C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

Özet

Belirli çevresel stres faktörlerine maruz kaldıktan sonra, nematod Caenorhabditis elegans, strese dirençli bir 'dauer' gençlik aşamasına girmek için geniş fenotipik plastisiteye uğrar. Dauer sırasında nöroplastisitenin kontrollü indüksiyonu ve görüntülenmesi için yöntemler sunuyoruz.

Özet

Hayvanlarda stres ile indüklenen fenotipik esneklik kontrol mekanizmaları incelemek için in vivo olarak çoğunlukla kompleks ve zordur. Stres ile indüklenen plastisite klasik bir örneği, C Dauer aşamasıdır elegans. Dauers bakteriyel gıda ve Dauer feromon yüksek konsantrasyonlarının düşük konsantrasyonlarda koşulları altında oluşan alternatif bir gelişim larva bulunmaktadır. Dauers kapsamlı gelişimsel ve davranışsal plastisite gösterir. Örneğin, dört iç dudak kadran bir dizi (IL2Q) nöronları Dauer oluşumu sırasında Reverzibl remodeling tabi tutulur. Büyük ölçekli sıvı nematod kültürlerinden ham Dauer feromonunun üretimi için iyi bilinen çevre yollarını düzenlemeye Dauer girişi, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntemle, 50,000 'lik bir konsantrasyon - sıvı kültürü 75,000 nematod / ml bir yüksek ölçüde kuvvetli ham Dauer feromon üretmek için yeterlidir. Ham feromon gücü olan deteBir doz-tepki biyo-tahlil ile rmined. Son olarak, Dauer oluşumu sırasında IL2Qs in vivo zaman atlamalı görüntüleme için kullanılan yöntemler tarif edilmiştir.

Giriş

Gelişimsel ve davranışsal plastisite fenatipik plastisite, olumsuz çevre koşullarına adaptasyonları için önemlidir ve evrim ¹ itici bir güç olarak kabul edilir. C. elegans sık geliştirme ve nörobiyoloji çalışmalar için kullanılan bir model organizmadır. İdeal koşullar altında, C. elegans yetişkin üreme aşamasına başlamadan önce dört larva aşamalardan geçerek gelişir. Ancak, düşük gıda kullanılabilirlik ve yüksek nüfus yoğunluğu, C koşulları altında elegans gelişimsel anahtarı geçmesi ve uzun ömürlü ve stres dayanıklı Dauer evre ² içine girebilirsiniz. Dauers olasılıkla bu stres direnci aracılık olmayan dauers birkaç morfolojik ve davranışsal farklılıklar gösterecektir. Dauer girişi düzenleyen çevre kuyrukları ve genetik yollar yoğun ^{oldu, 5, 4, 3 6, 7} nitelendirdiler. Ancak, bireysel fenotipik değişiklikleri kontrol eden moleküler mekanizmalar d meydana olduğunurada Dauer oluşumu daha az iyi anlaşılmaktadır.

Dauer özgü fenotiplerinin incelenmesi Dauer hayvanların üretimini gerektirir. Bu üç şekilde yapılabilir: 1) C bir açlıktan kültüründen Çekme elegans, 2) Dauer oluşum bünye (Daf-c) mutantlar, arıtılmış feromon sayesinde Dauer oluşumu 3) ndüksiyonunun kullanımı. Bir C ile standart bir NGM plaka ikinci dauers almak için nispeten basit onun bakteriyel gıda arzını tükenmiş elegans nüfus. Elimizde olanlar, standart bir NGM plaka orjinal 3 gün büyümeye bırakıldı ve daha sonra 3 ile aşılanmış Escherichia coli OP50, 50 ul ile tohumlanmış - 4 ergin hermafrodit bireyler bir hafta içinde gıda kaynağı dışarı atmasını sağlar ve birkaç bin üretecek 25 ° C'de tutuldu İlave bir 3 gün içinde dauers (çok sayıda açlıktan olmayan dauers ek olarak). Bununla birlikte, bu yöntem, d içine molt sırasında meydana gelen incelenmesi işlemleri için tatmin edici değildirauer. Bu Dauer girmektedir tipik bir açlıktan plaka üzerinde bir kaç bin hayvan belirlemek zordur. Ayrıca, hasret plaka kullanımı senkronizasyonu için hiçbir imkanı sunuyor. DAF-C mutantlarının kullanımı senkronizasyon ve dauers güvenilir oluşturulmasına izin verir. Ancak, belirli bir Daf-c mutasyonu tek başına veya ek mutasyonlar ile birlikte diğer Dauer özgü fenotipleri etkilemez garantisi yoktur.

