Na + veya K + fazla tercih edilir. Daha küçük iyonik yarıçapına sahiptir ve sert asitlerdir, Na + ve K + 'ya karşı Cs +, geniş iyonlu yarıçapı nedeniyle yumuşak bir Lewis asididir. Sonuç olarak, Cs + form fosfatlar (sert bazlar) ile kompleksler daha az kolaylıkla Na + ve K +, yok. Kompleks, özellikle ara ürün iyon değişimi için yavaş koşulları altında, NMR Çizgi genişlikleri artırma eğilimi olduğundan, bu metabolitlerin fosforlu 31P NMR spektroskopisi için avantajlıdır.
  3. 31P NMR fosfolipid analizi (PL) için, lipitler, kurutuldu (CDCI3) deuteratlanmış kloroform içeren bir çözelti maddesi karışımının 700 ul (5.6) çözülür, metanol ve tarif edildiği gibi hazırlanan CDTA çözelti, 6.2 (5: 4: 1 hacim oranında). Bir mikrosantrifüj tüp örnek aktarın. Direkt deplasman (veya pozitif-deplasman) mikropipet kullanın kloroform-karşıHer iki aşamada da karınca ipuçları.
    NOT: Aşağıdaki parametrelerden herhangi değişen PL 31 P NMR spektrumları 13-17 görünümünü (kimyasal kayma ve çizgi genişlikleri) etkileyeceğini unutmayın:
    (I) hacim oranı CDCI3: MeOH çözeltisi CDTA
    (Ii) toplam çözücü hacmi kullanılan
    Çözücünün sulu bileşen (iii) pH,
    Çözücünün sulu bileşen (iv) CDTA konsantrasyonu.
    NOT: Bu örnek parametrelerinin genel, ince ayar (Tablo 1) gerekli değildir, ve özel durumlarda istenirse çok dikkatli yapılmalıdır yılında. Çözücü arasındaki hacim oranının değiştirilmesi kolaylıkla iki aşamada yerine homojen bir faz içeren bir sistemin oluşumuyla sonuçlanan! Tek fazlı sistem pek çok uygulamada 13,14 iki fazlı bir sisteme göre daha kullanışlı olduğu bulunmuştur.
  4. Suda çözünür metabolitlerin 1 * H NMR analizi için, içinde liyofilizatı (5.8) çözülür 700 ul döteryum oksit 3-(trimetilsilil) ihtiva eden (D 2 O)-propionik asit 2,2,3,3-d4-sodyum tuzu milimolar aralığında (TSPd 4), (D 2% 0.05 TSPd 4 ihtiva eden ticari olarak temin edilebilir Ç) . Bir mikrosantrifüj tüp örnek aktarın.
  5. Döteryum klorür (DCI) ve sodyum deuteroxide (NaOD) çözeltilerinin az miktarda (yaklaşık 2 | il) ilave edilerek 7.3 edilen sulu ekstre çözeltisinin pH ayarlayın. Öncelikle, 0.02 N DCI veya NaOD çözümleri ile başlar. 2 veya 3 sonraki eklemeler yeterli pH değişimine neden yoksa, 0.2 N DCI veya NaOD çözümleri ile devam ediyor. Overtitrate için dikkatli olun.
    NOT: Gerekli DCI veya NaOD çözeltinin toplam miktarı, ekstre edilmiş beyin dokusunun miktarına bağlıdır; hassas metaboliti kantitasyonunu bu değeri not alın. Çoğu durumda ilave DCI ve NaOD çözeltilerinin bir arada hacimleri (NMR numune hacmi yakın şekilde% 1), hemen hemen yok denecek kadar azdır.
Beyin fosfolipid Analizi 13,14 için 31 P NMR Deneyi itle "> 7. Performans