Bir Dauer feromon varlığı ilk Cassada ve Russell tarafından ima ve daha sonra Altın ve Riddle tarafından gösterilmiştir. Dauer feromon yana ^kimyasal olarak ^{9, 10 8, 2} karakterize edilmiştir. Arıtılmış feromon farklı şekillerde ^9, bir ham özü Dauer feromon ^11. Kullanımlar sağlar hem hareketsel hem de gelişim süreçleri düzenleyen ascarosides karmaşık bir harmanından oluşur doğal tipte bir arka senkronize dauers güvenilir kontrol indüksiyonu.

Sinir sistemi ve ilişkili glial hücreler Dauer larva oluşumu ^{12, 13, 14} sırasında biçimlenme geçmesi. Bu değişikliklerin bazıları, Dauer ^{13, 14} sırasında glia hücrelerinin yeniden olarak, geri döndürülemez. Ancak, başka biçimlenme olayları olumlu bir dönüş üzerine geri dönüşümlüdür çevre koşulları. Dendrit arborization, multidendritic nöronlar ve akson ¹² biçimlenme tek dendritik bir anahtarı: Örneğin, dört IL2Q nöronların bir dizi dahil Dauer oluşumu sırasında hızlı ve geri dönüşümlü nöronal biçimlenme tabi. Buradaki yöntemler, bir model organizmada strese bağlı nöroplastisitesi güvenilir bir in vivo görüntüleme için izin verir. Üretim ve ham Dauer feromon testleri için sunulan yöntemler, daha önce çeşitli kaynaklardan ^{4, 8, 15, 16, 17, 18} tarif edilen ve derlenmektedir.

Protokol

1. Ham Dauer Feromon Üretimi

1. OP50 E. büyütün Tek bir koloni, O / N 37 ° C 'de E. coli 200 rpm'de LB suyu 100 ml çalkalandı. NOT: Bu göre O / N kültür önceden yapılmış ve 4 ° C'de saklanabilir.
2. N2 C büyütün elegans, 15 - 20 OP50 E: 50 ul NGM ağarma (Tablo 1 'de tarif bak) ile 6 cm Petri kapları coli bakteri kadar neredeyse ¹⁹ tükenmiş.
3. 1 L Erlenmeyer'de S medya 5x 250 ml (Tablo 1 tarifi görün) Marka ¹⁹ şişeleri. NOT: Bu çözüm önceden yapılabilir.
4. OP50 E. kültürünü büyütün E. coli 'de OP50 1 ml LB suyu aşılayarak O 4 L / K coli E. coli ve 16 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanarak.
5. , (S bazal çözeltisi (Tablo 1 'de tarif bak) ve Aşama 1.3' de hazırlanan media, 4: 1 L'lik Erlenmeyer kaplanna her birinin içine, 4-5 plakalarından buraya nematod 1 ml levhalar (adım 1.2) için 4- nematodları yıkayın 5 plakalarıHer şişe için) ^19,.
6. 10 dakika boyunca 650 x g'de aşama 1.4 OP50 santrifüj ve supernatant çıkarın. G taban çözeltisi 10 ml her bir bakteri pelletini. Nematodların her şişeye yeniden süspansiyon haline getirildi bakteri eşit miktarda aktarın.
7. Çözelti, yiyecek tükenmesi gösteren temizlemek için başlayana kadar 5 gün - (- 25 ° C'de 20) ve 100 - 4 150 rpm'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde şişeler yerleştirin.
8. Gıda bitince, OP50 E. başka bir O / N kültür büyümek LB suyu 4x 1 L E. coli. 10 dakika boyunca 650 x g'de santrifüj ve bakteri, nematodlar ile media şişelere her bir şişeye bir pelet ekleyin. Gıda daha bitene kadar ilave 3-4 gün boyunca, Aşama 1.7 gibi orbital çalkalayıcıya S ortam şişeler dönün.
9. Her bir şişeden bir çözelti ~ 1 ml lik bir alın ve her biri 1 ml'lik bir 1 ul alt-numûne alma ve nematodların sayısını sayarak nematod konsantrasyonu tahmin ediyoruz. NOT:75,000 nematodlar / mL - nematod popülasyonu 50,000 olmalıdır. Bu konsantrasyonda nematod çoğunluğu dauers bulunmaktadır.
10. Kirlenmiş şişeleri atın. NOT: Kirlilik sık adımı 1.9 sırasında görülen hyphe'nin olarak tezahür eder.
11. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüje nematodlar. Nematod pelet atın ve süpernatant saklayın. Alternatif olarak, düşük potens feromon yapmak için bu hayvanları kullanarak tartışma bakın.
12. # 1 Whatman filtre kağıdı ile süpernatantı Filtresi. NOT: Bir termos bu süreci hızlandırmak olacaktır.
13. Ayrıca 0.45 mikron steril vakumlu filtrasyon üniteleri ile süpernatant süzün. Not: Filtrat, 4 ° C'de O / N ya da muhafaza 1,14 devam edilebilir.
14. Bir karıştırma çubuğu ile bir 2 L'lik bir kap için filtrat ekleyin. Bir ısıtma karıştırma plakası üzerinde bir çeker ocak içinde yerleştirin. Karıştırılarak bir taşım kaynatın ve yaklaşık 200 ml buharlaşır. 500 ml'lik bir behere çözeltisini. Yaklaşık 50 ml le kadar kaynar Devamft. NOT: çözüm taşmak için mümkün olduğu gibi Bakım bu adım sırasında alınmalıdır. Son 50 ml'lik rengi koyu kahverengi. Pişirme işlemi sırasında herhangi bir zamanda, ısı kapatılabilir ve süzülen madde, oda sıcaklığında ya da 4 ° C 'de O / N saklanır.
15. G soğuması ve x 1000 de 5 dakika süreyle santrifüj. 100 ml'lik bir beher içine dökün ve süpernatant pelet atılır.
16. Kahverengi bir kabuk yüzer aşağı kaynatın. Ateşten alın ve bir spatula ile kabuk kırmaya. Kabuk karşılamak için yeterli 200 derece etanol ekleyin. Parafilm ile beher örtün ve oda sıcaklığında O / N bekletin. Temiz bir beher içine dökün ve etanol tarafına yerleştirin. Kabuk kapağı taze etanol ekleyin. O / N Extractions 3 kez tekrarlayın. Ekstraktları havuzda toplayın.
17. Etanol ekstraktları için bir vakum pompası kullanılır. Bir vakum pompası mevcut değilse, bir çeker ocak içinde, bir taraftan karıştırılırken 50 ° C'ye kadar temiz bir cam deney ve sıcak etanol ile özü ekleyin. NOT: etanol l yapışkan bir kalıntı buharlaştırılarak sonraIght kahverengi kalmalıdır. Isıtma kullanıldığı takdirde, çok uzun süre bakım ısıtılarak çözelti yakmak için özen gösterilmesi gerekmektedir.
18. Damıtılmış steril su içinde 10 ml bir tortu çözülür. Filtre 1 ml alikotlar içinde -20 ° C'de bir 0.22 um şırınga filtre ve mağaza bu solüsyon sterilize edin. Not: 1 ml su esas sıvı nematod kültürünün her 100 ml için en eritilmesi için kullanılır. Sıvı kültür şişelerinden bir kirlenme nedeniyle göz ardı edilir, örneğin, daha sonra bir tortu çözmek için kullanılan su miktarını ayarlayın.

Feromon Doz Tepki 2. belirlenmesi

1. Peptonu olmadan Noble agar NGM ortamı 6x 5 ml yaparak Dauer feromon hazırlanmakta ve 50 ug / ml streptomisin sülfat ug ve dayanıklı feromon bir dizi ile takviye edilmiştir. ^{4, 19} (Tablo 1 'de tarife bakınız), bir 13x100 mm Karışım bileşenleri cam kültürü tüp, bir Bunsen beki taşmak, ve daha sonra 3 cm Petri kaplarına dökün.
2. Am tartılıricrocentrifuge tüpü. E. göre O / N kültürün 1 ml ekleyin mikrosantrifüj tüp içinde ~ 17.000 x g'de tüp ve santrifüj coli OP50. Yüzer sökün. Yine tüp tartılır ve bakteryel tanelerin ağırlığını belirler. % 4'lük bir konsantrasyon için M9 tampon (Tablo 1 'de tarif bakınız) pelletini ^(a / _^h). Her bir kısım feromon plaka ⁴ merkezinin üzerine bakteri süspansiyonundan 10 ul. Mağaza plakaları O / N, oda sıcaklığında.
3. Feromon plakalar ⁴ üzerine yetişkinliğe molt sonra 10-15 gebe N2 vahşi tip çift cinsiyetli bir gün seçin. 4 saat için 3 - 25 ° C'de plakalar saklayın.
4. Yetişkin çift cinsiyetli tüm koparmak. Her plaka için bıraktıkları yumurta sayısını kaydedin. Parafilm ile sızdırmaz şekilde kapatılır ve plakaları, 3 gün ¹⁷ boyunca 25 ° C'de geri döner.
5. Dauers yüzdesini Sayısı (Şekil 2). Not: her iki yöntem için, dikkat edilmelidir ki dauers (ve daha az bir exÇadır olmayan dauers) duvarlara tırmanmaya ve Petri yemekler kapağın üzerine olacaktır. Bu nematod için yemeğin tüm yüzeyini incelemek için bu nedenle önemlidir.
6. Bir doz-tepki eğrisi için verilerin Fit ve Şekil 3'te gösterildiği gibi (dauers meydana getirmek üzere hayvanların% 90 uyarılması için yeterli bir feromon) feromonun _EC90 konsantrasyonu tahmin Not:. Normal olarak, AK ₉₀ tahmin etmek için bir lojistik regresyon modeli kullanmak ama farklı istatistiksel yazılım paketi benzer tahminler üretmek alternatif yöntemleri olabilir.