  1. En iyi sonuçları elde etmek için, (162 MHz 31 P veya 400 MHz 1H rezonans frekanslarının tekabül eden ≥9.4 Tesla alan gücü), bir çok çekirdekli yüksek çözünürlüklü NMR spektrometre kullanılır. 31P bobin yanı sıra, 31P NMR sistemi proton ayırmayla bir 1H bobin sahip olması. İstenen hedef değere (genellikle 25 ° C) NMR sonda ayarlayın sıcaklık ayarı.
    NOT: Sonda sıcaklığı dengelemek için 10-20 dakika gerekebilir!
  2. Santrifüj PL ekstre, 4 ° C de bir mikrosantrfuj tübünde çözeltisi (6.3) ve 30 dakika boyunca 11,000 x g, numunedeki katı artıkları aşağı doğru dönmeye. Yüksek kaliteli bir NMR tüpü (5 mm dış çap) 600 ul süpernatan aktarın.
  3. (MDP) çözümü kimyasal kayma referans için pH 7.0 sulu 20 mM metilendifosfonat dolu uygun koaksiyel uç kök hazırlayınve kantitasyon. PL ekstrakt çözeltisi ile doldurulmuş NMR tüpü içinde bu ekleme yerleştirin.
  4. NMR mıknatısa uygun döndürücü ve transferi ile NMR tüpü takın. Şimdi 15-20 Hz örnek dönmeye ve örnek ayarlanan sıcaklık (yaklaşık 10 dakika) ayarlanabilir kadar bekleyin.
  5. Dikkatle şim bobin akımları 18 ekseni ve off-eksen ayarlayarak numûnesindeki manyetik alan homojen olmayan minimize.
  6. Bir manyetik alan gücü (9.4 tesla için, tavsiye edilen parametre değerleri için Tablo 1 'e bakınız) bir fonksiyonu olarak değişebilir optimum değerlere NMR spektrum elde etme parametrelerini ayarlar.
  7. Deneyin (= NS) başına geçici Set sayısı.
    1. Ancak en yaygın PL hassas ile hesaplanır edilmesi durumunda yaklaşık 80 (verilerin elde edilmesi yaklaşık 20 dakika toplam süresi) NS ayarlayın (fosfatidilkolin (PtdCho), fosfatidiletanolamin (PtdEtn), etanolamin, plazmalojen).
    2. D yaklaşık 100-200 (toplam süresi NS Setata alıcı 1-2 saat) (alkil-asil-fosfatidilkolin, fosfatidilinositol, fosfatidilserin, fosfatidik asit) kantifiye edilmesi, daha az konsantre PL ise.
    3. Yaklaşık 1,500-2,000 kadar ayarlayın NS (veri toplama, 7-10 saat arasında toplam süresi gece boyunca deneyi) çok düşük konsantrasyon PL kantifiye edilmesi durumunda, örneğin, mono ve fosfatidilinositol difosfat (PtdIP ve PtdIP 2), kardiyolipin, lizo-PL , alkil-asil-fosfatidiletanolamin ve bazen diğerleri.
  8. Spektrum elde edilmesi, iyileştirilmiş işlem parametreleri kullanılarak serbest indüksiyon bozulması (FID) 'nin sona ermesinden sonra. Manyetik alan kuvveti, ayar kalitesi ve PL sinyalinin bir fonksiyonu olarak ölçülebilir, bu parametrelerin değerleri değişir.
    1. Işleme birden kullanarak (en az iki) farklı filtreleme işlemlerini tekrarlayın, PL tüm aralığı için en iyi sonuçları elde etmek için. , Şiddetle örtüşen sinyaller için güçlü kararlılık geliştirmesini kullanın, örneğin., PtdCho ve PtdEtn içinbölgeleri.
    2. Zayıf sinyaller güçlü filtreleme (zayıf ya da hiç çözünürlük artışı) kullanın.
    3. Sinyal-gürültü oranını, örneğin, PtdIP ve PtdIP 2 geliştirmek için önemli miktarda apodization üst üste (ör: LB = 3Hz) olmadan çok zayıf, geniş sinyaller Filtre. Karakteristik işleme parametreleri için Tablo 1'e bakınız.
  9. Aynı spektrumda referans bileşiği (MDP) 'de sinyal altında alana göre her PL sinyalin alanını ölçmek.
  10. ((I) bilinen bir konsantrasyonda bir fosfor bileşiği ve PL 31P NMR deneylerinde kullanılan (ii) aynı eksenli uç sapı ile doldurulmuş bir 5 mm'lik NMR tüpü kullanılarak bir deneyde referans bileşik (MDP) 'sinyalini kalibre görmek 7.3 ve 7.9).
  11. Bir yandan (7.9) üzerine PL sinyallerin göreli alanlarına göre bireysel PL konsantrasyonları hesaplayın, ve gelen MDP için elde kalibrasyon değeridiğer koaksiyel insert (7.10). Belirli bir 31P NMR sinyalinin katkıda fosfor çekirdeklerin sayısı, bu sinyalin moleküler kökenli bir fonksiyonu olarak değişebilir dikkate alın.
    NOT: kardiyopilin fosfat sinyalini yaptığı gibi MDP fosfonat sinyali (genellikle 19.39 ppm başvurulan), iki fosfor çekirdekleri temsil eder. Beyin ekstreleri içinde tespit edilen tüm diğer PL 31P NMR sinyalleri bir fosfor çekirdeği, her temsil eder.
  12. Hayvan grupları arasındaki beyin PL düzeylerini karşılaştırmak için gerektiği gibi istatistik yazılımı kullanın.