Dauer IL2 Nöronlar 3. Canlı Görüntüleme

1. Adım 2.6 belirlenen AT ₉₀ değerini kullanarak protokolü 2 gibi Dauer feromon tabak hazırlayın.
2. Entegre IL2 muhabiri transgenini taşıyan bir suş (myIs13 [P _klp-6 :: GFP], myIs14 [P _klp-6 :: GFP], myIs16 [P protokol 2'de yöntemleri kullanarak dauers Uyarmaktadır _KLP-6 :: tdTomato] veya qIs56 [P _ara-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21} Not: eq. Is56 kullanılırsa, GFP ifade içine birkaç saat kadar IL2Qs görünür olmayacak Dauer dökücü ve ilk biçimlenme bazı olaylar görünür olmayacaktır. P _ara-2 :: GFP transgenden flüoresan sinyal P _KLP-6 floresan muhabir daha Dauer sırasında IL2s sonuçta parlak iken, ayrıca, _{p-Gecikmeli 2} :: GFP Transgen kası zayıf biçimde ifade eden ince IL2 dalları maskeleyebilir.
3. Yumurtlama izlenerek, ergin hermafrodit bireyler çıkarmak Parafilm ile sızdırmaz plakalar 25 ° C de ¹⁷ 34 saat boyunca inkübe edilir. NOT: Dauer molt için zaman uzunluğu bireyler arasında biraz değişir. Dauer molt başlangıcından itibaren 5 hr (39 - - dendrit arborization en hızlı dönemdir 4 başlıyor 44saat sonrası yumurtlama 25 ° C) ^12,.
4. Görüntüleme bir gün önce, _EC90 konsantrasyonunda Dauer feromonu ile M9 tampon% 10 ihtiva eden bir çözelti ^(ağ _/ hac) agaroz oluşturur. Agaroz kısım yaklaşık 100 ul bir mikroskop lamı üzerine ve hızlı bir şekilde, ancak, hafifçe düz bir yüzey oluşturmak için agaroz üzerine başka bir slayt yerleştirin. Agaroz katılaşmış sonra bir nem odasına (ıslak kağıt havlu ile pipet kutusu), saran sargısına ve mağaza slaytlar sarın.
5. 34 saat kuluçka döneminden sonra, yutak pompalamayı durdurdu nematod için feromon plakaları inceleyin. Ayrı slaytlar bir sürgünün sadece bir yüzü üzerinde agaroz sahip bileşimleri içerir. % 10 agaroz pad ve 0.1 mikron polistiren boncuklar ²² 1 μ l üzerine bir veya daha fazla nematod seçin. Not: iyi senkronize nüfusu ile plaka üzerinde nematodların çoğunluğu L2D gelen Dauer için molt giren edilecektir. Ancak, i arasında değişimi olabilirndividuals. Bu hayvanlar Dauer molt içinde olmuştur süre (örneğin temsili sonuçlar bakınız) miktarını tahmin etmek için ek özellikler (stoma tıkanıklığı, boğaz yeniden şekillenme) dikkat etmek önemlidir.
6. Nematod yönünü (sol / sağ, dorsal / ventral) belirleyin. Mümkün olan en düşük floresan ile 100x büyütmede her 15 dakika bir IL2Q dendritin Z-yığın görüntüleri yakalayabilir veya belirli bir deney için gerektiği gibi. (Yutak pompalama başlar) nematod L2D manikür ayrılmış kadar görüntü yakalamayı devam edin ve hayvan Dauer kurtarır eğer hareketsizlik imkansız ya. Aktif görüntüleme zamanlarda, bir nemlilik bölmesi içinde slayt yerleştirin. NOT: Bir motorlu sahne ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik bir epifluorescent mikroskop kullanıyoruz.