Beyin Metabolitler Suda çözünür Analizi için 1H NMR Deneyi 8. Performans

  1. İstenen hedef değere (genellikle 25 ° C) 1H NMR sonda ayarlayın sıcaklık ayarı. Ayrıca bkz 7.1 belirtiyor.
  2. 4 ° C ve 11000 de mikrosantrifüj tüpüne (6.5), sulu ekstre çözeltisi santrifüj30 dakika boyunca x g, numunedeki katı artıkları aşağı doğru dönmeye. Yüksek kaliteli bir NMR tüpü (5 mm dış çap) 600 ul süpernatan aktarın.
  3. NMR mıknatıs, pabucun ve 7,4-7,6 açıklandığı gibi uygun değerlere ayarlanır NMR spektrum satın alma parametreleri Transfer NMR tüpü. Önerilen parametre değerleri için ayrıca Tablo 1'e bakınız.
  4. NS 32 (veri toplama yaklaşık 13 dk toplam süresini) = yaklaşık deney başına Transientlerin sayısını ayarlayın. Özellikle aromatik bölgede, çok zayıf sinyaller için iyi sinyal-gürültü oranları elde etmek için, NS veya daha fazla 64 (veri toplama yaklaşık 26 dk toplam süresini) = kullanın.
  5. Spektrum elde edilmesi, iyileştirilmiş işlem parametreleri kullanılarak serbest indüksiyon bozulması (FID) 'nin sona ermesinden sonra. Manyetik alan kuvveti, ayar kalitesi ve metabolit sinyalinin bir fonksiyonu olarak ölçülebilir, bu parametrelerin değerleri biraz değişebilir.
    NOT: Bir çok durumda, bir kez, her bir spektrum işlemek için yeterlidir, Tüm sinyaller için metabolit iyi bir denge gösteren işlem parametreleri kullanılarak bir dizi. Karakteristik işleme parametreleri için Tablo 1'e bakınız.
  6. Aynı spektrumda referans bileşiği (TSP-d4) sinyaline altındaki alana göre (bazen farklı moleküllerden sonucu diğer tekli ya da çoklu ile üst üste, genellikle çoklu), her bir metabolit sinyalin alanını ölçmek.
  7. TSP-d 4 konsantrasyonuna dayanan bireysel metaboliti konsantrasyonları (6.4) hesaplayın. Belirli 1H NMR sinyalinin katkıda proton sayısı, bu sinyalin moleküler kökenli bir fonksiyonu olarak değişebilir dikkate alın. (0.0 ppm başvurulan) TSP-d 4 trimetil sinyal dokuz protonları temsil eder.
  8. Hayvan grupları arasındaki beyin metabolit düzeylerini karşılaştırmak için gerektiği gibi istatistik yazılımı kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Özü çözümler mevcut: beyin ve diğer doku özleri metabolik NMR spektrumları iyi çözünürlük elde etmek için, uzun kaldırmak veya (paramanyetik iyonlar en önemlisi) maske metal iyonları yaygın bir uygulama olmuştur. Bu, ya da Chelex-100 20 gibi bir iyon alışveriş reçinesi ile özü geçirilerek, ekstre 19, EDTA veya CDTA gibi bir kenetleme maddesinin ilave edilmesi yoluyla elde edilmiştir. Şekil 1'de sunulan sonuçlar, beyin ekstreleri dikkatli bir şekilde, yukarıdaki protokole göre hazır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