Sonuçlar

Isı, soğuk ve stabil olarak sarı bir sıvı ham Dauer feromon sonuçları (Şekil 1) üretimi. Ham feromon alikotlar aktivitesinde belirgin bir kayıp olmadan, süresiz olarak -20 ° C'de saklanır. Feromonun üretiminin ardından, tekli bir doz-yanıt potens biyolojik tayin, kaba bir tahmin için yeterlidir. 3 kez ve her deneyde bir ortalamasını alın - Bununla birlikte, çoğu deneyleri için bu biyo-analizi tekrar 2 için gereklidir. Iki feromon biyoanalizlere Temsilcisi sonuçları Şekil 3'te verilmişti...

Tartışma

Dauer özgü nöroplastik Dauer ve diğer ilişkili morfolojik değişikliklerin bir inceleme kontrol edilebilir ve her iki genetik mutasyon (örneğin, DAF,-C mutantları) vasıtasıyla veya feromon vahşi tip hayvanların maruz bırakılarak dauers güvenilir oluşturulmasını gerektirir. Dauers ikna etmek için bir genetik mutasyon kullanımı uygun olsa da, bu sonuçlar yanıltabilecek. Bu nedenle Daf-c mutasyonlar ile toplanan veriler daha sonra Dauer feromon maruz Dauer sahne girmek için uyarılan vahşi tip hayvanlar ile...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
N2 C. elegans Bristol suşu	Caenorhabditis Genetik Merkezi
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Schroeder laboratuvarından
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Schroeder laboratuvarı
JK2868'den talep üzerine qIs56[Plag-2:: gfp] V	Caenorhabditis Genetik Merkezi
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetik Merkezi
Petri kapları	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Çeşitli		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g pepton 975 ml H2O otoklavlanmış 55 ° C'ye soğutulmuş; C ve ardından etanolde 1 ml 5 mg / ml kolesterol, 25 ml 1 M KPO4< / sub> tamponu (pH 6.0), 1 ml 1 M CaCl2< / sub>, 1 ml 1 M MgSO4< / sub>
S Media	Çeşitli		S ortamı, S bazal çözeltisinden (1.46 g NaCl, 0.25g K < alt > 2 < / alt >HPO< alt > 4 < / alt >, 1.5 g KH2 < / alt >PO < alt >4< / alt >, etanolde 0.25 ml 5 mg > ml kolesterol ve HO ila 250 ml. Otoklavlanmış.) S bazal çözeltisine 2.5 ml potasyum sitrat pH 6.0 (2 g sitrik asit monohidrat, 29.4 g tri-potasyum sitrat monohidrat, < / alt >H < alt > 2 < / sub>O ila 100 ml, otoklavlanmış), 2.5 ml İz Metal Çözeltisi (1.86 g disodyum EDTA, 0.69 g FeSO< alt >4< / alt> nbsp; &boğa; 7 H2O, 0.2 g MnCl2&boğa; 4 H2O, 0,29 g ZnSO4  &boğa; 7 H2O, 0.025 g CuSO4  &boğa; 5 H < alt > 2 < / alt >O, H < alt >2 < / alt > O ila 1 L Otoklavlanmış ve karanlıkta saklanmış), 0.75 ml 1 M CaCl 2< / alt> ve 0.75 ml 1 M MgSO< alt >4< / alt>.
Doz-yanıt tahlili için Dauer feromon plakaları	Çeşitli		Karışım 0.085 g Noble agar, 0.5 ml 0.513 M NaCl ve 5 &mikro; 6x 15 ml'lik kültür tüplerinin her birinde etanol içinde çözülmüş 5 mg / ml kolesterol. Bir konsantrasyon aralığı oluşturmak için her tüpe yeterli miktarda ham feromon ekleyin. Hacmi 4.725 ml'ye getirmek için H2O ekleyin. Agar eriyene kadar bir Bunsen brülöründe kaynatın ve ardından 55 ° C'ye soğutun. 125 & mikro ekleyin; l 1 M KPO4 tampon (pH 6.0), 50 & l 0.1 M CaCl < alt > 2< / alt >, 50 & mikro; l 0.1 M MgSO4< / sub> ve 50 &mikro; Her tüpe 5 mg / ml streptomisin sülfat. Her tüpün içindekileri 35 mm çapında bir Petri kabına dökün. Agarın gece boyunca oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin (daha uzunsa, aşırı kurumayı önlemek için kapalı bir kapta saklayın).
Mikroküre boncuklar 0.1 mikron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 tampon	Çeşitli		Karışım 3 g KH2< / sub>PO4< / sub>, 6 g Na2< / sub>HPO<>4< / sub>, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4< / sub>, H2O ila 1 litre. Otoklavlama ile sterilize edin

talep üzerine