NMR spektroskopisi, bir çok yeniden üretilebilir ve doğru bir şekilde çözelti içinde kimyasal bileşiklerin konsantrasyonlarının ölçülmesi için etkili bir yöntemdir. Ancak, yüksek kalitede veri elde etmek için bu örnek hazırlama ve analizleri konusunda belirli kurallara uymak gereklidir. Gözlemlenen bir sinyalin yoğunluğu algılama eşiğini (özellikle zayıf sinyal) yaklaşımları edilmiştir, NMR spektroskopi ile metabolit konsantrasyonlarının belirlenmesinde, üretim ya NMR sinyalinin alım de, niceleme hata hakimdir. Diğer tü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 ve 7339) tarafından verilen destek minnetle kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
IsofluranVirbacVetfluran hayvanlariçin anestezik
Isofluran buharlaştırıcıOhmedaIsotec 3Daha yeni model mevcut: Isotec 4
Neşter, makas, forseps, kelepçelerHarvard Apparatus
Fisher Scientific		çeşitli
hayvanlar		için çeşitli Cerrahi ekipman
Dondurarak kelepçe aracıev yapımıyokAlüminyum plakalı maşa, soğutma için sıvı nitrojen içine
yerleştirilecek şekilde
DewarNalgene4150-4000
Sıvı nitrojenAir Liquiden/a
Nitrojen gazıAir Liquiden/a
Nitrojen evaporatörOrganomasyon OrtaklarıN-EVAP 111Ev yapımı cihaz
MortarSigma-Aldrich ile değiştirilebilir
HavaneliSigma-AldrichZ247510
Doku homojenizatörüKinematicaPolytronTest tüpleri ile homojenizatör mili
Elektronik teraziSartoriusn/a
MetanolSigma-AldrichM3641
KloroformSigma-Aldrich366910
Cam santrifüj tüpleriKimble45500-15, 45500-30Kimax 15 ml, 30 ml tüp
Mikrosantrifüj tüpleriKimble45150-2Kimax 2 ml tüp; santrifüj rotoru ile uyumluysa "Eppendorf" tüpünün yerini almalıdır
Polistiren pipetlerCostar CorningStripets5 ve 10 ml hacimler
DeuterochloroformSigma-Aldrich431915%99.96 döteryumlu
Döteryum oksitSigma-Aldrich423459%99,96 döteryumlu
Döteryum klorürAlpha Aesar42406%20 döteryum oksit içinde
Sodyum döteroksitSigma-Aldrich164488%30 döteryum oksit
LiyofilizatörMesihAlfa 1-2
Soğuk santrifüjHeraeusMegafuge 16R
pH metreEutech SibernetikCyberscan
CDTASigma-AldrichD0922
Sezyum hidroksitSigma-Aldrich516988
NMR tüpleriWilmad528-PP
NMR gövde koaksiyel uçSigma-AldrichZ278513Wilmad
NMR pipetleriSigma-AldrichZ255688
PipetlerEppendorfResearch0,5 ila 1.000 &mu arasındaki hacimler için uçlarla; l
Pipet-AidDrummondXP
NMR spektrometresiBrukerAVANCE 400prob ve diğer aksesuarlar dahil
NMR yazılımıBrukerTopSpin 1.3daha yeni sürüm mevcut: Topspin 3.2
Suda çözünür standart bileşiklerSigma-Aldrichçeşitli
Fosfolipid standart bileşikleriAvanti Polar Lipids
Doosan Serdary
Sigma-Aldrich		çeşitli
çeşitli
plazmalojenler için çeşitli Kaynak, ancak < % 70 - 80 saflıkta
MetilendifosfonatSigma-AldrichM9508
TSP-d4Sigma-Aldrich269913
Z247472,

Kaynaklar

  1. Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5(2008).
  2. Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1(2012).
  3. Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
  4. Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
  5. Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
  6. Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
  7. Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157(2007).
  8. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  9. Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. Metabolomics in drug target discovery. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).
  10. Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  11. Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
  12. Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
  13. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
  14. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
  15. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  16. Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101(2013).
  17. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
  18. Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
  19. Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
  20. Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

NMR SpektroskopisiBeyin Dokusu EkstraktlarDoku HomojenizasyonuMetanol Kloroform SuLiyofilizasyon S reciFosfolipid AnaliziY ksek z n rl kl NMRMetabolit Profilleme
Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.